质粒电泳

碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。

在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：

共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋

开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子

线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖

5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0)

10mmol/L EDTA(PH8.0)

溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH

2% SDS

使用前新鲜配制

溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL

冰醋酸11.5 mL

水28.5 mL

RNase A酶：将粉末溶于10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL中，配成10 mg/mL

浓度的酶液，于100℃水浴加热15 min，缓慢冷却至室温，-20℃保存

氯仿

无水乙醇

碱法质粒抽提用到三种溶液，溶液I：50 mM葡萄糖 、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾 、 2 M 醋酸。

1、溶液I的作用 对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tr is-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。

2、溶液II的作用 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细

胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

3、溶液III的作用 SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于 100 kb的片断，就不容易与 PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。

4、酚/氯仿/异戊醇的作用 PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀，酚可以使蛋白质变性，作用大于氯仿，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。异戊醇的添加，主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。

质粒抽提原理：SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以

及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出

来。

质粒提取的影响因素之一：培养时间---从固体培养基平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（含有相关抗生素的液体培养基中），振荡培养12-16小时。不应超过16小时，

因为这时细胞开始裂解，使得质粒的得率降低，也会导致质粒丢失或质粒变异。

琼脂糖电泳:判断样品DNA条带大小方法---与marker跑出的多条条带进行比较后得出结论，比如，若样品条带与marker 200bp的条带一致，则样品条带大小为200bp。至于样品浓度的判断---若肉眼观测条带的亮度，不刺眼也不吃力，则约为50ng，那么，样

品浓度就是50ng/加入的样品量。

浓度判断：核酸因含有共轭的苯环而吸收紫外光，最大紫外光吸收波长为260nm。260nm光吸收值为1（A260=1），dsDNA的质量浓度相当于50ug/ml，ssDNA或RNA的质量浓度相当于40ug/ml，则dsDNA的浓度为：测得的A260 x 50ug/ml x 稀释倍数。

纯度判断：纯dsDNA的A260/A280 约为1.8.，纯RNA的约为2.0. 如果DNA样

品的大于1.8，则说明有RNA污染；若小于1.8，说明有蛋白质污染。

本实验室分光光度计OD值（无论波长）在1.00以下时，准确；大于1.00，就不准

确了。

质粒鉴定与评价：

琼脂糖电泳检测

碱裂解法提取的质粒经琼脂糖电泳进行鉴定时，理想状况是只出现超螺旋—条带，但在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等原因，使质粒DNA链发生断裂，可能出现两条带或者出现三条带，这三条带电泳迁移率从快到慢，分别是：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂） 。如果加溶液Ⅱ后过度振荡，会在远离这三条带的位置出现条带，这条带泳动得较慢，是大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候提取的质粒会出现4个以上的条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。但是，只要质粒经单酶切鉴定后，只有单一条带，就证明没有基因组的污染。