DNA测序仪的原理

DNA测序仪的原理

原理：

（一）双脱氧链末端终止法测序原理 （二）新生链的荧光标记原理 （三）荧光标记DNA的检测原理 （一）、Sanger等人: 双脱氧链末端终止法

双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，将延伸的DNA链特异性地终止。

其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组，每组按一定比例加入一种(ddNTP)，它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。

与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。

（二）、新生链的荧光标记原理

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多色荧光标记法--荧光标记引物法 定义：

将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端

一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同。 多色荧光标记法--荧光标记终止底物法 定义：

将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料

经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息。 （三）、荧光标记DNA的检测原理

测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多数产物均为单链 反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳

两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口

由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，

在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光

代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同

整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所

步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理

有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合

经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来

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