荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶

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【摘要】 合成了一种新的底物水杨酸磷酸酯 (SP)，用于荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶(ALP)活力。在37.0 ℃的TrisHCl缓冲液(pH 9.0)条件下, 碱性磷酸酶作用于荧光底物SP，水解生成强荧光产物水杨酸(SA)，生成的SA的量与参与反应的ALP 的活力成正比。据此建立了荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶活力的新方法。测定碱性磷酸酶的线性范围是0.03～6.00 U/L，检测限为7.04 mU/L。本方法适用于血清中碱性磷酸酶的测定。测定结果与临床上常用的以对硝基苯磷酸酯为底物的分光光度法相比，无显著性差异。 【关键词】 碱性磷酸酶 荧光光度法 水杨酸磷酸酯 1 引言

碱性磷酸酶(ALP, EC3.1.3.1)的活性测定是临床上最常见的测定项目之一[1]。血液中的ALP主要来自于肝脏和骨骼，因此在这些器官发生病变时血清ALP活力会明显增高。ALP活力测定可作为诊断某些疾病的辅助指标[2]。因此，在临床诊断中简单、准确地测定血清中ALP的活性是非常重要的。测定ALP活性的方法主要有分光光度法[1,3,4]，电化学方法[5,6]、化学发光法[7,8]和荧光法[9～14]等。临床推荐使用的检测ALP方法是利用对硝基苯磷酸酯作为底物的分光光度法和磷酸苯二钠作为底物的氨基安替比林比色法[1,3,4]。通常，荧光法的灵敏度较分光光度法高约两个数量级，且和分光光度法一样具有所用仪器简单、操作方便及易于实现操作自动化等优点。本实验选择水杨酸磷酸酯(SP)作为荧光底物，SP在4 ℃的低温条件下，至少可稳定一个月。在实验条件下，合成的新底物SP稳定性好，荧光背景很低。而SP被ALP水解后生成强荧光产物水杨酸（SA），反应机理如下。 荧光分子SA中含有共轭π键且SA分子取代基之间形成氢键，从而加强了分子的刚性结构，使其荧光强度增强，且生成的SA的量与参与反应的ALP活力呈线性关系。据此建立了荧光法测定ALP活性的新方法。 2 实验部分 2.1 仪器

RF540型荧光分光光度计和UV265型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；PHS3B型酸度计（上海雷磁仪器厂）；离心机（上海手术机械厂）。

2.2 试剂

水杨酸磷酸酯(SP)参照文献[15]合成并纯化，将10.0 g SA与15.0 g PCl5混合使之在室温下反应，直到反应平缓下来，然后用60～65 ℃水浴搅拌加热1.5 h。用冰水浴将反应混合物冷却，然后依次加入25 mL苯、25 mL丙酮和3.5 mL水。将混合物冰水冷却30 min后，加入50 mL苯，再放置24 h。经真空干燥过夜后，用丙酮和苯的混合物重结晶，可得7.99 g SP（产率约51%）。测得其熔点为163～165 ℃，与文献[15]报道的162.5～163 ℃ 基本符合。底物C、H含量用元素分析仪（美国PE2400）测定（%，括号为理论值）：测得值为：C 38.50（38.54）, H 3.26（3.24）。

工作液的配制：准确称取0.1090 g SP，溶于少量0.10 mol/L TrisHCl缓冲溶液(pH 9.0)中，并以此缓冲溶液定容至500 mL容量瓶，得1.00 mmol/L工作液（可稳定一个月以上）。碱性磷酸酶(ALP，分析纯，Sigma公司，17 U/mg)储备液的配制：准确称取0.0441 g ALP，溶于少量0.10 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH=9.0) 中，并以此缓冲溶液定容至250 mL容量瓶，得3.00 U/mL储备液。使用时以0.10 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH 9.0)逐级稀释得工作液。水杨酸(SA，分析纯，北京化学试剂公司)工作液的配制：准确称取0.0691 g SA，溶于少量0.10 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH 9.0) 中，并以此缓冲溶液定容至500 mL容量瓶，得1.00 mmol/L工作液。储备液与工作液均需置于0～4 ℃的生化培养箱内保存。

0.10 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH 9.0)。其余所用试剂均为分析纯，所有实验用水均为石英亚沸蒸馏水。 2.3 实验方法

于10 mL比色管中依次加入1.0 mL 1.00 mmol/L SP、2.0 mL TrisHCl 缓冲溶液(pH 9.0)和0.10 mL 0.30 U/L ALP，以石英亚沸蒸馏水定容至刻度，振荡摇匀，37.0 ℃水浴放置10 min，用1 cm荧光池（附有自动恒温装置），记录其荧光光谱。同时在λex/λem=303/412 nm测定荧光强度F，同时测定试剂空白的荧光强度F0。经过酶反应后，增强的荧光强度以ΔF（ΔF= F－F0）表示。 3 结果与讨论

3.1 ＳＡ和ＳＰ的荧光光谱

SA溶液、SP溶液和SPALP混合后体系的荧光激发光谱和发射光谱见图1。酶反应后所得产物SA分子具有强的共轭π键， 刚性结构以及给电子基团(OH)，因此SA荧光较强。合成的SP将SA分子中的给电子基团(OH)转化为磷酸酯基，使得SP的荧光显著减弱。由图1可见，单纯的SP溶液荧光很弱（曲线2）；在SP中加入ALP后（曲线3），荧光强度显著增强且峰形与SA（曲线1）类似。荧光光谱说明ALP能催化SP水解，生成SA。 图1 荧光激发光谱(a)和荧光发射光谱(b) （略）

Fig.1 Fluorescence excitation spectrum (a) and emission spectrum (b) 1. salicylic acid（SA）; 2. Salicyl phosphate (SP); 3. SPalkaline

phosphatase(ALP). Experimental conditions: 1.00×10－4 mol/L SA, 1.00×10－4 mol/L SP, 0.30 U/L ALP, pH 9.0, λex=303 nm。 3.2 反应条件的优化

3.2.1 酸度的影响 体系酸度对酶催化反应影响见图2。由图2可见，在pH = 7.5～10.5之间，体系的ΔF先增大后减小，当pH在8.0～10.0范围时，体系的荧光强度ΔF变化不大。而在pH 8.8～9.8范围内，体系的ΔF达到最大且保持稳定，故本实验选择pH 9.0的0.10 mol/L TrisHCl缓冲体系进行进一步的研究。结果表明，加入2.0 mL缓冲溶液时，ΔF达到最大且保持稳定。

3.2.2 底物浓度的影响 SP的浓度对体系荧光强度（ΔF）的影响见图3。由图3可知，在5.0～50 μmol/L范围内，随着底物SP浓度的增大，体系的荧光强度（即反应速度）逐渐增大，当SP浓度大于50 μmol/L时，体系的荧光强度不随底物浓度的增大而变化。米氏动力学方程式[16] Ｖ＝Ｖmax·［Ｓ］Ｋm＋［Ｓ］反映了酶反应速率与底物浓度之间的关系。

图2 pH值对荧光强度的影响（略） Fig.2 Effect of pH on fluorescence intensity

图3 底物SP的浓度对体系荧光强度(ΔF)的影响（略）

Fig.3 Effect of concentration of substrate SP on enhanced fluorescence Intensity 通过LineweaverBurk 双倒数转换，得式（1）：１Ｖ＝ＫmVmax×１［Ｓ］＋１Ｖmax(1)式中，V为初速度（mol/(min／L)），Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度（mol/L）， Km为米氏常数(mol/L)。本研究以ΔF的值相应地代表了酶的反应速率。因此得式（2）： １ΔＦ＝ＫmVmax×１［ＳＰ］＋１Ｖmax(２)所以， 以１ΔＦ对１［ＳＰ］作图，得Km值为1.28×10－5 mol/L。 为了正确测得酶活力， 所选底物浓度应远大于Km值。因此，本研究选择浓度为1.00×10－4 mol/L。

3.2.3 温度对体系荧光强度的影响 同其它酶促反应相似，ALP催化SP水解反应受温度影响较大。实验结果表明，当温度低于50 ℃时，F0随温度变化很小；当温度高于50 ℃时，F0随温度上升而迅速增加，这是由于底物自身水解的影响所造成；反应温度为30～50 ℃时，ΔF达到最大值且保持不变，本实验选择37.0 ℃进行下一步研究，这样既保证了酶活性，又与临床应用的生理环境相一致。

图4 反应时间对体系荧光强度(ΔF)的影响（略）

Fig.4 Effect of incubation time on enhanced fluorescence intensity

3.2.4 反应时间对体系荧光强度的影响 同其它酶促反应相似，ALP催化SP水解反应受反应时间影响较大。由图4可见，随着反应时间增加，F0基本保持稳定，而F和ΔF随之增大。实验结果表明，在180 min内，体系荧光强度的增强(ΔF)与反应时间成正比。为了提高分析速度，选择孵育时间为10 min，此时已有较强的检测信号和足够的灵敏度。 3.3 分析应用

3.3.1 线性范围与检测限 在选定的最佳条件下，体系增强的荧光强度与ALP的活性在0.03～6.00 U/L范围内有良好的线性关系，线性方程为ΔF=76.73C+11.32，相关系数0.996。空白溶液的标准偏差为0.18时（n=11），检出限为7.04 mU/L。 表1 人血清中ALP活性的测定（略）

Table 1 Determination of activity of ALP in serum samples

3.3.2 人血清ALP活性的测定 取人血清0.10 mL，按上述实验方法直接测定其中所含ALP的活性；同时用标准比色法（以对硝基苯磷酸酯为底物）[4]测定该样品，结果见表1。由表1可知，与临床上常用的以对硝基苯磷酸酯为底物的比色法相比，本实验方法具有良好的准确度和精密度。 一、pH对酶的影响

酶的化学本质是蛋白质，具有两性电解质的性质，在一定溶液中可以发生解离作用。酶在水溶液环境中的解离状态和行为，都受到H+的影响。酶活性中心功能基团的解离状态随着溶液的pH值改变而改变，因此，溶液的H+浓度对酶催化反应的速度有明显的影响，而且其影响机理非常复杂。这是因为在酶分子的活性部位上具有很多的酸性或碱性氨基酸的侧链基团，它们可随着pH的变化而发生解离，并属于不同的正负高价离子或等电荷状态，它们将直接影响到酶的活化以及酶与底物的亲和力。有些酶需要高浓度的氢离子才能活化，例如胃蛋白酶原只有在pH 1.8左右时才可以活化为胃蛋白酶。绝大多数酶类都可以因酶分子表面极性基团的解离而改变酶活性部位的原有构象，或改变辅酶、辅基或活化因子的结合，从而导致酶催化反应速度的变化，另一方面，pH亦影响到酶促反应的进行。总之，pH是决定酶催化活性的重要参数之一，pH变化能使酶活力提高或下降。在生理生化反应中，我们可以通过调控pH值，提高某种酶的活力，而降低其他酶的干扰作用。在工业生产上，特别是利用大型生物反应器时，调控反应系统的pH以控制酶活力往往是生产成败的关键。因此，研究pH对酶促反应的影响是探讨酶催化作用机理的重要手段之一。

不同的酶，氨基的组成不同，则酶分子中可解离的基团性质不同，这些基团随着pH的变化可以处于不同的解离状态，侧链基团的不同解离状态即可以影响底物的结合和进一步的酶催化反应、也能影响酶的空间构象，从而影响到酶的催化活性。pH对酶活性的影响主要有以下几个方面：

1．过酸或者过碱都可以使酶的空间结构破坏，而引起酶的变性，导致酶活力的下降。这种酸碱的失活作用一般有两种情况，可逆的失活和不可逆的失活。当适当地改变溶液的pH值，酶活力可以恢复的为可逆的失活（reversible inactivation），否则，为不可逆的失活(irreversible inactivation)。

2．酸或碱影响酶活性中心结合基团的解离状态，使得底物不能和酶结合。 3．酸或碱影响酶活性中心催化基团的解离状态，使得底物不能被酶催化成产物。 4．酸或碱影响底物的解离状态，或者使底物不能与酶结合或者结合后不能生成产物。 由于上述种种原因，每种酶对于某一特定的底物，在一定的pH值下，均具有最大的反应速度值，或者说具有一个最高的酶活力，这一特定的pH值，就是该种酶的最适pH值（Optimum pH）。

最适pH值不是酶的一个物理特征常数，它随着温度，所催化底物的种类以及缓冲液的特性和离子强度等综合因素的改变而有所变化，应给予足够的重视。不同的酶，表面构象各有特点，其发挥作用的pH范围有差异，其最适pH的范围也不相同。有的酶要求偏酸环境，例如哺乳动物胃蛋白酶和捕蝇草的蛋白酶作用的pH在1.2-2.5，最适pH为1.8，相当于0.1 mol/L HCl的酸强度。有的酶要求偏碱的环境，例如碱性磷酸酶作用的pH在9-11，最适pH为10.1。总之，各种酶有各自固有的作用pH范围，有各自的最适pH值。同工酶的最适pH值也可以有很大的差别，如同一物种所产生的磷酸酯酶，酸性酶的最适pH值为4.5，与碱性酶的最适pH值相差将近6。同物种的同性质酶最适pH值也可以有差别，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶的最适pH值与胃蛋白酶的最适pH值相差也达5~6。