一 目的要求
1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法 2、了解抗生素的抗菌谱
二 实验原理
抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。
由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。而且当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。
三 实验器材
1、菌种 枯草杆菌、大肠杆菌。 2、培养基 MH（Mueller-Hintion）琼脂。 3、试剂 青霉素、链霉素。
四 方法步骤
1、无菌滤纸片 以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。
2、抗生素溶液制备 将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。
3、指示菌悬浮液的制备 枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。
4、混菌平板制备 取批示菌细胞悬浮液1mL加入无菌培养皿内，再加入温度为43~45℃的PDA培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基20mL，立即振荡使细胞与培养基混合均匀，静置冷凝。
5、平板加抗生素溶液 将滤纸片在抗生素溶液中充分浸泡2min以上，然后将纸片放于混菌平板上，每皿呈三角形放3点，每点贴放纸片2张。
6、培养与观察 将平板放于33℃左右的温度培养，每24h测量一次透明抑菌圈直径，共测量3次。
五 结果
1、实验结果
测量每个平板3个抑菌圈直径，计算每次测量各平板3个抑菌圈直径的平均值，结果填于表内。
表1 青霉素 对供试菌的抑菌效果（抑菌圈直径：mm）
培养时间
菌种名
24
表2 链霉素 对供试菌的抑菌效果（抑菌圈直径：mm）
培养时间
菌种名
24
2、结果分析
48
96
120
144
168
48
96
120
144
168
1 菌液制备
1）对数生长法：从琼脂平板上选取至少3~5个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含4~5ml的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，35℃培养2~6h。用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于麦氏标准。
2）直接菌落法：从培养18-24h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成麦氏标准浊度的悬液。 2 接种
细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。 3 贴药敏纸片
涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。 4 培养
将平板倒置放入35℃孵箱（厌氧菌敏平板应放置于5%~10%CO2环境中），16~18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须培养24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。 5 结果判断
抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。根据CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生素是敏感、中介还是耐药，如下图。
敏感（S）：表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。 中介（I）：不是敏感性的度量，而是一个“缓冲区”，用以防止因微小的技术因素失控导致的结果偏差，因而其临床意义是不确定的，故不应作临床报告。
耐药（R）：表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。
五、结果与思考题
1、记录各菌对不同药物的敏感程度 2、思考题
（1）圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项 （2）试述药敏试验的意义
实验十二 细菌对抗生素的药物敏感试验
各种微生物对化学药物、抗生素等敏感性各异，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生耐药性变异。因此，测定细菌对药物的敏感程度，对于临床治疗中选择用药，及时控制感染具有重要意义。 常用方法有纸片弥散法和试管稀释法。 实验目的 一、纸片法 材料
1．菌种：枯草杆菌、大肠杆菌。 2．培养基：普通琼脂平皿培养基。 3．抗菌药物：青霉素、链霉素 、氯霉素、庆大霉素纸片。
4．其他：无菌棉棒、镊子、酒精缸等。 方法
1．用灭菌棉棒分别沾取金黄色葡萄球菌1号和2号及痢疾杆菌肉汤培养物，分别涂布在琼脂表面，每种菌涂一个平皿(沾菌棉棒用后，放入消毒缸中，勿乱丢)。
2．用小镊子沾酒精烧灼消毒，待冷后镊取一种药物纸片，贴在涂有细菌的平皿上，然后将镊子再沾酒精烧灼后，镊取另一种药物纸片，贴布于琼脂平皿另一处，如此将几种药物纸片贴完，各纸片距离要大致相等。
3．将已做好的药敏琼脂平皿，置37℃培养18～24小时，观察各药物纸片的抑菌效果。即观察药物纸片周围有无抑菌圈，如有，在平皿底面用尺量其直径大小，测定药物敏感程度。各种抗生素抑菌圈直径与敏感标准见表12-1。
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