实验三 动物细胞培养用液的配制

一、实验目的

1.了解细胞培养常用培养液和试剂配制的基本方法。 2.初步掌握高压灭菌和抽滤灭菌的方法。. 二、器材与试剂：

RPMI-1640干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.蒸馏水、电子天平、PH计、磁力搅拌器、5.6%的NaHCO3 三、实验原理

动物细胞培养常用液有平衡盐溶液、培养基(天然和合成)及消化液等。配制这些常用液有严格的要求：

(1)使用高纯化的三蒸水。

(2)按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水中。

(3)保证各组分完全溶解。 (4)进行pH值测试和调整。

(5)消毒分装小瓶，抽样做无菌实验，保证用液无菌。 四、具体步骤： 1、酚红（0.1%）

配法：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。 2、Hanks平衡盐溶液。

（Hanks液是常见的平衡盐溶液（BSS）之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。） 1.按表称取Hanks、D-Hanks试剂。

表13-2 D-Hanks试剂的配制

成 份 CaCl2 KCl KH2PO4 MgCl2·6H2O MgSO4·7H2O

NaCl NaHCO3 Na2HPO4·12H2O Na2HPO4·7H2O

D-葡萄糖 酚红（0.1%）

Hanks 0.140 0.400 0.060 0.100 0.100 8.000 0.350 － 0.090 1.000 1mL

D-Hanks － 0.400 － － － 8.000 0.350 0.132 － 1.000 1mL

2.依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中，溶解后定容至1000mL。 3.高压灭菌，10磅10min。 注意事项

1.BSS的pH值应确定为7.2左右。

2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。 3、细胞消化液：0.25％胰蛋白酶液

1.称取0.25g胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL 2.滤过除菌，调pH值7.4，-20℃冻存。 4、10000单位／ml硫酸链霉素、青霉素G钾盐的配制

硫酸链霉素 1g 青霉素G钾盐 100万单位

将上述两种药品溶于100mL生理盐水中，然后灭菌（过0.45μm的滤膜），分装于青瓶中放－20℃保存。使用时可按100单位／mL稀释。 5、胎牛血清

市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体（近来也有观点认为热灭活处理是不必要的）。

1.将血清加热至56℃并保持30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 2.处理后的血清贮存于4℃。 6、RPMI 1640培养液（基本培养基）

① 配1升RPMI1640培养液的粉末(1袋)+2gNaHCO3。 ② 溶于800mL蒸馏水中充分搅匀。 ③ 用HCl调节PH7.2-7.4。 ④ 用蒸馏水补足1L。

⑤ 用灭过菌的滤器过滤（用φ0.45或0.20μm滤膜）。 ⑥ 用灭过菌的瓶分装（学生实验）100ml/瓶。

RPMI 1640完全培养基按如下比例配制：基本培养基占90%，小牛血清占10%。按1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。 五、思考题

1.任何保证胰蛋白酶的活性 2.Hanks与D-Hanks的区别