上海汉尼生物技术有限公司MA/6含菌量测试方法说明第一步：任意选择同批里的四支做计数用。第二步：将MagnaAmp放入250mL的无菌玻璃瓶里。第三步：用无菌的不锈钢棒将MagnaAmp捣碎。注意：确保安瓿要足够碎，安瓿的上面较窄的部分和下面较宽的部分都要被捣碎。1上海汉尼生物技术有限公司第四步：往装MagnaAmp的瓶子里加入95.2mL无菌水，顺便冲洗刚才使用的不锈钢棒。注意：确保加入正确体积的无菌水，并冲洗用于捣碎的工具。（MA每一支安瓿的孢子悬液体积1.2ml、4支安瓿瓶总体积为4.8ml、加入95.2ml的水使得总体积达到100ml）第五步：振荡玻璃瓶至少1分钟，使液体混合均匀。注意：MesaLabs使用的涡旋振荡仪是VortexGenie2，60Hz2上海汉尼生物技术有限公司第六步：在超声破碎前将溶液放置5分钟使气泡散出来。然后在46-60kHz下超声5分钟。刚振动之后放置5分钟后注意：Mesa使用的超声处理器是Cole-Parmerultrasoniccleaner,型号08849-00，55KHz。如果您的超声清洗机的输出功率较低，超声时间可以增加，如果输出功率较高，超声时间可以适当降低。超声是非常重要的，它能将粘附于玻璃上的孢子洗下来，样品中的气泡会降低超声的效果。在超声时，玻璃瓶不要接触超声洗浴的底部和四边，否则会降低超声的效力。可以通过试验确定超声时间，因为太多声波能量会最终损坏孢子。第七步：振荡溶液约10秒，振荡后立即吸取10mL溶液至一19.5x145mm平底试管中准备热击。第八步：在已预热至所需温度的水浴中热击包含了10毫升溶液的管子至合适时间。将管子取出置于冰浴（0℃到4℃）中5分钟。注意：确保水浴是在正确的温度范围里，热击管放到水浴中立即开始计时。热击时间一到立即将热击管放入冰浴中立即冷却。热击的目的：1：杀死可能残留在产品中的营养细胞，以便测定到具有抗性的芽孢的数量.。2激活处于休眠状态的芽孢，以便它们能够在TSA上生长。冷却的目的：避免的额外的热量损害芽孢。如果没有冷却，孢子热暴露（接近热击温度）的时间，嗜热脂肪芽孢杆菌是喜热的，可能不会受到影响；但是枯草芽孢杆菌会受到影响。孢子种类嗜热脂肪芽孢杆菌孢子MA热击温度95-100℃热击时间15分钟3上海汉尼生物技术有限公司第九步：热击试管做梯度稀释。注意：在漩涡振荡后立刻转移每一稀释液非常重要。转移前漩涡震荡热击试管至少10秒钟，以避免悬浮液产生沉淀。以含菌量数量级为106为例。使用一支1ml的吸液管，转移1ml到含有9ml无菌纯化水的稀释管中，并冲洗移液管，漩涡震荡稀释试管至少10秒钟。同样使用1ml吸液管转移1ml以上稀释液到第二支含有9ml无菌纯化水的稀释管中（再一次重复以上步骤），漩涡震荡试管至少10秒钟。将最后一支试管震荡10秒钟，使用2ml吸液管移取2ml，释放1ml稀释液到每个15×100mm的平板上。倾注大约20ml融化后冷却到45-50℃的TSA培养基到平板里。对准稀释液倒培养基，旋转平板以确保混合均匀，等待琼脂凝固。不要使用融化后放置了超过8个小时的琼脂。从热击管，重复以上系列稀释。注意：倾倒时，培养基不要过热。败已热击注意：培养基对于孢子复苏率有极大影响，Mesa使用的是BectonDickinson生产的DifcoTSA培养基。（培养基对于孢子的复苏率的影响是极大的，实验确认过，使用Merck的培养基，在培养20小时，拿出平板观看，发现其复苏率只有BD培养基的复苏率的三分之一）不要使用磷酸盐缓冲液，林格液或者生理盐水作为稀释液。含有磷酸盐成分（di-phosphates）的培养基会导致低的复苏率，因此Mesa推荐使用不含任何磷酸盐成分的培养基。此外，也不推荐使用其他培养基如马铃薯葡萄糖琼脂，会降低恢复率。Mesa推荐使用Acumedia和Difco的TSA。4上海汉尼生物技术有限公司第十步：培养平板凝固后倒置平板根据培养条件进行培养（见下表）。培养48小时后，将平板从培养箱中移出并计数，生长菌落数应在30-300CFU之间。计数取平均值乘以稀释倍数，这个值一定能够被4整除。计算公式为：平板计数平均值CFU×1/稀释因子例：如果含菌量数量级为106，若稀释因子应该是10-5.假如平板生长菌落的平均值为80CFU，则分析样品的平均含菌量为：80CFU×1/10-5=80×105=8000000=8×106/4个安瓿=2×106/1个安瓿注意:如果恢复率不在说明书指定值的50%,+300%范围内，需检查操作中可能的错误。如果平板之间的差距大于30个菌落数的话，重新检验所使用的方法。5