噬菌体展示技术的原理及在肿瘤治疗中的应用

噬菌体展示技术的原理及在肿瘤治疗中的应用

作者：韩冬 徐煌

来源：《医学信息》2015年第10期

噬菌体展示技术最初是由美国 Missouri 大学的 Smith创建的，是一种噬菌体表面表达及筛选技术[1]。噬菌体展示技术的原理是以噬菌体为载体将外源蛋白的核酸片段克隆至噬菌体衣壳蛋白基因中，以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，用固定化的靶分子筛选与外源蛋白亲和的噬菌体分子，不能结合的噬菌体被洗掉，而能结合的噬菌体被保留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增、富集和筛选[2，3]。本文将概述噬菌体展示技术的基本原理与类型及其在肿瘤治疗中的应用。

1 噬菌体展示技术的类型

1.1 丝状噬菌体展示技术： 丝状噬菌体展示是最早开发的噬菌体展示系统，技术最为成熟，蛋白质借助该系统展示需要经过细胞膜分泌，因此对于难以分泌的蛋白质较难展示，并且该噬菌体衣壳基因的 N 端融合外源蛋白质的容量也有限。丝状噬菌体是单链环状 DNA 病毒，其基因组为6.4 kb，共编码10个不同的蛋白质。在丝状噬菌体的10个蛋白质中，与表面展示有关的蛋白质主要是由基因Ⅲ（ g3） 和基因Ⅷ（ g8） 编码的外壳蛋白gp3和gp8，分别构成 gp3和gp8 展示系统。gp3 和gp8 蛋白的N 端均游离在外，外源蛋白通过柔性接头分别与其N端连接，融合蛋白即可展示外源蛋白的构象。gp3 和 gp8 展示系统的差别在于：①融合外源蛋白大小的能力不同。gp3 可融合较大的外源肽段，大至50kDa 的蛋白质已被成功展示，而 gp8 分子量较小，只能融合较小的外源肽，如五肽或六肽，携带肽段太大会影响外壳的组装。②拷贝数不同，gp8的拷贝数极多，接近3000个，gp3的拷贝数仅3～5个，但可以减少多价结合，故可用于选择高亲和力的配体，制备人工疫苗则选择 gp3 作为融合部位更为合适[4]。 1.2 λ噬菌体展示技术 λ噬菌体是最早使用的克隆载体，其两端为不闭合的线形双链 DNA，末端为长12个核苷酸的互补单链。λ噬菌体展示技术是将外源蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部装饰蛋白D融合而被展示的。与丝状噬菌体比较而言，λ噬菌体表达蛋白是在宿主细胞内组装后再释放而不必通过分泌途径，因此它对展示的肽或蛋白质的大小没有限制。成熟的λ噬菌体颗粒有两个结构单位，即头部D蛋白区域和尾部PV蛋白区域组成，D蛋白是λ噬菌体头部组装必需的蛋白，其分子量为11 kDa，有405个拷贝 [5]。λ噬菌体的尾部蛋白PV为管状结构，分子量为25.8 kDa，有192个拷贝。PV蛋白有两个折叠区域其C端的折叠区域和D蛋白的N端区域可供外源序列插入或替换。这两个基本展示位点均是多拷贝，而且适合展示低亲和力和分子量较大的蛋白质分子，特别适合用于文库的构建[6]。 1.3 T4 噬菌体展示技术 T4噬菌体展示技术是上世纪80代末期建立起来的一种展示技术。性质完全不同的外源蛋白质可展示与T4噬菌体的衣壳蛋白SOC的C端和HOC的N端，是一

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种双展示系统，这两种蛋白质不是T4噬菌体复制所必需的蛋白质，而且借助这两个位点因与噬菌体颗粒的亲和力高表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，因此避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失[7]。T4噬菌体展示的蛋白质常常是在宿主细胞内进行装配，不需通过分泌途径进行分泌，因而对展示的多肽或蛋白质的大小没有太大的限制，其拷贝数高，在分析抗原表位、细胞因子、受体及生物工程学等方面有相当大的应用潜力[8]。但由于其采用的是C 端融合，这对研究蛋白质N 端的功能不适合，而使它在蛋白质生物研究中的应用受到局限[9，10]。 2 噬菌体展示技术的应用

噬菌体展示技术已广泛应用于细胞信号传导、基因表达调控、人源单克隆抗体的制备、药物筛选和疫苗研制等研究领域，近年来其在肿瘤诊断和治疗方面越来越发挥着重要作用[11～14]。

2.1 展示与荧光分子结合的肿瘤相关抗原肽，实现肿瘤组织可视化。通过噬菌体对与荧光分子结合的肿瘤相关蛋白的展示，可以在体实现对肿瘤发生全过程的可视化，为研究肿瘤的发生、发展提供新途径。与过去应用放射性标记抗体来实现肿瘤的可视化相比，应用肿瘤相关抗原肽实现肿瘤的可视化抗原肽分子比抗体小因此的无免疫原性，更容易渗透到组织、更容易扩散、可视性效果更好[15～17]。Dickinson应用生物素将IAGLATPGWSHWLAL这种前列腺癌的相关的15个蛋白质寡肽进行标记并在荧光显微镜下成功的实现了前列腺癌的可视化[18]。Luna在应用CPIEDRPMC这个9个氨基酸的寡肽成功的实现了对HT29、CaCo-2、RKO、SW480和DLD-1五种肿瘤细胞在体肿瘤的可视化[19]。将肿瘤特异性抗原肽与荧光分子结合，不仅可研究肿瘤的发生、发展，由于其上链接有荧光分子在荧光显微镜下观察到肿瘤组织的影像，还可以实现对肿瘤的在体诊断。Konkalmatt以胰腺癌细胞为靶细胞利用噬菌体展示库筛选的特异性六肽，荧光显微结肠镜检查发现经荧光索标记的六肽能与胰腺癌细胞特异性结合而不与正常组织结合，可用于胰腺癌的早期诊断[20]。

2.2 筛选肿瘤差异性抗原肽，用于靶向治疗 通过噬菌体展示技术筛选出正常组织和肿瘤组织差异性抗原肽，从而在体外实现对肿瘤组织和癌症组织的区分。肿瘤细胞表面表达相关的肿瘤抗原，通过噬菌体展示技术可以筛选出与这些抗原结合的配体表位肽，筛选出来的配体肽段与抗体相比特异性更强、亲和力更大，而且这些配体肽段可在体外进行化学合成因此获取的量可远远大于制备抗体的量。这些配体表位肽能够与肿瘤抗原特异性的结合，因此其同抗体一样与肿瘤抗原结合后可诱导肿瘤细胞凋亡及产生ADCC效应发挥其抗肿瘤的作用。目前通过噬菌体展示技术已经筛选出与HER neu、EGFR、Hepsin、Tie2 GRP78、CD21等配体表位肽。这些配体表位肽与肿瘤抗体相比突出特点是能够避免被内皮系细胞吞噬，因此其在肿瘤靶向治疗中将展示出广阔的应用前景[21，22]。

2.3 筛选肿瘤治疗性相关肽，抑制肿瘤生长 通过噬菌体展示技术可以筛选出在肿瘤生长过程发挥促进肿瘤生长的作用的蛋白质，例如促进血管生成的蛋白质、促进肿瘤发生和侵入的蛋白质，而抑制这些肿瘤发展过程对肿瘤生长有促进作用的蛋白质可以抑制肿瘤生长。Joshi报道NPNWGPR可以与腺癌组织特异结合，在体实验证实其可实现抑制肿瘤生长[23]。通过噬菌

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体展示技术筛选的HTMYYHHYQHHL小肽可以结合激酶的受体，研究表明其可70%实现对移植乳腺癌肿瘤的抑制作用，53%抑制肺转移[24]。Roth的研究显示CGNKPTRGC小肽与肿瘤淋巴管结合抑制肿瘤生长[25]。

噬菌体展示技术已被广泛应用于肿瘤抗原表位鉴定、肿瘤抗原抗体库的建立、蛋白分子的相互识别、抗肿瘤药物的研发与筛选、早期癌症的分子影像学诊断和治疗研究等方面，相信该技术将在肿瘤研究中发挥更重要。随着生物学研究对肿瘤靶向蛋白配体的不断探索，肿瘤靶向治疗因其较低的不良反应及良好的疗效，能够明显提高患者的生活质量，代表着肿瘤治疗的未来趋势，将来的肿瘤治疗模式将是以分子生物学诊断为基础的综合性靶向治疗。噬菌体展示肽库技术在多种把向肿瘤多肽配体研究中发挥了重要作用，目前有研究报道：在体外已成功筛选出针对不同肿瘤细胞如肺癌细胞、大肠癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞以及急性髓性自血病细胞等特异性结合肽，这在肿瘤的诊断、靶向治疗等方面具有潜在的临床应用价值。 3展望

噬菌体展示技术是一项新近出现的分子生物学技术，该技术可以将不同的基因型和表现型有效地联系起来，噬菌体展示技术目前已被广泛应用于细胞信号传导、基因表达调控、人源单克隆抗体的制备、药物筛选和疫苗研制以及疾病的诊断和治疗等研究领域。噬菌体展示技术必将成为后基因组时代的功能基因组学和蛋白组学研究的强有力工具。 参考文献：

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