doi:10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2021.08.052AnalysisandTesting分析检测LC-MS/MS法测草甘膦及其 代谢物实验条件研究Study on the Experimental Conditions for the Determination of Glyphosate and Its Metabolites by Lc-Ms/Ms◎ 聂荣荣（梅州市食品药品监督检验所，广东 梅州 514000）(Meizhou Supervision and Testing Institute for Food and Drug Control , Meizhou 514000, China)NIE Rongrong摘 要：研究LC-MS/MS测定草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的实验条件，在柱流速0.1 mL·min-1，雾化器氮气流速1.5 L·min-1，DL管温度200 ℃，负离子扫描模式，干燥气氮气流速3 L·min-1，加热模块温度400 ℃，柱温40 ℃，流动相B（0.1%氨水）∶A（乙腈）为80∶20，Atlantis T3色谱柱实验条件下出峰效果好，响应强。该方法相对标准偏差为4.8%，草甘膦和氨甲基膦酸在0.2～1.0 μg·mL-1线性关系良好，相关系数R2大于0.997，检出限为0.07 mg·kg-1，可达到草甘膦及氨甲基膦酸检测要求。关键词：草甘膦；氨甲基膦酸；液相色谱串联质谱；非衍生；仪器条件Abstract：To study the experimental conditions for the determination of glyphosate and its metabolite aminomethylphosphonic acid by LC-MS/MS, the column flow rate was 0.1 mL·min-1, the atomizer nitrogen flow rate was 1.5 L·min-1, and the DL tube temperature was 200 ℃, Negative ion scanning mode, dry gas nitrogen flow rate 3 L·min-1, Atlantis T3 column experiment under the conditions, the peaking effect is good and the response is strong. The relative standard deviation of this method is 4.8%, the linear relationship between glyphosate and aminomethylphosphonic acid is can reach Glyphosate and aminomethyl phosphonic acid testing requirements.中图分类号：O657.7heating module temperature 400 ℃, column temperature 40 ℃, mobile phase B (0.1% ammonia)∶A (acetonitrile) 80∶20, good at 0.2～1.0 μg·mL-1, the correlation coefficient R2 is greater than 0.997, and the detection limit is 0.07 mg·kg-1, which Keyword：glyphosate; aminomethylphosphonic acid; LC-MS/MS; non-derivatization; instrument condition草甘膦，世界各国主要使用的除草剂之一。很多学者研究发现，草甘膦使用地区周围水体中存在草甘膦及其衍生物氨甲基膦酸残留[1-3]，也有在动物的尿液中检测到草甘膦残留[4]。虽然草甘膦是否致癌还存在争议[5-6]，但MARTINEZ等人研究表明高剂量的草甘膦摄入可能导致神经损伤[7]。目前草甘膦的检测主要通过衍生后上机检测，过程相对较复杂。本项目致力于通过液相色谱串联质谱仪开发一种不需要衍生的草甘膦检测方法。1 材料与方法1.1 材料与试剂草甘膦、氨甲基膦酸标准品，购自农业部环境保护科研监测所；乙腈，色谱纯，购自Anaqua chemical 作者简介：聂荣荣(1988—)，女，硕士，工程师；研究方向为食品农产品检测。XIANDAISHIPIN现代食品/183分析检测Analysis and Testingsupply；甲酸，色谱纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；氨水，优级纯，购自国药集团化学试剂有限公司。1.2 仪器与设备LCMS-8040高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（配电喷雾离子源ESI及LCMS solution 3.2）、AUW220型电子分析天平，岛津公司。1.3 仪器条件优化Atlantis T3（2.1 mm×150 mm，3 μm）色谱柱；流速0.1 mL·min-1；质谱条件：采用电喷雾离子源；负离子扫描；多反应监测扫描模式；雾化气：氮气 1.5 L·min-1；干燥气：氮气3 L·min-1；碰撞气：氩气； DL温度：200 ℃；加热模块温度：400 ℃，柱温40 ℃。2 结果与分析2.1 质谱参数优化选择负离子模式，依次将草甘膦、氨甲基膦酸的标准溶液（1 μg·mL-1）直接注入MS中，进行一级质谱扫描，得到草甘膦、氨甲基膦酸m/z分别为168.05、109.95的[M-H]-离子，将这些分子离子峰选作前体离子进行二级质谱扫描，得到二级质谱信息，选取响应强度高、干扰小的两对离子作为定量离子和定性离子，优化的MS/MS参数如表1所示。表1 草甘膦及其代谢产物氨甲基膦酸质谱参数表名称草甘膦氨甲基膦酸前体离子（m/z）168.05109.95产物离子（m/z）15062.978.9562.95Q1 PreBias/V18.019.018.011.0CE/V12.022.025.022.0Q3 PreBias/V13.022.013.023.02.2 流动相的确定考察了不同流动相，组合1：B（5 mmol·L-1乙酸铵含0.10%氨水）和A（乙腈）；组合2：B（0.2%甲酸水：乙腈）和A（乙腈）；组合3：B（0.1%氨水）和A（乙腈）；对草甘膦、氨甲基膦酸峰形和响应强度的影响。结果表明，组合3作流动相时的响应强度最高。2.3 流动相体积比的确定分析比较了流动相中乙腈体积分数为5%、10%、15%、20%和25%时，草甘膦和氨甲基膦酸的响应情况。结果表明，当流动相中乙腈体积分数为20%，B（0.1%氨水）∶A（乙腈）为80∶20时峰高最高，响应最好。2.4 色谱柱的选择比较了在T3柱、C18柱两种液相色谱柱上草甘(x100,000)1:草甘膦 TIC(-)2:草甘膦 168.05>150.00(-) CE: 12.03:草甘膦 168.05>62.90(-) CE: 22.05.0峰值32.52膦和氨甲基膦酸的响应情况。结果表明，草甘膦和氨甲基膦酸在T3柱上峰形好，柱效高。因此最终选择该色谱柱作分析柱。2.5 雾化气流速的选择分析了流速为0.5 L·min-1、1 L·min-1、1.5 L·min-1、2 L·min-1、2.5 L·min-1和3 L·min-1时草甘膦和氨甲基膦酸的响应情况，结果表明，雾化气流速1.5 L·min-1时效果最佳。2.6 DL管温度的优化对比了DL管温度100 ℃、150 ℃、200 ℃、300 ℃ 时草甘膦和氨甲基膦酸的响应情况，结果表明，DL管 温度200 ℃时化合物相应强度最强。草甘膦及氨甲基膦酸色谱图如图1、图2所示。7.510.00.51.01.52.02.53.03.5时间/min4.04.55.05.56.06.5图1 草甘膦色谱图184/现代食品XIANDAISHIPIN3.53.02.5峰值2.01.51.00.50.00.00.51.01.52.02.53.03.5时间/min4.032(x100,000)1:氨甲基膦酸 TIC(-)2:氨甲基膦酸 109.95>78.95(-) CE: 25.03:氨甲基膦酸 109.95>62.95(-) CE: 22.01AnalysisandTesting分析检测4.55.05.56.06.5图2 氨甲基磷酸色谱图2.7 线性范围、检出限和精密度配制0.20 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1、0.60 μg·mL-1、 0.80 μg·mL-1和1.00 μg·mL-1的混合标准工作溶液上机测试，以峰面积y为纵坐标，以浓度x（μg·mL-1）为横坐标绘制标准曲线，草甘膦和氨甲基膦酸在0.20～1.00 μg·mL-1线性关系良好，相关系数R2大于0.997，线性方程为y=671 589x。以3倍最低浓度比信噪比（S/N）计算检出限，草甘膦和氨甲基膦酸检出限为0.07 mg·kg-1。6次平行测定结果计算相对标准偏差（RSD），得方法精密度RSD为4.8%。et al.Determination of glyphosate, AMPA and glufosinate in dairy farm water from Argentina using a simplified UHPLC-MS/MS method[J].Science of the Total Environment，2018，645（34）：34-43.[3]CARLES L，GARDON H，JOSEPH L，et al.Meta-analysis of glyphosate contamination in surface waters and dissipation by biofilms[J].Envieonment International，2019，124：284-293.[4]KARTHIKRAJ R，KANNAN K.Widespread occurrence of glyphosate in urine from pet dogs and cats in New York State, USA[J].Science of the Total Environment，2019，659：790-795.[5]CENTNER T J，RUSSELL L，MAYS M.Viewing evidence of harm accompanying uses of glyphosate-based herbicides under US legal requirements[J].Science of the Total Environment，2019，648：609-617.[6]GILLEZEAU C，GERWEN M V，SHAFFER R M，et al.The evidence of human exposure to glyphosate: a review[J].Environmental Health，2019，18（1）：2.[7]MARTINEZ A，AL-AHMAD A J.Effects of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid on an isogeneic model of the human blood-brain barrier[J].Toxicology Letters，2019，304：39-49.3 结论本实验优化了LC-MS/MS法测定草甘膦及氨甲基膦酸在不衍生情况下的实验条件，优化后该方法出峰效果好，相对标准偏差为4.8%，草甘膦和氨甲基膦酸在0.20～1.00 μg·mL-1范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.997，检出限为0.07 mg·kg-1，可达到草甘膦及氨甲基膦酸检测要求。参考文献[1]FERNANDES G，APARICIO V C，Bastos M C，et al.Indiscriminate use of glyphosate impregnates river epilithic biofilms in southern Brazil[J].Science of the Total Environment，2019，651：1377-1387.[2]DEMONTE L D，MICHLIG N，GAGGIOTTI M，勤俭节约，珍爱生命。XIANDAISHIPIN现代食品/185