仪器分析实验 教案
实验题目：高效液相色谱法测定 饮料中的苯甲酸 教学目标： 1、了解高效液相色谱仪的基本结构及操作步骤。 2、理解反相色谱的原理及应用。 3、学习物质分离的条件选择。 4、学习物质的定性和定量分析方法 教学重点： 掌握物质分离操作条件的选择方法。 教学难点： 了解高效液相色谱仪的基本结构及操作步骤。 仪器药品： LC-2010高效液相色谱仪；色谱柱VP-ODS（4.6mm×15cm）；微量注射器；超声处理器；高纯水；甲醇（AR）；苯甲酸（AR）；磷酸二氢钾（AR）。 教学方法： 讲授、演示 教学时数： 4学时 教学过程： （教师授课思路、设问及讲解要点） 一、实验原理 高效液相色谱法的原理与气相色谱法相似，但以液体为流动相，适合于分析高沸点的有机化合物、高分子、热稳定性比较差以及具有生物活性的物质。 苯甲酸具有抑制细菌生长和繁殖的作用，广泛应用于食品工业中作为防腐剂。但是苯甲酸的过量摄入，可对人们的健康造成危害：如苯甲酸进入人体后，
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在肝脏内与甘氨酸结合，代谢成马尿酸由尿排出，对肝脏造成一定的损害；同时口服过多的苯甲酸，在体内积蓄过多会对身体造成一定的危害。国家限定碳酸饮料中苯甲酸的浓度不得超过0.07mg/ml,由于苯甲酸价格低廉在食品工业中得到广泛的应用，因此有必要学习苯甲酸的高效液相色谱法分离分析的操作方法、分离条件的选择以及定性和定量的分析方法。 苯甲酸易溶于甲醇等有机溶剂，略溶于水，因此苯甲酸为极性化合物，可以用甲醇与水的混和流动相进行色谱分离分析；同时苯甲酸为弱酸性化合物，在水中存在部分电离。因此正确选择流动相的极性和缓冲流动相合适的PH 是决定分离好坏的关键。当采用甲醇与水作流动相时，甲醇和水的比例不同时，流动相的极性得到改变，苯甲酸的峰形以及保留时间都有所改变，同时缓冲流动相合适的PH 值可以改变峰的对称性以及解决拖尾现象，达到分离苯甲酸的目的，并可对分析情况作出正确的评价。 检测器是检测采集被分离分析物质的重要因素。一个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所检测的物质具有快速的响应，并且响应对流动相流量和温度变化不敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽，适用的范围广。对于紫外检测器而言，应要求被分离分析的物质在紫外检测波长范围内有吸收，同时要求流动相在紫外区无吸收。由于苯甲酸的在230nm波长处有紫外吸收，同时甲醇和水所组成的混合流动相在该波长处无吸收，因此紫外检测器选择在230nm波长进行检测。 液相色谱分离分析一般在室温下进行，因此柱温的选择不作为重点考虑的因素。 1、定性分析：在确定的色谱分离条件下，苯甲
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酸有一定的保留时间，在相同的实验条件下，分别测定苯甲酸纯物质和饮料样品中各组分的保留值，将两者进行对比，就可确定饮料中何种组分为苯甲酸，对其进行定性。 2、定量分析：由于不同饮料样品中苯甲酸的含量不同，其峰面积也不相同，因此可以利用峰面积与含量的对应关系，计算饮料样品中苯甲酸的含量。即先配制标准浓度的苯甲酸,定量进样，由被测组分和标准组分的峰面积比来求得被测组分的浓度。计算公式下： 式（1）中：Ci为样品浓度，mg/ml; Cs为标准品浓度，mg/ml； Ai为样品峰面积； As为标准品峰面积。 二、高效液相色谱仪的组成 高效液相色谱仪由贮液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理器。 三、仪器与试剂 1、仪器 LC-2010高效液相色谱仪；色谱柱VP-ODS（4.6mm×15cm）；超声处理器；微量注射器。 2、试剂 高纯水（或二次蒸馏水）；甲醇（AR），苯甲酸（AR）；磷酸二氢钾（AR） 。 四、实验步骤 CiAiAsCs
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1、按操作说明书使色谱仪正常运行，并将实验条件调节如下： 柱温：40℃；流动相的组成：甲醇：水（0.05mol/L的磷酸二氢钾，PH=3.5）=75：25；流量：1.0 ml/min；紫外检测器波长：230 nm。 2、标准溶液配制与处理：准确称取0.1g干燥的苯甲酸，用无水甲醇溶解于50ml的烧杯里，再转移至100ml容量瓶中，定容，得到浓度为1mg/ml的苯甲酸甲醇溶液。再将1mg/ml的苯甲酸甲醇溶液稀释10倍，得到浓度为0.10mg/ml的苯甲酸甲醇溶液，用尼龙滤头过滤，除掉溶液中的悬浮机械杂质，同时把苯甲酸甲醇溶液注入样品瓶中，待用。 3、样品处理： 取约20ml的碳酸饮料于干净的小烧杯中，在超声处理器中超声处理5 min，同样纤维素滤头过滤，把样品注入样品瓶中，待用。 4、待基线平直后，注入苯甲酸溶液和饮料样品溶液各5.0μL，各做三次，分别记下苯甲酸的保留时间。实验完毕，用甲醇冲洗干净色谱柱。 5、再改变流动相甲醇和水的比例为65：35,50：50，待基线平直后，再分别进样苯甲酸溶液5.0μL，考察苯甲酸的分离情况。 6、实验结束时，先后用水和甲醇冲洗干净色谱柱，按要求关好仪器。 五、结果与处理 1、指出苯甲酸在样品色谱图中的位置。 根据苯甲酸样品在色谱图上的保留值，对的苯甲酸进行定性分析。 2、苯甲酸分离情况的分析。
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根据苯甲酸的峰形对苯甲酸的分离情况进行分析，探讨合适的苯甲酸液相色谱分离条件。 3、根据苯甲酸样品和饮料样品中苯甲酸的峰面积，计算饮料样品中苯甲酸的含量。 六、注意事项 1、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。 2、为获得良好的结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。 3、实验完毕后，应依次用水和甲醇冲洗干净色谱柱。 七、思考题 1、根据苯甲酸的结构式，苯甲酸能用离子色谱法分析吗？为什么？ 2、如何对苯甲酸进行定性和定量分析，方法有哪些？ 3、流动相不同比例的改变对分离结果有什么影响？原因何在？ 4、饮料为什么需要进行超声处理，原因何在？ 5、实验之前的流动相应该如何处理，为什么？ 八、教学后记
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