1、发酵和发酵工程的概念 发酵狭义：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。
发酵广义：凡是培养细胞（动、植物和微生物细胞）来制得产品的过程。 发酵工程：利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系。具体地说它是研究发酵工业生产过程中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学。
2、发酵工程研究的内容 发酵工业用生产菌种的选育
◆自然选育 ◆诱变育种 ◆基因工程育种 发酵条件的优化与控制 生物反应器的设计
发酵产物的分离、提取和精制
3、按不同分类方法，发酵可分为哪些类型？
按发酵过程中培养基的状态,可将发酵分为:固态发酵和液态发酵；按发酵过程中需氧与否，可将发酵分为:厌氧发酵和通风发酵；按不同发酵工艺，液态深层发酵可分为： 分批发酵、分批补料发酵和连续发酵。
4、分批发酵，分批补料发酵和连续发酵三种发酵类型定义及优缺点 分批发酵
在生物反应器内投入限量培养基后，接入微生物菌种进行培养，完成一个生长周期，获得产品的微生物培养方法。 补料分批发酵
在发酵的开始投入一定量的培养基，在发酵过程的适当时期，开始连续补加碳或（和）氮源或（和）其他必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一次放出。 连续发酵
在向反应器中添加培养基的同时，从容器中放出等体积的培养液，就可以形成一个生产细胞的连续过程，即在培养器中所形成的新细胞数量与从容器中流失的细胞数目相等。
5、分批发酵工艺过程的主要步骤 1）原料预处理。
2）用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制。 3）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌。 4）无菌空气的制备。
5）微生物菌种制备和扩大培养，并以一定比例将菌种转接到发酵罐中。
6）控制合适的微生物生长和发酵条件，使微生物生长并形成大量的代谢产物。 7）发酵产物分离、提取与精制，以得到合格的产品。 8）成品检查与包装。
9）回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。
1、发酵工业常用的微生物的种类及其主要的发酵产品 细菌：
1、枯草杆菌与中性蛋白酶和α-淀粉酶； 2、乳酸杆菌、双歧杆菌与酸奶、微生态剂； 3、醋酸杆菌与醋酸； 4、棒状杆菌与谷氨酸 放线菌：
目前应用于临床的由放线菌产生的抗生素主要有：链霉素、卡那霉素、新霉素、四环素 酵母菌：
提取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等；同时，还可用作食用、药用和饲料用酵母。 霉菌：
根霉、毛霉、曲霉、青霉
2、菌种、菌种分离与筛选的概念
发酵工业所用微生物称为菌种。只有具备了优良的菌种，通过改进发酵及提纯工艺条件和生产设备，才能获得理想的发酵产品。
菌株分离就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取快速、准确、有效的方法进行分离(separation) 、筛选(screening)，进而得到所需微生物菌株的过程。
3、微生物纯种分离方法有哪些？
固体稀释平皿倾注法、涂布分离法、平板划线分离法、单细胞挑取法 4、从自然界中分离和筛选微生物菌种的步骤
1.定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2.采样：有针对性地采集样品。
3.增殖目标菌：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。
4.分离：利用分离技术得到纯种。
5.发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
5、诱变育种的步骤和注意事项。 步骤：
1）出发菌株的选择
2）单细胞（或单孢子）悬液制备 3）诱变剂和使用剂量的选择 4）变异株的初筛 5）变异株的复筛 6）变异株稳定性试验 7）菌种特性考察 8）中试验证 9）大型投产试验
6、原生质体融合定义及主要步骤
用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和钎维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合。
①标记菌株的筛选:营养缺陷型和抗药性标记 ②原生质体的制备：脱壁酶脱壁
③原生质体的融合：聚乙二醇促进融合 ④原生质体的再生：再生培养基培养再生壁 ⑤融合子的选择：选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 ⑥生产性能筛选。
7、试述柠檬酸菌种分离和诱变育种的主要过程 （一）从土壤中筛选产柠檬酸的黑曲霉菌株 1、查阅资料，确定筛选产柠檬酸的菌种种类 2、采集样品：取霉腐土层，筛选黑曲霉菌株。 3、选择合适的培养和纯种分离的方法： 固体稀释平皿倾注法分离土壤中的黑曲霉，在平板培养基中添加抗生素和碳酸钙，待培养长出菌落后，挑取透明圈大的菌落于斜面。
3、挑选产酸的单菌落斜面菌种，进行生产性能的测定：确定所筛选的黑曲霉菌株产的是柠檬酸。
（二）菌种的诱变育种
1、将黑曲霉接种于斜面活化；
2、制备出发菌孢子悬液并进行活菌计数； 3、诱变剂处理：
可先单一，后复合处理：
1）物理因子：紫外线诱变和γ射线诱变处理； 2）化学因子：硫酸二乙酯、亚硝基胍处理；
3、用加碳酸钙的平板分离诱变处理后的孢子，待菌落长出后，挑取平板上透明圈较大的单菌落200个于斜面培养基，300C培养长出孢子后，进行摇瓶初筛。 4、摇瓶初筛： 5、摇瓶复筛：
若产率不高，还必须进行第二轮诱变育种。 （三）变异株稳定性试验：
转接10代，考察传代后，各代菌株柠檬酸生产率是否有较大的变化； （四）菌种特性考察，菌落特征、菌丝形态及产生孢子的情况进行考察； （五）中试验证菌种是否适合工业化生产； （六）大型投产试验，进行工业化生产。
8、核糖体工程育种的定义及原理
向微生物核糖体或RNA 聚合酶中引入特定的突变有助于其次级代谢产物产量的提高。建立一种简单易行的微生物定向育种新方法——核糖体工程。
9、菌种衰退的含义及菌种复壮的方法。 衰退
生产菌株几乎都是人工诱变变异株，都是代谢调控失控菌株，遗传特性很不稳定，极易发生自然变异。因此，在使用和保藏过程中，生产菌株会逐渐向不利于生产方向发生变化，这种变化称为菌种的衰退 菌种的复壮方法
A、纯种分离：选取典型性状的单菌落 B、淘汰衰退个体
C、 选择合适的培养条件
1、 双酶法淀粉水解糖的生产工艺
α－淀粉酶液化 β－糖化酶和普鲁兰酶糖化 淀粉 90～950C 糊精、寡糖 55～600C 葡萄糖
调桨→配料→一次喷射液化→液化保温→二次喷射→高温维持→二次液化→冷却→糖化 2、发酵培养基筛选原则；
1、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 2、有利于减少培养基原料单耗，即提高单位营养物质转化率 3、有利于提高产物浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力 4、有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 5、尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 6、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。
7、所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。 8、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少三废物质。
3、培养基各成分的理论定量及理论转化率计算方法；
细胞产率系数（Y）定义为：消耗1克碳源底物产生的干微生物细胞克数。 4、发酵过程灭菌对象包括那些？
培养基、空气供给系统、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒 5、影响培养基灭菌效果时间的因素有哪些？
6、影响培养基灭菌时间的因素
培养基成分物理状态、培养基的pH值、微生物数量多, 彻底灭菌比较困难、微生物细胞菌龄和耐热性、空气排除情况
7、培养基分批（间歇）灭菌概念及过程；
将配制好的培养基输入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后，维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。
过程：分批灭菌的升温、保温和冷却三个阶段 8、比较分批灭菌与连续灭菌各自优势。
9、发酵工业常用空气除菌的方法，比较各自的优缺点。
加热灭菌、静电除菌和介质过滤除菌（一种介质将空气中的各种微粒和极少量 的游离微生物捕集起来予以除掉。）
1、种子的扩大培养概述及一般过程
将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁（茄子）瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：在种子罐里进行种子培养，归发酵车间管理，因此称这些培养过程为生产车间阶段。
2、影响种子质量的因素
培养基组成成分、培养条件 、种龄 、接种量 3、微生物纯培养生长曲线及在发酵工业中的应用 对数期的实践意义
※代谢、生理研究的良好材料 ※增殖噬菌体的最适宿主菌龄 ※发酵生产中用作种子的最佳种龄 ※基因工程菌发酵要尽量延长对数期 稳定期的实践意义
※发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期
※某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；
※导致连续培养原理的提出和工艺技术的改进 影响衰亡期的因素及实践意义
※菌种的遗传特性有关: 有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡, 有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；
※营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源、中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞死亡速率，延长培养物存活时间
4、初级代谢产物和次级代谢产物的定义
微生物代谢产生的，并且是微生物生长与繁殖所必需的代谢产物 ； 微生物代谢产生的，与微生物生长与繁殖无明确关系的代谢产物。 5、微生物合成次级代谢产物的基本特征。
A、次级代谢产物与微生物生长无直接关系具有种属特异性 B、次级代谢产物在菌体生长后期或稳定期合成 C、次级代谢产物不少是结构相似的混合物 D、次级代谢产物合成受多基因调控
6、提高次级代谢产物产量的方法。 A、补加前体类似物：如青霉素生产补加苯乙酸能增加青霉素G；加苯氧乙酸得到青霉素K。 B、加入诱导物：如加蛋氨酸能增加头孢霉素C的产生；加巴比妥可提高利福霉素产量 C、防止碳分解产物的阻遏或抑制：如限量流加法发酵 D、防止氮分解产物的阻遏或抑制：如限量氮源
E、选育耐前体物质的突变株、耐抗生素的突变株、毒性的突变株、营养突变株
1、发酵过程的主要控制的理化参数有哪些。
物理参数：温度、罐压、粘度、浊度、搅拌及搅拌转速、空气流量
化学参数: Ph、基质的浓度、溶解氧的浓度、氧化还原电位、废气中的O2和CO2浓度 2、影响发酵温度变化的因素及其控制。 生物热、搅拌热、蒸发热、显热、辐射热 3、简述发酵过程氧气的传递过程。
氧传递过程分为以下几步：①从气泡中的气相扩散通过气膜到气液界面；②通过气液界面；③从气液界面扩散通过气泡的液膜到液相主体；④液相溶解氧的传递；⑤从液相主体扩散通过包围细胞的液膜到达细胞表面；⑥氧通过细胞壁；⑦微生物细胞内氧的传递。 4、影响供氧的因素有哪些？ 空气的流速（通风量）、搅拌、罐压、发酵液的粘度、发酵液的理化性质、泡沫、空气的分布、发酵罐的结构。最主要是搅拌转速和通风量 5、发酵过程中泡沫对发酵的影响和消除的方法。 a、使发酵罐装量减少；
b、大量逃液，导致产物的损失；
c、泡沫顶罐，培养基从搅拌轴封渗出，增加了染菌的机会； d、影响通气搅拌的正常进行，造成发酵异常； e、使微生物菌体提前自溶，又使更多泡沫产生；
f、迫使加入消泡剂，这将对发酵工艺和产物的提取带来困难。 机械消泡和消泡剂为表面活性剂 6、机械搅拌发酵罐的主要结构。
罐身、搅拌器、轴封、消泡器中间轴承，空气喷射器、挡板、冷却装置、人孔 7、比较发酵工业中生产率和产品得率（产率）概念的异同。 生产率：发酵工业实际生产得到产品与原料的比值。
产品得率：每消耗1mol基质所合成的产物mol数，这里的基质是指微生物实际利用掉的基质数量。
8、补料分批培养定义、作用及适用范围。
定义：在分批培养过程中，间歇或连续的补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。 作用：
a、可以控制抑制性底物的浓度，使底物浓度保持在发酵最适浓度范围； b、可以解除或减弱分解产物对代谢过程的阻遏； c、可以使发酵过程最佳化。 补料分批培养的适用范围
a、高菌体浓度培养即高密度培养系统；
b、存在高浓度底物抑制系统，特别是用甲醇、苯酚等作底物的系统； c、受代谢物阻遏的系统
e、希望延长反应时间的系统 1、工业发酵过程研究的一般规律
A、实验室研究（摇瓶、10L及以下发酵罐规模）：
菌种的选育、培养基的组成成分和发酵最适条件的研究； B、中试规模（100L到500L罐规模）：
确定菌种培养和发酵的最佳工艺条件； C、工业性规模（500L到1~5吨规模）：
规模化生产，取得经济效益分析。
通常又可将它们称为小试、中试、工业性试验 2、发酵过程实验室研究的内容 A、研究菌种保藏方法；
B、研究菌株在固体培养基上培养和繁殖条件； C、发酵工业用菌种的选育；
D、考查菌株培养和发酵培养基最适组成； E、研究实验室规模的培养与发酵条件。 3、摇瓶发酵概念
在一定大小的三角瓶中（150ml、250ml、500ml)装入一定量的培养基，配上瓶塞，经灭菌后接入菌种，在摇瓶机上进行震荡培养，一定时间后，取出分析培养液中有关参数和产物得量。 4、实验室最佳发酵培养基配方的确定方法（第九章作业）
5、与一般传统发酵相比较，基因工程菌发酵有哪些特点？ a、培养装置：
摇瓶、10～200L发酵罐；
b、培养基：合成培养基，氮源主要有酵母提取物、蛋白胨、碳源主要为甘油 e、加入诱导剂如异丙基－β－D-硫代半乳 糖苷（IPTG）等，诱导工程菌表达； d、质粒必须稳定
f、采用高密度发酵工艺
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