第３１卷第５期 ２０１３年ｌＯ月 科学版） 上海交通大学学报（农业 （ＡＧＲＩＣＵＩ ＴＵＲＡＩ ＳＣＩＥＮＣＥ） ＪＯＵＲＮＡｌ ＯＦ ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＩＡ（）ＴＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏ１．３１ Ｎｏ．５ （）ｃｔ．２Ｏ１３ 文章编号：１６７１ ９９６４（２０１３）０５—００１６ Ｏ４ Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１—９９６４．２０１３．０５．００４ 纳豆芽孢杆菌ｒｏｃＧ基因和 黄基因敲除载体的构建 蓓，吴旭蕾，钱炳俊 张建华 ２００２４０） （ｉｘ海交通大学农业与生物学院，上海 摘要：ｒｏｃＧ基因和ｕｒｅ基因分别编码纳豆芽孢杆菌中２个与产氨相关的酶一一谷氨酸脱氢酶编 码和尿素酶。为构建这２个基因的敲除载体，通过ＰＣＲ分另ｔｌ获得了２个靶基因的上下游旁邻片段 和抗性筛选基因ｎｉｓＩ。将上游旁邻片段、ｎｉｓＩ和下游旁邻片段按次序克隆到革兰氏阳性菌基因组 整合质粒ｐＭＵＴＩＮ４ ｑ－。限制性内切酶酶切图谱分析及测序结果显示成功构建了纳豆芽孢杆菌 ｒｏｃＯ基因和 ｒＰ基因的敲除载体ｐＭＵＴＩＮ４一ｒｏｃＧ：：ｎｉｓＩ和ｐＭＵＴＩＮ４一ｕｒｅ：：ｎｉｓＩ。该质粒的构建， 为同源重组获得低产氨纳豆芽孢杆菌工程菌株奠定了基础。 关键词：纳豆芽孢杆菌；ｒｏｃＧ；ｕｒｅ；基因敲除载体 中图分类号：Ｔ￥２０１．３ 文献标识码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｃｋ—Ｏｕｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｒｏｃＧ Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｕｒｅ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｎａｔｔｏ ＨＬ，ＡＮＧ Ｂｅｉ，ＷＵ Ｘｕ—ｌｅｉ，ＱＪＡＮ Ｂｉｎ－ｊｕｎ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ ｈｕａ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｒｏｃＧ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｕｒｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｅ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＤＨ）ａｎｄ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｐｌａｙ ｋｅｙ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ａｍｍｏｎｉａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ，ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｎｉｓＩ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＵＴＩＮ４，ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ ｇｅｎｏｒｎｉｃｓ．Ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｕｐｓｔｒｅａｍ。ｎｉｓＩ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐＭＵＴＩＮ４一ｒｏｃＧ：：ｎｉｓＩ ａｎｄ ｐＭＵＴＩＮ４一ｕｒｅ：：ｎｉｓ１ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． Ｔｈｅｓｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ＧＤＨ ｏｒ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ ｍｕｔａｎｔ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｍｍｏｎｉａ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｎａｔｔｏ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｎａｔｔｏ；ｒｏｃＧ；ｕｒｅ；ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｖｅｃｔｏｒ 纳豆是以大豆为原料，用纳豆芽孢杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｎａｔｔｏ）发酵而成的功能性食品。 纳豆在发酵过程中产生了丰富的纤溶蛋白酶 纳 豆激酶（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ），其分子量小，无免疫原性，能 抑制血栓形成，且溶血栓作用强。该酶抗胰酶水解， 收稿日期：２０１２ １２ １１ 在肠道中稳定性好，既可静脉给药，又可口服Ⅲ。因 此，纳豆可有效预防心血管疾病。 然而，纳豆发酵过程中产生的氨臭味，严重影响 了其风味和我国消费者对产品的接受度。张建华 等 从商品纳豆中分离获得ｌ株纳豆激酶活性高的 基金项目：国家自然基金项目（３１１７１７３７） 作者简介：黄倍（１９８８一），女，硕士生，研究方向：食品微牛物，Ｅ ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｂｅｉ．１９８８＠１６３．ｃｏｒｎ； 张建华（１ｇ６８＿）为本文通讯作者，男，Ｉｇ￣，副研究员，研究方向：食品微生物，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｉｈ＠ｓｉｔｕ．ｅｄｕ・ＣＩＡ 第５期 黄蓓，等：纳豆芽孢杆菌ｒｏｃＧ基因和ｕｒｅ基因敲除载体的构建 １７ 纳豆芽孢杆菌（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２８０１），但在其发酵的 纳豆产品中产氨量为３４７．７±２４．３１ ｍｇ／ｋｇ。 １．１．１ 菌株、质粒、培养基和生长条件 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭｌＯ９，纳豆芽孢 杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｎａｔｔｏ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２８０１由 微生物代谢产氨主要有３种途径：脱羧作用、脱 氨基作用和转氨作用。本课题组的前期研究表明， 纳豆芽孢杆菌代谢产氨的主要途径不是脱羧作用， 本实验室保存，ｐＭＤＴＭ１９一Ｔ载体购自Ｔａｋａｒａ，质粒 ｐＭＵＴＩＮ４由法国微生物遗传实验室Ｖａｌｉｒｉｅ Ｖａｇｎｅｒ教授惠赠。抗性筛选基因ｎｉｓＩ模板 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．１ａｃｔｉｓ ＣＶ５ ６由中科院微 生物研究所钟瑾老师惠赠。 大肠杆菌ＪＭ１０９、纳豆芽孢杆菌和Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ 而是联合脱氨基作用和转氨作用ｌ＿３］。纳豆芽孢杆菌 分泌的多种酶可以将大豆蛋白质降解为多肽以及游 离氨基酸［４］，在ｒｏｃＧ基因编码的谷氨酸脱氢酶 （ＧＤＨ）的作用下，氨基酸进一步发生氧化脱氨基作 用，产生氨ｌ５］。在Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８标准菌株中 已经鉴定出至少有２个基因ｒｏｃＧ和ｇｕｄＢ编码 ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．１ａｃｔｉｓ ＣＶ５６常规培养用ＬＢ培养基， ３７℃培养。氨苄青霉素在Ｅ．ｃｏｌｉ培养基中的浓度 为１００ ｔｌｇ／ｍＬ。 １．１．２主要试剂盒材料 ＧＤＨ，但只有ｒｏｃＧ编码具有活性的ＧＤＨ，催化脱 氨反应；ｇｕｄＢ编码的蛋白质被插入了３个氨基酸 残基而变成了没有活性的ＧＤＨ＿６］。此外，由ｕｒｅ 限制性内切酶ＨｉｎｄｌＩＩ，ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＢａｍＨＩ和 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ生物公司；ＤＮＡ 编码的尿素酶降解蛋白质代谢产物尿素也是产生氨 的途径之一。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８标准菌株中已经 鉴定出有活性的尿素酶。Ｓｈｉｇｅｋｉ Ｋｅｄａ等［５ 研究发 现，ｒｏｃＧ基因和ｕｒｅ基因是纳豆菌代谢途径中产氨 的关键基因。 聚合酶ＴａＫａＲａ ＴａｑＴＭ购自ＴａＫａＲａ生物公司；小 量质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，ＤＮＡ纯化试剂 盒，ｄＮＴＰ和ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ均购自上海生工生物公 司；引物（见表１）由上海生工生物公司合成；其他化 学试剂均为分析纯，购自国药集团。 １．２纳豆芽孢杆菌基因组ＤＮＡ的提取 张晓敏ｒ７］和关茵等ｌ８］通过优化纳豆生产工艺中 的碳氮比、发酵时问、接种量等条件来获得气味和口 感良好的纳豆。然而要从根本上解决氨臭味这个问 题，改善纳豆的品质，必须改造纳豆芽孢杆菌的代谢 参照《分子克隆实验指南》中革兰氏阳性菌的基 因组ＤＮＡ提取步骤进行ｌ９］。 １．３ ｒｏｃＧ和ｕｒｅ基因旁邻序列和ｎｉｓＩ基因ＰＣＲ 途径，消除其在二次发酵过程中的产氨能力。本研 究中，我们设计和构建了纳豆芽孢杆菌ｒｏｃＧ基因及 ｕｒｅ基因的敲除载体，为利用同源重组机制构建低 产氨纳豆芽孢杆菌工程菌株奠定了基础。 引物设计与克隆 根据枯草芽孢杆菌标准菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８全基因组序列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＡＬ００９１２６）及ｎｉｓＩ基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： １材料与方法 １．１试验材料 Ｘ７６８８４），用ｐｒｉｍｅｒ ５．０设计引物并引入相应的酶 切位点（表１）。 表１引物序列及引入的酶切位点 Ｔａｂ．１ Ｐｆｉｍｅ￣ａｎｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ＴＡ ｃｌｏｎｅ 上海交通大学学报（ａ－业科学版） 第３ｌ卷 分别以ＢａｃｉＬｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｎａｔｔｏ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２８０１和Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．１ａｃｔｉｓ ＣＶ５６的基 因组ＤＮＡ为模板，采用ＰＣＲ技术进行目的片段克 隆，反应条件如下：ｒｏｃＧ基因５ 旁邻片段６Ｏ℃退 火，３ 旁邻片段５５℃退火，ｕｒｅ基因５ 旁邻片段和 ３ 旁邻片段均为５２℃退火，ｎｉｓＩ片段５８．５℃退 火；均为７２。Ｃ延伸１ ｍｉｎ。获得ｒｏｃＧ、ｕｙｅ基因旁 邻片段及ｎｉｓＩ片段，经酶切鉴定正确后，用胶回收 试剂盒回收纯化产物。 将上述纯化的靶基因旁邻片段及ｎｉｓＩ片段分 别与ｐＭＤＴＭ１９一Ｔ载体连接，转化感受态ＪＭ１０９，涂 布氨苄青霉素（１００／￣ｇ／ｍＬ）抗性ＬＢ平板，３７℃培 养１２ ｈ。挑取单菌落增菌培养，提取质粒进行限制 性内切酶图谱分析和ＤＮＡ测序验证。正确的重组 质粒分别命名为Ｔ－ｒｏｃＧ－ｕｐ、Ｔ－ｒｏｃＧ－ｄｏｗｎ、Ｔ－ｕｒｅ— ｕｐ、Ｔ－ｕｒｅ—ｄｏｗｎ和Ｔ－ｎｉｓＩ。 １．４敲除载体的构建与鉴定 质粒Ｔ－ｒｏｃＧ－ｕｐ和Ｔ－ｕｒｅ—ｕｐ经限制性内切酶 Ｈ ｄＩＩＩ和ＮｏｔＩ消化后，得到ｒｏｃＧ和ｕｙｅ基因上游 旁邻片段，克隆至质粒ｐＭＵＴＩＮ４的ＨｉｎｄＩＩＩ和 ＮｏｔＩ克隆位点之间，转化感受态ＪＭ１０９，挑取氨苄 青霉素（１００￣ｇ／ｍＬ）抗性菌落增菌培养，提取质粒 进行限制性内切酶图谱分析。正确的重组质粒分别 命名为ｐＭＵＴＩＮ４一ｒｏｃＧ－ｕｐ、ｐＭＵＴＩＮ４一ｕｒｅ—ｕｐ。 下游旁邻片段经ＮｏｔＩ和ＢａｍＨＩ消化，ｎｉｓＩ片 段经ＸｈｏＩ和Ｎｏ Ｉ消化，得到的ＤＮＡ片段按上述 方法克隆至对应的过渡载体，经氨苄青霉素（１００ ＃ｇ／ｍＬ）平板筛选后得到敲除载体，经测序验证序 列正确。并命名为ｐＭＵＴＩＮ４一ｒｏｃＧ：：ｎｉｓＩ和 ｐＭＵＴＩＮ４一ｕｒｅ：：ｎｉｓＩ。 ２结果与讨论 ２．１ 上下游旁邻片段及ｎｉｓｌ片段的ＰＣＲ扩增和克 隆 敲除载体包括载体骨架、靶基因旁邻片段及选择 性标记基因等，其中旁邻片段碱基错配率和长度是决 定同源重组频率的关键因素。Ｔｈｏｍａｓ研究表明，当 载体同源臂长度从４ ｋｂ增加至９ ｋｂ时，基因打靶效 率增加１０倍。与此同时，非同源重组频率增加４０ 倍［１。］。当同源臂长度在２９５ ｂｐ～１．８ ｋｂ之间时，重 组频率与同源臂长度呈正比ｌ１ ，当同源臂长度在２００ ｂｐ以下时，同源重组频率明显降低ｌ１ 。综合考虑敲 除载体的大小对电转化的影响，在ｒｏｃＧ和ｕｒｅ基因上 下游１ ０００ ｂｐ范围内寻找７００ ９００ ｂｐ的旁邻序列 进行ＰＣＲ扩增，得到长度分别为９４４ ｂｐ和６６７ ｂｐ的 ｒｏｃＧ基因的上下游旁邻片段，和长度分别为７４４ ｂｐ 和９３１ ｂｐ的ｕｒｅ基因的上下游旁邻片段。 基于食品级工程菌株的考虑，在同源序列内部 引入抗性筛选基因ｎｉｓＩ，该抗性标记需要Ｎｉｓｉｎ的 选择压力。Ｎｉｓｉｎ作为一种天然生物活性抗菌肽， 能够有效抑制或杀死具有食品腐败作用的革兰氏阳 性菌，并且食用后在消化道中很快被蛋白水解酶消 化成氨基酸，安全无副作用，与合成防腐剂相比有显 著优势ｌ＿１ 。因此敲除载体中的ｎｉｓＩ不仅能在同源 重组的过程中作为抗性筛选基因，获得ｒｏｃＧ基因和 ｕｌ＂ｅ基因缺失的纳豆芽孢杆菌，而且在工程菌发酵 生产纳豆时可通过定量添加Ｎｉｓｉｎ，提高其防腐能 力，延长货架期。 对重组质粒Ｔ－ｒｏｃＧ－ｕｐ、Ｔ－ｒｏｃＧ－ｄｏｗｎ、Ｔ—ｕＹｅ— ｕｐ、Ｔ－ｕｒｅ—ｄｏｗｎ和Ｔ－ｎｉｓＩ进行限制性内切酶图谱 分析，酶切片段大小与理论值基本符合（图１）。对 上述片段进行ＤＮＡ测序，并用Ｂｌａｓｔ软件对测序结 果进行同源性比较，结果显示ｒｏｃＧ基因上下游旁邻 片段与Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８相应序列同源性分别为９８ 和９９ ，ｕｒｅ基因上下游旁邻片段与Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ 相应序列的同源性分别为９５ 和９９ ，ｎｉｓＩ基因的 同源性为１００ 。 ３ ０００—— ２ ０００—— １ ０００＋ ７５０—’ 图１抗性筛选基因ｎｉｓＩ ＴＡ克隆双酶切鉴定 Ｆｉｇ．１ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＡ ｃｌｏｎｅ ｆｏｒ ｎｉｓＩ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｍ：ＤＮＡ ｍａｋｅｒ（ＤＩ １０ ｋｂ）；１：ｐｌａｓｍｉｄ ｎｉｓｌ Ｔ；２：ｎｉｓＩ Ｔ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ ２．２敲除载体的构建与鉴定 Ｖａｌｉｒｉｅ Ｖａｇｎｅｒ等 Ｍ 构建的ｐＭＵＴＩＮ４质粒具 有如下特征：具有ＣｏｌＥ ｌ启动子，可以在大肠杆菌 中正常复制，但由于枯草芽孢杆菌中缺乏功能性蛋 白ｐｉ，必须整合到宿主细菌染色体上才能进行复制；