年级专业：14临床输血 学号： 3140704004
姓名：宁立军 组别： 第七组 合作者：牛恺文 黄可秀 朱晋辉
实验室：第六实验室 指导老师：罗军 实验的得分：
一、实验目的
通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段区别和鉴定脓汁标本中和粪便标本中细菌，检测病原微生物，并进行细菌药物敏感性试验。 二、实验器材
1器材
接种环 接种针 打火机 马克笔 酒精灯 电热恒温培养箱 物显微镜 电炉 试管（带棉塞） 称量纸 药勺 牛皮纸 橡皮筋 尺子 锥形瓶 高压蒸汽灭菌器 镊子 玻片 吸水纸
2 试剂药品
普通营养琼脂培养基 蒸馏水 脓汁标本 粪便标本 石蜡油 生理盐水 结晶紫 卢戈碘液 95%乙醇 稀释复红 葡萄糖微量发酵管（2支） 乳糖微量发酵管（2支） 青霉素抗菌素纸片 链霉素抗菌素纸片 庆大霉素抗菌素纸片 兔血浆 福
氏志贺菌诊断血清
三、方法与步骤
1培养基制备
称取一定量的肉汤培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸一次，趁热分装；称取一定量的营养琼脂培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸三次（煮至刚刚冒泡，立刻置于台面，半分钟后再煮），使完全溶解，趁热分装。（平板
培养基：以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固后，平板倒放，4℃冰箱保存备用。斜面培养基：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。）贴上标签后灭菌使用。
2空气与人体体表细菌学检查
根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（CFU），了解空气的污染情况。平板盖打开，
盖朝下放在平板旁，琼脂平板暴露15分钟即可。
在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。
3细菌分离培养
接种前，接种环烧灼灭菌。取标本在平板表面上方密集
涂布5～10 mm²。烧掉接种环上多余的标本。冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）。接种完毕后，接种环烧灼灭菌。将平板倒置37℃培养18～24h,观察结果 。
4细菌的群体生长特性观察和纯化培养
② 观察细菌分离培养物中菌落特征，并记录。
②选取平板上相同的菌落数多的，典型的，容易挑取的单菌落。通过无菌操作轻刮取菌，接种于斜面培养基中。接种完
毕，灼烧接种环，斜面培养基置于37℃培养过夜。
5细菌的个体形态特征的观察
② 斜面培养物的观察
②革兰氏染色：取洁净载玻片，用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上，挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹
匀。待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合，使标本固定，进行染色。结晶紫染液初染1分钟后水洗，芦戈氏碘液媒染一分钟后水洗，95%酒精脱色20-30s，水洗，稀释复红复染一分钟后水洗。待标本晾干后滴加香柏油，油镜下观察。
③通过无菌操作，分别在斜面培养物中挑取菌苔少许，立即移入肉汤培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合语培养基中，混匀。接种完毕，试管口通过火焰2-3次灭菌，塞好棉塞。接种环灼烧后放下。
6细菌的糖发酵实验
通过无菌操作，用灭菌接种针刮取新鲜细菌培养物少许，分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内。将微量管平放在平皿内，37℃培养过夜后观察结果。
7血浆凝固酶实验
取干净玻片一张，在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴，生理盐水1滴。将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌冷却后，取细菌新鲜培养物少许，在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液。用灭菌接种环取细菌悬液1环，或挑取细菌培养物少许，在兔血浆中轻轻抹匀。稍等片刻，观察结果。
8血清学实验
取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清
15ul，用接种环分别取粉红色菌苔，研磨于盐水或血清内，混合均匀。载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。
9半固体穿刺培养
接种针灭菌处理后挑取菌苔少许，垂直刺入半固体培养基中心，可刺达近底管处，但不要到达管底，然后沿原路退出。接种完毕，试管口迅速通过火焰2-3次灭菌，塞好棉塞。接种针灼烧后放下。37℃培养过夜。
10细菌药物敏感性试验
接种环取菌液在平板培养基表面，拉出2条细菌接种线，使呈“十字形”。平板密集划线接种细菌。设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。 四、实验结果及分析
1、空气与人体体表细菌学检查
（1）空气：菌落数：16个，采集地点：厕所。由CFU /m3 ＝
50,000N÷AT ≈86N(直径7cm平板）实验室空气细菌标准。
N：平板上的菌落数，A：平板面积(38.5cm2)，T：采样时间(15分钟)
分析讨论：在课堂上，和其他组比较发现，微生物实验室中空气细菌是比较多的，而厕所反而菌落少，可能是因为实
验室是封闭的，而且人流量大，故而空气中的细菌也就多了，厕所人流量少，反而干净。
（2）人体体表：手指皮肤的细菌学检查我们发现无论是标准还是普通洗手后，平板上菌落的数量与洗手前的是差不多的，甚至还多些，而消毒后的我们组两个同学的没发现菌落，空白对照出有两个同学的都有一个菌苔洗前细菌种类多，洗后细菌种类少。
分析讨论：对于普通洗手的同学来说，由于暂驻细菌未能完全清洗干净，而常驻细菌又暴露了，故洗手后测到的细菌反而多了，对于标准洗手的同学来说，暂驻细菌可能是完全洗净，但暴露的常驻细菌可能与暂驻细菌相当或比之还多，
因此出现该结果。而用碘酒消毒后未发现菌落，说明碘酒消毒可以消毒彻底。而空白对照说明我们手指皮肤上的细菌比
空气中的多。
2细菌分离培养
浓汁标本平板 粪便标本平板
脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、不透明。粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明。淡粉红色菌落半透明。
分析讨论：用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落，显微镜下均为G-杆菌，散在排列。紫黑色金属光泽的产生是因为乳糖被分解产酸，酸使伊红美和蓝紫结合，产生紫黑金属光泽菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈现伊红的颜色。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
3细菌的个体形态特征的观察
G-杆菌 G+球菌
分析讨论：用伊红美蓝平板,从粪便标本分离，获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列。用普通平板，从脓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状。
4细菌的糖发酵实验
分析讨论：粪便标本分离菌糖发酵试验中，紫黑色菌落菌种的葡萄糖和乳糖微量发酵管都为黄色，有气体产生；粉红色菌落菌种的葡萄糖微量发酵管为黄色，不产气，乳糖微量发酵管无明显变化。
5血浆凝固酶实验
脓汁标本分离菌血浆凝固酶实验中，黄色菌种菌液出现明显凝块，实验结果为阳性；白色菌种未出现凝集反应，实验结果为阴性。
分析讨论：通过血浆凝固酶实验，黄色菌种实验结果为阳性，为致病菌。
6血清学实验
玻片凝集试验中，粉红色菌落菌种在福氏志贺菌诊断血清中出现片状凝集现象，实验结果为阳性；而在生理盐水中未出现凝集现象。
分析讨论：通过血清学实验，粉红色菌落菌种与福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应，确定其为福氏志贺菌。
7半固体穿刺培养
半固体培养基中，紫黑色菌落菌种扩散生长，培养基呈扩散云雾混沌状态；粉红色菌落菌种沿穿刺线生长，穿刺线边缘整齐，周围培养基清澈透明。
分析讨论：半固体动力试验表明紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性，有鞭毛；粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性，无鞭毛。
8细菌药物敏感性试验
白色细菌平板 黄色细菌平板
粉红色菌种平板 紫黑色菌种平板
各菌落抑菌圈直径
黄色菌种 白色菌种 紫黑色菌种 粉红色菌种 青霉素 42mm 30mm 无作用 无作用 头孢曲松 25mm 22mm 37mm 36mm 庆大霉素 30mm 40mm 26mm 38mm
分析讨论：由于青霉素针对的是革兰氏阳性细菌，因此对白色菌落和黄色菌落是高度敏感的，而头孢曲松和庆大霉素都是广谱抗生素，对革兰氏阴性和阳性细菌都较为敏感，因此对四种菌落都有较好的抑菌作用，这也说明我们不能单从这些细菌的抗药敏性实验中得出细菌的种属，应结合多个生化反应进行判断。
五、实验综合讨论
1、用普通平板，从脓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块。通过血浆凝固酶实验，金黄色葡萄球菌实验结果阳性，为致病菌。
用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落，显微镜下均为G-杆菌，散在排列。紫黑色金属光泽的产生是因为乳糖被分解产酸，酸使伊红美和蓝紫结合，产生紫黑金属光泽菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈现伊红的颜色。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验（紫黑色菌落菌种分解葡萄糖和乳糖，产酸产气；粉红色菌落菌种只能分解葡萄糖，产酸不产气）半固体动力试验（紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性，有鞭毛；粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性，无鞭毛）。对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，判定它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。通过血清学实验，粉红色菌落菌种与福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应，进一步确定其为福氏志贺菌。
肠道杆菌科各菌属生化反应鉴别表
埃希菌属 志贺菌属 沙门菌属 霍乱弧菌 变形杆菌属 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 半固体 ⊕ + ⊕/+ + ⊕ ⊕ √ - - - ⊕ √ ⊕ + √ ⊕ +/- ⊕ + - √ -/+ - + √ + - + + +
注： + 产酸或阳性， ⊕ 产酸产气，- 阴性，+/- 多数阳性， -/+ 多数阴性 √ 不确定。
常见肠道感染细菌主要生化反应特征
大肠埃希菌 福氏志贺菌 伤寒沙门菌 霍乱弧菌 幽门螺杆菌 变形杆菌
葡萄糖 乳糖 半固体 ⊕ + + + 不分解糖类 ⊕ — — — + — + + + ⊕ — + 2、对照常用药敏试验纸片判断标准，金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素、庆大霉素、链霉素均敏感。大肠埃希菌对青霉素耐药，庆大霉素、链霉素敏感，福氏志贺菌
对青霉素耐药，对庆大霉素、链霉素敏感。可得结论G+球菌对青霉素和链霉素敏感。 G-杆菌对青霉素耐药，对链霉素敏感。G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。
常用药敏试验纸片判断标准
抑菌圈直径(mm) 抗菌药物 纸片含药量 耐药 青霉素G(葡萄球菌) 链霉素 庆大霉素 四环素 氯霉素 磺胺
10单位 10微克 10微克 30微克 30微克 300微克 ≤28 ≤11 ≤12 ≤14 ≤12 ≤12 中度敏感 — 12～14 13～14 15～18 13～17 13～16 敏感 ≥29 ≥15 ≥15 ≥19 ≥18 ≥17 结果：综上所述，脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌；粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌，粉红菌落为福氏志贺菌，致病菌为福氏志贺菌。
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