利用电子克隆技术获得基因

利用电子克隆技术获得基因

【实验目的】

1．理解电子克隆的原理和应用。

2．掌握利用生物信息数据库进行电子克隆的操作过程。

【实验原理】

基于表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）的电子克隆（in silico cloning）策略，是近年来发展起来的一门快速克隆基因的新技术，其技术核心是利用计算机技术，依托现有的网络生物信息数据资源EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等，采用生物信息学方法（包括同源性搜索、聚类分析、序列拼接等）组装延伸ESTs序列，以期获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。进一步利用RT-PCR的方法进行克隆分析、验证。

随着EST数据库的进一步完善，电子克隆策略已成为克隆新基因的重要方法，并成功地应用于人类基因组的研究。利用EST资料的电子克隆是克隆功能基因的新途径，与传统的基因克隆方法相比，具有快捷、成本低、针对性强等特点，但也受到dbEST的EST数量和质量的限制，因此在EST资料非常丰富的模式物种（如人、鼠等）中应用较多。在实际应用中，以模式物种某一已知基因序列为起点，结合目标物种EST数据库，采用现代生物信息学及实验验证相结合的技术方法，尤其是通过同源性比较完全有可能快速筛选到一些具有重要功能的基因。

电子克隆的方法与策略（图5-1）：

1. 选择感兴趣的EST作为查询探针，查询dbEST数据库，找到部分重叠的EST同源序列（以长

度≥100 bp，同源性50 %以上，85 %以下为标准）。

2. 对找到的同源序列进行拼接，得到EST重叠群（EST conting）。

3. 以拼接好的EST conting为新的查询探针，继续搜索dbEST数据库，直到没有新的EST可供拼接为止，获得全长的基因编码序列。

4. 获得的EST序列数据与GenBank数据库进行相似性检验。如果没有精确匹配基因，可将EST序列数据按六种阅读框翻译成蛋白质序列再进行相似性检验。

5. 根据拼接好的完整序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测序验证。

本实验以植物模式种拟南芥( Arabidopsis thaliana ) 的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）基因作为查询序列, 电子克隆条斑紫菜（Porphyra yezoensis）的SAMS基因。

RT-PCR、克隆、测序 分析conting完整性 拼接EST conting 目标物种ESTs BLAST 目标物种EST 其他物种EST或cDNA作探针

图5-1 基因电子克隆操作过程

【实验用品与仪器】

条斑紫菜叶状体，Trizol reagent,反转录PCR试剂盒和核酸电泳试剂，质粒pMD18-T。上游引物5′-TGCTGGTGCCACCCTCTT-3′下游引物5′-AATGCAATCACATTCGGACA -3′

【实验内容】

1．条斑紫菜SAMS基因的电子克隆

以拟南芥SAMS基因序列( GenBank accession: NP_192094) 作为查询序列, 在条斑紫菜的dbEST 中进行tBlastn, 获得了16条高度相似并且彼此重叠的EST 序列( GenBank accession: AV432132、AV431770、AV438041、AV436311、AU187104、AU187731、AV436116、AU196958、AU194423、AU192792、AU193897、AU193952、AV436351、AV435367、AU194182、AU191528), 用Bioedit软件拼接产生1条长1576bp的contig。

再以这条contig为出发序列进行第二轮Blast，得到除以上序列外的六条相似序列（AV435690、AU190231、AV434467、AU192231、AU195888、AV434498），再次拼接，序列不再延长。

将该序列复制到NCBI的ORF finder查找开放阅读框，对每个结果进行Blast相似性检验，确认该拼接所得序列是SAMS基因。

以上操作过程详见本实验后的附录。

2．RT-PCR反应与测序

取100 mg组织, 液氮研碎, 加入1 mL Trizol液裂解细胞, 经氯仿抽提后用等体积的1:1 (V /V) 的异丙醇和高盐溶液( 1.2 mol/L 氯化钠和0.8 mol /L 柠檬酸钠)沉淀, 75 %乙醇漂洗2遍后溶于无RNase水中。电泳和核酸蛋白定量仪检测RNA的完整性、含量和纯度。-20℃保存备用。

取2 mg总RNA, 以Oligo(dT)为引物, 用第一链cDNA合成试剂盒合成单链cDNA。PCR反应体系：

反转录cDNA 4 ng

上游引物 1 L

下游引物 1 L

dNTP 2 L

10×PCR缓冲液 2.5 L

Taq DNA 聚合酶

灭菌双蒸水 至

1 L

25 L

PCR循环为：95 ℃，预变性3 min，然后30个循环：95℃变性60s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，最后72 ℃充分延伸5 m in，4 ℃保存。反应后取PCR产物电泳。

将PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌，筛选抗性菌落，送测序公司进行测序，把测序结果与电子克隆的结果进行对比分析。

【实验结果与分析】

1．扫描RT-PCR产物电泳结果，判断产物长度，分析是否与电子克隆产物长度相一致。

2．对测序结果与电子克隆后所得的基因序列进行对比分析。

3．对电子克隆基因进行生物信息学分析。

【思考题】

1．电子克隆所得的序列为什么还要用RT-PCR和测序进行验证？

2．电子克隆存在什么缺点？为什么不是所有的基因都能通过电子克隆的方法获得？

3．在提取总RNA后，怎么判断RNA的完整性？

附录：电子克隆的操作过程

1．查找已知EST序列

打开NCBI主页，在搜索框中输入要查找的已知EST的名称或GenBank accession，得到该序列的数据信息，以FASTA格式复制到一.txt文件保存。

2．搜索目标物种的EST相似序列

（1）进入NCBI的BLAST界面，打开tblastn。

（2） 在tblast查询框中粘贴步骤1保存的已知序列，Database栏选择“Expressed sequence tags (est)”Organism栏中输入要搜索生物的种名，如本实验的Porphyra yezoensis。点击BLAST。

（3）选取相似度大于50%的序列，以FASTA的格式把选中的序列保存下来。

3. 序列的电子拼接

（1）进入Bioedit软件，打开上面保存的文件。选中要拼接的序列，点击Accessory Application项中的“CAP conting asswmbly program”。默认Minimun base overlap和Percent match，

默认Minimun base overlap和Percent match，点击Run Application.

自动运行DOS命令，当出现SHOW后，按键盘Enter键。

（2）得到conting序列，如下图conting-0，双击该序列名进入序列编辑界面，可将序列复制下来，用此序列再一次进行blastn相似搜索，重复以上步骤，直至序列不能再延伸为止。

4. 电子克隆序列检验

进入NCBI的ORF Finder (Open Reading Frame Finder)程序。把拼接的序列粘贴到序列框中，点击OrfFind，得到多条序列。点击较长且完整的序列，在图下方会列出序列翻译成的蛋白质序列，再点击图上方的BLAST，直接链接进行该序列的BLAST，结果显示与该序列相似的已知蛋白的序列，以及蛋白质的特征区域，由此判断电子克隆所得序列是否是所要的目标基因。