非病毒载体诱导多能干细胞的研究进展

第２卷第２期　２０１１年３月　器官移植　Ｏｒｇａｎ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｖｏ１．２　Ｎｏ．２　Ｍａｒ．２０１１　非病毒载体诱导多能干细胞的研究进展　张彤　王刚　综述　张琪　陈规划　审校　诱导多能干细胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳ细　序列的表达会影响其分化，甚至导致肿瘤的发生，有潜在　的安全问题，这种方法的缺陷严重限制了ｉＰＳ细胞在基础　胞）是通过外源导入与多能性相关的转录因子来诱导体细　胞发生重编程从而获得的一类具有多向分化潜能的细胞。　ｉＰＳ细胞在疾病的模型建立与机制研究、细胞治疗、药物的　发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值。　２００６年Ｔａｋａｈａｓｈｉ和Ｙａｍａｎａｋａ采用体外基因转染技　术，从２４个因子中筛选出Ｏｃｔ一４、Ｓｏｘ一２、Ｋｌｆ－４和Ｃ—ｍｙｃ　研究和临床研究中的应用。腺病毒载体可以通过外源转录　基因的瞬时表达而代替基因的永久性整合从而获得ｉＰＳ细　胞　Ｊ。该方法一般不会把病毒载体整合进宿主基因组中，　但仍有可能把外源基因整合进宿主基因组中，而且诱导效　率低，并非是获得安全、高效、有临床应用价值的治疗型　ｉＰＳ细胞的最佳方法。　非病毒载体：包括质粒转染、ＰＢ转座子（ｐｉｇｇｙＢａｃ　等４个胚胎干细胞特色转录因子即Ｙａｍａｎａｋａ因子，通过逆　转录病毒载体将上述４个转录因子导入小鼠成纤维细胞，　可以将成纤维细胞逆转为胚胎干细胞样细胞，他们将这些　多潜能干细胞命名为ｉＰＳ细胞　。２００７年，Ｙａｍａｎａｋａ小组　和Ｔｈｏｍｓｏｎ小组先后成功建立人ｉＰＳ细胞系，从而开启了　ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）载体、ＲＮＡ转染、蛋白质直接介导、微小核　糖核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、小分子化合物等方式的基因导入方　式。目前，最理想、最实用的方法是用小分子化合物来代　干细胞研究的ｉＰＳ细胞时代。ｉＰＳ细胞是多潜能干细胞亚群　之一，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形　替外源基因，通过促进内源干性基因在体细胞中瞬时表达　以诱导ｉＰＳ细胞的形成。该法同样存在诱导效率不高的缺　点，但是不同转录因子组合与小分子化合物组合联用可极　成畸胎瘤等方面与胚胎干细胞非常相似，但是ｉＰＳ细胞技　术具有不可比拟的优势，表现在以下几方面　：目前该技　术可以将已分化的体细胞直接重新再编程为多能干细胞，　无需破坏胚胎，没有伦理压力；其次，有了这项技术人们　可以得到疾病特异性ｉＰＳ细胞，进行疾病发病机制的研究，　从而找到治疗疾病的新方法；同时，这些多能干细胞来自　于患者本身，没有免疫排斥，可以开展个体化细胞治疗，　作为未来临床开展细胞治疗的重要来源。　根据基因导入的方式不同，ｉＰＳ细胞诱导载体可以分为　大提高鼠和人体细胞重编程为ｉＰＳ细胞的效率，这些小分　子化合物在促进细胞重编程方面起重要作用。　本文对非病毒载体诱导ｉＰＳ进行了综述，以总结目前　的研究进展。　一、质粒转染　Ｏｋｉｔａ等”　采用两个质粒，１个为共表达Ｏｃｔ一４、Ｓｏｘ一　２、Ｋｌｆ－４基因的多顺反子质粒，另一个仅携带Ｃ—ｍｙｃ基因，　通过脂质体介导重复转染小鼠胚胎成纤维细胞成功获得没　有外源基因插入的ｉＰＳ细胞。由于ｉＰＳ细胞的形成需持续表　病毒载体与非病毒载体。　病毒载体：逆转录病毒载体是ｉＰＳ细胞前期研究中普　遍使用的载体，一般只能感染分裂旺盛的细胞，不能感染　静止期的细胞如神经元　’　。慢病毒载体也属逆转录病毒　的一种，可以高效感染分裂细胞和非分裂细胞，是目前建　立ｉＰＳ细胞系最传统的方法。常用的有慢病毒载体　＇　、　诱导表达的慢病毒载体　“　、单一慢病毒载体　。　。优　点：诱导效率比较高，新生儿包皮成纤维细胞重新编码效　达Ｙａｍａｎａｋａ因子ｌ０～１２　ｄ　，因此这种方法要求反复转　染细胞以保证Ｙａｍａｎａｋａ因子在重编程的前期持续表达。同　腺病毒介导的方法一样，使用质粒诱导ｉＰＳ细胞的效率很　低。　Ｇｏｎｚａｌｅｚ等”　改进了实验方法，采用１个ＣＡＧ启动子　驱动并携带Ｏｃｔ一４、Ｓｏｘ一２、Ｋｌｆ－４和Ｃ—ｍｙｃ基因的多顺反子　质粒载体（ｐＣＡＧ—ＯＳＫＭ），通过核转染（１～２次）小鼠胚　胎成纤维细胞，可以获得没有整合外源性基因的ｉＰＳ细胞　率最高可达０．０１％　。缺点：逆转录病毒载体包括慢病毒　载体均导致载体序列及外源因子序列永久地整合入细胞的　基因组脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）中，有可能引起插入突变，　（４１个形成的克隆中有３８个没有整合外源性基因的证据）。　Ｏｋｉｔａ等　使用２个质粒通过４次系列转染可以获得　３２％的无整合外源基因ｉＰＳ克隆（形成的１４７个ｉＰＳ克隆　以致干扰正常ｉＰＳ细胞系的功能，而细胞中残余外源因子　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－７４４５．２０１１．０２．Ｏｌ２　基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（９７３分课题）（２００９ＣＢ５２２４０４）；国家自然科学基金——广东联合基金重点项目　（Ｕ０９３２００６）；国家自然科学青年科学基金（３０８０１１１２）；教育部新教师基金（２０１００１７１１２００８７）　作者单位：５１０６３０广州，中山大学附属第三医院肝移植中心中山大学器官移植研究所广东省器官移植研究中心（张彤、张琪、陈规　划）；美国哈佛大学干细胞研究中心哈佛大学附属波士顿儿童医院（王刚）　通讯作者：陈规划，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｇｈ１９５５＠２６３．ｎｅｔ；张琪，Ｅ　ｍａｉｌ：ｋｅｅｋｅｅ７７＠１２６ｌｃ０ｍ　・１ｌＯ・　器官移植　第２卷　中有４７个无整合外源基因ｉＰＳ克隆）。Ｇｏｎｚａｌｅｚ等¨　单次　核转染形成的ｌ０个ｉＰＳ克隆中没有无整合ｉＰＳ克隆；２次　核转染有８％的无整合外源基因ｉＰＳ克隆形成。由于克隆　形成在不同的时问点，很难来评价两者的绝对效率，并且　两者还是有一部分ｉＰＳ细胞有表达载体整合到了基因组　ＤＮＡ中。　Ｋａｊｉ等　通过构建单个质粒作为载体　（ｐＣＡＧ２ＬＭＫＯＳｉｍｏ），同时表达４个重编码因子Ｏｃｔ一４、　Ｓｏｘ－２、Ｋｌｆ－４和Ｃ—ｍｙｃ，转染人类成纤维细胞并成功诱导成　ｉＰＳ后，利用Ｃｒｅ—ＬｏｘＰ重组酶系统将整合的外源性重编码　基因切除，这样得到的ｉＰＳ细胞在基因表达谱上较没切除　的ｉＰＳ细胞更接近人胚胎干细胞　。由于这些载体的整合　是随机的，Ｃｒｅ．Ｌｏｘｐ重组酶切除重编码基因后，载体的一　段ＤＮＡ还留在插入位点上，因此仍然无法避免插入突变。　Ｙｕ等　采用非整合型附着体载体（ｎｏｎ—ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｅｐ—　ｉｓｏｍａｌ　ｖｅｃｔｏｒ）ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１，通过核转染新生儿包皮成纤维　细胞，质粒中的基因所表达的蛋白质将新生儿包皮成纤维　细胞重新编程，通过药物筛选的方法，成功建立第１株无　基因组操作的人ｉＰＳ细胞系。该载体采用ＥＢ病毒核抗体游　离型载体（Ｅｐｓｔｅｉｎ—Ｂａｒｒ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ一１　ｂａｓｅｄ　ｅｐｉｓｏｍａ１），　利用３个包括了Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－２、　ｆ一４、Ｃ—ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、　Ｎａｎｏｇ、ＳＶ６０大Ｔ抗原等重编码因子的游离载体，它性质　稳定不会整合人宿主细胞造成突变，携带的目的基因也能　获得高效率的表达，哺乳动物细胞中ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１载体要在　染色体外稳定复制只需要１个顺式作用ｏｒｉＰ因子和１个反　式ＥＢＮＡ１基因，适合于作为将外源基因携带入哺乳动物细　胞表达的载体。在得到ｉＰＳ细胞后，停止使用药物筛选，　附着体载体会逐渐丢失，通过亚克隆可分离得到没有载体　和转基因的人ｉＰＳ细胞。由于这些ｉＰＳ细胞没有外源性　ＤＮＡ，从而避免了癌变问题，此方法对ｉＰＳ细胞将来应用　于临床具有重要意义。该方法同样有效率低的问题，重编　程效率大约是每一百万起始细胞产生３—６个克隆。虽然这　些载体不整合入细胞基因组，但毕竟是导入了外源性　ＤＮＡ，且无法确保载体的部分片段１００％整合入基因组，　仍然存在一定风险。　Ｊｉａ等　建立一个微环状载体（Ｐ２ＰｈｉＣ３１一ＬＧＮＳＯ），　为携带ＰＯＵＳＦ１、Ｓｏｘ－２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ四个重组因子及２Ａ　肽段和ＩＲＥＳ的质粒，可以诱导人脂肪干细胞重编程为ｉＰＳ　细胞，同时进一步利用ＰｈｉＣ３１分子内重组系统使质粒骨架　在细菌里被清除和被降解。微环状载体为非细菌来源的超　螺旋ＤＮＡ分子，它主要由真核表达盒组成，由于外源沉默　机制的低活化作用而具有更长的异位表达。微环状载体具　有较高转染效率，总的重编程效率为０．００５％，和其他非　整合型ｉＰＳ的方法比较，比病毒载体的效率（０．Ｏ１％）　低　∞］，但仍高于以前质粒转染重编程方法ｎ　。该载体　仅有１个质粒，无需随后的药物筛选或载体清除，也未包　含癌基因ＳＶ４０，能制备无遗传修饰ｉＰＳ细胞，更适合未来　的临床治疗。　二、ＰＢ转座子　ＰＢ转座子属于整合型载体，由２Ａ肽段序列连接的４　个Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ一４、Ｓｏｘ－２、Ｋｌｆ－４和Ｃ．ｍｙｃ）共表　达载体转染入小鼠成纤维细胞诱导形成稳定的ｉＰＳ细胞，　在瞬时表达转座酶催化下切除外源Ｙａｍａｎａｋａ因子，不会引　起基因组ＤＮＡ序列的任何变化　ｊ。而且，这种方法的细　胞转染率高，外源基因能够正常表达，因此诱导效率与逆　转录病毒几乎一致。相对Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ重组系统介导的基因切　除而言，ＰＢ转座子可以定点整合和切除，故可以完成无痕　细胞重编码，提高了安全性，不易使基因癌化，且能通过　转座子的切除来获得无载体和转基因的ｉＰＳ细胞，是一种　更安全的建立ｉＰＳ细胞系的方法。然而，由ＰＢ转座子得到　的ｉＰＳ细胞的安全性，特别是在建立ｉＰＳ细胞过程中转座子　插入对ｉＰＳ细胞安全性的长期效应，还有待更多的实验来　验证。目前还没有关于用这种方法得到人类ｉＰＳ细胞的相　关成果，而且切除多个转座子费时费力。整合型载体将外　源基因序列随机整合到基因组，存在诱发肿瘤和导致宿主　基因表达失调的风险。　三、ＲＮＡ转染　ＲＮＡ可以参与体细胞重编程为ｉＰＳ细胞。Ｙａｋｕｂｏｖ　等　用质粒ｐＴＭＡ作为平台通过体外转录方法分别使用四　个转录因子（Ｏｃｔ一４、Ｌｉｎ－２８、Ｓｏｘ－２、Ｎａｎｏｇ）的ｃＤＮＡ体　外合成ｍＲＮＡ，ＲＮＡ转染重编程人类包皮成纤维细胞产生　ＲＮＡ诱导ｉＰＳ（ＲＮＡ—ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉＰＳ，ＲｉＰＳ），ＲＮＡ转染导致　蛋白表达水平不到８　ｈ，至少需要５次连续的转染来保持蛋　白表达水平，以能够接人外源性干细胞多潜能基因促使人　类包皮成纤维细胞诱导成ｉＰＳ细胞。该研究表明，采用以　上技术各种转录因子表达的蛋白在细胞内表达和核定位至　少是细胞总数的７０％。这种方法避免了破坏ＤＮＡ整合和　相关基因组，可能会代替ＤＮＡ载体诱导ｉＰＳ细胞。　四、蛋白质直接介导　在重编程因子蛋白上连接细胞穿膜肽形成可穿透细胞　膜的融合蛋白进入细胞内部，执行其重编程的功能，来诱　导ｉｓｐ细胞的形成，成为蛋白诱导多能干细胞（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｉｎ—　ｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ｐｉｓｐＣｓ），确保细胞基因组的完　整性。Ｚｈｏｕ等　把聚精氨酸蛋白转导区连接到４个重编码　因子（Ｏｃｔ一４、Ｓｏｘ－２、Ｋｌｆ一４、Ｃ—ｍｙｃ）的Ｃ末端形成的融　合蛋白导入小鼠胚胎成纤维细胞内，在化学小分子丙戊酸　（ｖａｌｐｒｏｉｃ　ａｃｉｄ，ＶＰＡ）协助下，融合穿膜肽１１Ｒ（Ｐｏｌｙ—ａｒｇｉ・　ｎｉｎｅ）的蛋白质组合１１Ｒ—Ｏｃｔ一４、１１Ｒ—Ｓｏｘ－２、１１Ｒ・Ｋｌｆ－４、　１１Ｒ—ｃ．Ｍｙｃ分别将小鼠成纤维细胞重编程为ｉＰＳ细胞。用类　似的方法Ｋｉｍ等　’　使用融合穿膜肽９Ｒ的蛋白质组合９Ｒ－　Ｏｃｔ４、９Ｒ．Ｓｏｘ－２、９Ｒ—Ｋｌｆ－４、９Ｒ．Ｃ—Ｍｙｃ重编程人新生儿成纤　维细胞为ｉＰＳ细胞。由于蛋白质转染技术制备的ｉＰＳ细胞在　重编程过程中不会涉及任何的遗传修饰，避免了基因操作　和化学物质不良反应带给ｉＰＳ细胞的潜在风险，因此，从　第２期　张彤等．非病毒载体诱导多能干细胞的研究进展　ｉＰＳ细胞临床应用的安全角度来看，它是目前最安全的方　法，但是需要进一步提高其诱导效率。目前，蛋白质转染　技术依赖化学小分子并需多次转染，重编程效率极低　（０．００１％），而且蛋白容易失活，限制了其在制备ｉＰＳ细　胞上的进一步应用　”。。随着提高重编程效率化学物质的　研发，以及蛋白组学的方法，有望建立高效、安全型蛋白　质转染一化学药物诱导技术，为改进ｉＰＳ细胞制备技术提供　新策略。　五、微小脱氧核糖核酸　ｍｉｃｒｏＲＮＡ可通过对转录调控和表观遗传调控的影响来　调节体细胞重编程效率。Ｍｉｒ一３０２ｓ家族是维持胚胎干细胞　自我更新能力和干性的重要因素之一，在生长缓慢的人胚　胎干细胞中表达非常丰富，在细胞分化和细胞增殖后迅速　减少　。Ｌｉｎ等　利用ｍｉｒ一３０２ｓ转染人黑色素瘤Ｃｏｌｏ细胞　和人前列腺癌ＰＣ３细胞，转变为ｍｉｃｒｏＲＮＡ诱导ｉＰＳ细胞　（ｍｉＲＮＡ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｒｎ　ｃｅｌｌｓ，ｍｉｒＰＳ），这些细胞不　仅表达大量重要的胚胎干细胞标志物，例如Ｏｃｔ一３／４、特异　性胚胎抗原（ｓｔａｇｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ，ＳＳＥＡ）一３、　ＳＳＥＡ一４、Ｓｏｘ－２、Ｎａｎｏｇ，而且有一组类似重组合子基因组　的高度去甲基化基因组。芯片分析进一步揭示ｍｉｒＰＳ和人　胚胎干细胞Ｈ１、Ｈ９之间的全基因组的基因表达模式有　８６％是一致的。通过分子引导的体外实验，这些ｍｉｒＰＳ细　胞能分化成不同的组织细胞类型，如神经元、软骨细胞、　成纤维细胞和精原细胞样原始细胞。　ｌｅｔ一７对ｉＰＳ细胞分化有重要作用。Ｍａｌｌａｎｎａ等　研究　了抑制ｌｅｔ－７　ｍｉｃｒｏＲＮＡ活性对重新编码体细胞变成ｉＰＳ细胞　的作用。通过瞬时转染把ｌｅｔ一７反义抑制剂导入小鼠胚胎成　纤维细胞和在有或无Ｃ—ｍｙｅ情况下，研究它对Ｓｏｘ一２、Ｏｃｔ一　４、Ｋｌｆ－４调节的重编码的作用。】ｅｔ一７活性的抑制使Ｓｏｘ一２、　Ｏｃｔ一４、Ｋｌｆ－４调节的重编码作用增加了４．３倍；而Ｓｏｘ一２、　Ｏｃｔ一４、Ｋｌｆ－４、Ｃ—ｍｙｃ调节的重编码作用仅增加了１．７５倍。　Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ等　使用４个转录因子Ｏｃｔ一４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ一２　和Ｌｉｎ２８，其中Ｌｉｎ２８可阻止ｌｅｔ一７家族ｍｉｃｒｏＲＮＡ的加工，　从而抑制ｌｅｔ一７家族ｍｉｃｒｏＲＮＡ的功能。所以，Ｌｉｎ２８很可能　是通过抑制与分化有关的ｍｉｃｒｏＲＮＡ的加工，影响相关基因　的转录调控，进而促进ｉＰＳ细胞的形成。　此外，ｍｉＲ一２９１—３ｐ、ｍｉＲ一２９４和ｍｉＲ一２９５可提高Ｏｃｔ一４、　Ｓｏｘ一２和Ｋｌｆ－４　３个因子的重编程效率，但是对这３个因子　加Ｃ—ｍｙｃ的重编程效率没有影响，Ｃ—ｍｙｃ结合到这３个ｍｉ—　ｃｒｏＲＮＡ的启动子上，表明了Ｃ—ｍｙｃ可能是通过激活这３个　ｍｉｃｒｏＲＮＡ来重编程体细胞的　。　六、小分子化合物　重编程效率低和外源性基因的安全性是人工诱导ｉＰＳ　细胞的各种方法所面临的两个共同的难题。最理想、最实　用的方法是用小分子化合物代替外源基因导入实现体细胞　重编程而获得ｉＰＳ细胞，这些功能性的非肽类或肽类的小　分子和天然产物具有分子质量小、结构简单、生产成本低、　易吸收和生理活性稳定等特点。目前，对体细胞重编程为　ｉＰＳ细胞的复杂分子机制仍然知之甚少，尚无单纯小分子化　合物代替外源性基因诱导成功ｉＰＳ的报道．但这一想法在　不久的将来有望变为现实。　目前发现的小分子化合物，如ＤＮＡ甲基化酶抑制剂　（ＢＩＸ￣１２９４、５－氮脱氧胞嘧啶核苷），组蛋白去乙酰化酶抑　制剂（曲古抑菌素Ａ），信号传导通路的激活剂和抑制剂　［Ｗｎｔ通路激活剂（Ｗｎｔ３ａ）、钙离子通路激活剂　（ＢａｙＫ８６４４）、Ｒａｓ一丝裂原激活的蛋白激酶通路抑制剂　（ＰＤ０３２５９０１）和肝糖原合成激酶３通路抑制剂　（ＣＨＩＲ９９０２１）］等，可以促进ｉＰＳ细胞的形成，通过使用　这些小分子化合物，更少的外源性基因导人即可高效率获　得ｉＰＳ细胞，这向制备无遗传修饰的ｉＰＳ细胞方向迈出了一　大步　’。　综上所述，随着可调控基因诱导技术的建立、蛋白质　转染技术的实现、化学小分子和天然化合物的参与，非病　毒载体重编程的研究，有望根据研究与应用需要而建立更　安全、更高效获取ｉＰＳ细胞的方法。　参考文献　［１］Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｂｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４）：６６３－６７６．　［２］Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｔａｎａｂｅ　Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ａｄｕｌｔ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｈｒｏｂｌａｓｔｓ　ｈｙ　ｄｅ—　ｉｆｎｅｄ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５）：８６１—８７２．　［３］Ｙｕ　Ｊ，Ｖｏｄｙａｎｉｋ　ＭＡ，Ｓｍｕｇａ—Ｏｔｔｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕ—　ｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｒｎ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８）：１９１７—１９２０．　［４］Ｌｉａｏ　Ｊ，Ｃｕｉ　Ｃ，Ｃｈｅｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕ—　ｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ａｄｕｌｔ　ｒａｔ　ｃｅｌｌｓ『Ｊ　１．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２００９，４（１）：１１－１５．　［５］“Ｗ，Ｗｅｉ　Ｗ，Ｚｈｕ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ａｎｄ　ｈｕ—　ｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２００９，４（１）：１６—１９．　［６］Ｌｉｕ　Ｈ，Ｚｈｕ　Ｆ，Ｙｏｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕ—　ｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ａｄｕｌｔ　ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２００８，３（６）：５８７—５９０．　［７］Ｗｕ　Ｚ，Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｒｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｄｒｕｇ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００９，１（１）：４６—５４．　［８］Ｅｓｔｅｂａｎ　Ｍａ，Ｘｕ　Ｊ，Ｙａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｔｉｂｅｔａｎ　ｍｉｎｉａｔｕｒｅ　ｐｉｇ［Ｊ］．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００９，２８４（２６）：１７６３４—１７６４０．　［９］Ｈｏｎｄａ　Ａ，Ｈｉｒｏｓｅ　Ｍ，Ｈａｔｏｒｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎ—　ｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｅｒｉ—　器官移植　第２卷　ｍｅｎｔｌａ　ｍｏｄｅｌｓ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉ－　ｏｌ　Ｃｈｅｍ，２０１０，２８５（１Ｏ）：３１３６２—３１３６９．　［１Ｏ］　Ｍａｈｅｒａｌｉ　Ｎ，Ａｈｆｅｌｄｔ　Ｔ，Ｒｉｇａｍｏｎｔｉ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｈｉｉｇｈ—ｅｆｆｉ—　ｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｎ—　ｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２００８，３　（３）：３４０—３４５．　［１１］　Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ　Ｄ，Ｓｏｌｄｎｅｒ　Ｆ，Ｃｏｏｋ　Ｅ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｄｒｕｇ—ｉｎ—　ｄｕｃｉｂｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ，２００８，３（３）：　３４６—３５３．　［１２］　Ｓｏｍｍｅｒ　ＣＡ，Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ　Ｍ，Ｍｕｒｐｈｙ　ＧＪ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕ—　ｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｃａｓｓｅｔｔｅ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２００９，２７（３）：５４３－５４９．　［１３］　Ｃａｒｅｙ　ＢＷ，Ｍａｒｋｏｕｌａｋｉ　Ｓ，Ｈａｎｎａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ—　ｍｉｎｇ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｏｌｙｃｉｓｔｏｒｎｉｃ　ｖｅｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，　２００９，１０６（１）：１５７—１６２．　［１４］　Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ　Ｍ，Ｎａｇａｙａ　Ｍ，Ｕｔｉｋａｌ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉ—　ｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｖｉｒａｌ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２２（５９０３）：９４５－９４９．　［１５］　Ｏｋｉｔａ　Ｋ，Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｈｙｅｎｊｏｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２２（５９０３）：９４９－９５３．　［１６］　Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ　Ｔ，Ｆｏｒｅｍａｎ　Ｒ，Ｗｅｌｓｔｅａｄ　ＧＧ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｑｕｅｎ—　ｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅ—　ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，　２００８，２（２）：１５１．１５９．　［１７］　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｆ，Ｂａｒｒａｇａｎ　Ｍｏｎａｓｔｅｒｉｏ　Ｍ，Ｔｉｓｃｏｍｉａ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｏｎｖｉｒａｌ　ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　ｖｅｅ—　ｔｏｒ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００９，１０６（２２）：　８９１８．８９２２．　［１８］　Ｋａｊｉ　Ｋ，Ｎｏｒｒｂｙ　Ｋ，Ｐａｃａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｖｉｒｕｓ—ｆｒｅｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４５８（７２３９）：７７１－７７５．　［１９］　Ｓｏｌｄｎｅｒ　Ｆ，Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ　Ｄ，Ｂｅａｒｄ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ＂ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｐａｔｉｅｎｔ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｉｌｓ　ｆｒｅｅ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００９，１３６（５）：　９６４．９７７．　［２０］　Ｙｕ　Ｊ，Ｈｕ　Ｋ，Ｓｍｕｇａ—Ｏｔｔｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕ—　ｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｅｅ　ｏｆ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２４（５９２８）：７９７—８０１．　［２１］　Ｊｉａ　Ｆ，Ｗｉｌｓｏｎ　ＫＤ，Ｓｕｎ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｎｏｎｖｉｒａｌ　ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｄｅｒｉｖｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２０１０，７（３）：１９７—１９９．　［２２］　Ｏｋｉｔａ　Ｋ，Ｉｃｈｉｓａｋａ　Ｔ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｒｍ・　ｌｉｎｅ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａ—　ｔｕｒｅ，２００７，４４８（７１５１）：３１３—３１７．　［２３］ＷｅｍｉｇＭ，ＭｅｉｓｓｎｅｒＡ，ＦｏｒｅｍａｎＲ，ｅｔａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｐｒｏ—　ｒｇａｍｍｉｎｇ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎｔｏ　ａ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ＥＳ・・ｃｅｌｌ・－ｌｉｋｅ　ｓｔａｔｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４８（７１５１）：３１８－３２４．　［２４］Ｗｏｈｊｅｎ　Ｋ，Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｉ　Ｐ，Ｍｏｈｓｅｎｉ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．ｐｉｇｇｙＢａｃ　ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４５８（７２３９）：７６６－７７０．　［２５］Ｙａｋｕｂｏｖ　Ｅ，Ｒｅｃｈａｖｉ　Ｇ，Ｒｏｚｅｎｂｌａｔｔ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ—　ｍｉｎｇ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｔｏ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍＲＮＡ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｔｒａｎｓｃｉｒｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２０１０，３９４（１）：１８９—１９３．　［２６］Ｚｈｏｕ　Ｈ，Ｗｕ　Ｓ，Ｊｏｏ　ＪＹ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２００９，４（５）：３８１—３８４．　［２７］Ｋｉｍ　Ｄ，Ｋｉｍ　ＣＨ，Ｍｏｏｎ　ＪＩ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｄｉｒｅｃｔ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｒｅｐｒｏ—　ｇｒａｍｍｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２００９，４（６）：　４７２—４７６．　［２８］Ｓｕｈ　ＭＲ，Ｌｅｅ　Ｙ，Ｋｉｍ　ＪＹ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ａ　ｕｎｉｑｕｅ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ，　２００４，２７０（２）：４８８—４９８．　［２９］¨ｎ　ＳＬ，Ｃｈａｎｇ　ＤＣ，Ｃｈａｎｇ—Ｌｉｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｒ一３０２　ｒｅｐｒｏ—　ｇｒａｍｓ　ｈｕｍａｎ　ｓｋｉｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ａ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ＥＳ・・ｃｅｌｌ・－　ｌｉｋｅ　ｓｔａｔｅ［Ｊ］．ＲＮＡ，２００８，１４（１Ｏ）：２１１５—２１２４．　［３０］Ｍａｌｌａｎｎａ　ＳＫ，Ｒｉｚｚｉｎｏ　Ａ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ，２０１０，３４４　（１）：１６—２５．　［３　１］Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ　ＳＲ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ，Ｇｒｅｇｏｒｙ　ＲＩ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｂｙ　ｌｉｎ２８［Ｊ］．Ｓｃｉ—　ｅｎｃｅ，２００８，３２０（５８７２）：９７－１００．　［３２］Ｊｕｄｓｏｎ　ＲＬ，Ｂａｂｉａｒｚ　ＪＥ，Ｖｅｎｅｒｅ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏ－　ｔｅｎｃｙ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，２７（５）：４５９－４６１．　［３３］Ｓｈｉ　Ｙ，Ｄｏ　ＪＴ，Ｄｅｓｐｏｎｔｓ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｃｏｂｍｉｎｅｄ　ｃｈｅｍｉｃｌａ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉ—　ｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２００８，２（６）：　５２５—５２８．　［３４］Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ　ＴＳ，Ｈａｎｎａ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ　ｄｉ—　ｒｅｃｔ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５４（７２００）：４９－５５．　［３５］Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ，Ｍａｅｈｒ　Ｒ，Ｇｕｏ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉ—　ｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｓ　ｇｒｅａｔｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂｙ　ｓｍａｌｌ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６　（７）：７９５－７９７．　（收稿日期：２０１１一Ｏ２—０９）　（本文编辑：邬加佳）