(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105886620 A(43)申请公布日 2016.08.24
(21)申请号 201610269890.5(22)申请日 2016.04.27
(71)申请人 清华大学
地址 100084 北京市海淀区100084-82信箱(72)发明人 任大海 王斌 尤政
(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人 黄家俊(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图2页
(54)发明名称
用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的纳米探针(57)摘要
本发明公开了属于核酸检测技术领域的一种用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的纳米探针。所述纳米探针包括穿透肽、量子点、捕捉探针、报告探针和纳米金颗粒；其中，量子点作为供体与捕捉探针相连，纳米金颗粒作为受体与报告探针相连，捕捉探针与报告探针通过部分碱基互补配对，形成能量转移供受体对；穿透肽与量子点相连，修饰能量转移供受体对；所述捕捉探针能与目标mRNA完全互补配对。所述纳米探针能高效地进入细胞，且抗光漂白性能强。将多种纳米探针导入到活细胞内，能对活细胞内的多种mRNA含量进行实时并行检测，为更加全面地了解细胞中不同基因的表达水平以及不同基因之间的相互影响提供保障。
CN 105886620 ACN 105886620 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的纳米探针，其特征在于，所述纳米探针包括穿透肽(1)、量子点(2)、捕捉探针(3)、报告探针(4)和纳米金颗粒(5)；其中，量子点(2)作为供体与捕捉探针(3)相连，纳米金颗粒(5)作为受体与报告探针(4)相连，捕捉探针(3)与报告探针(4)通过部分碱基互补配对，形成能量转移供受体对；穿透肽(1)与量子点(2)相连，修饰能量转移供受体对；所述捕捉探针(3)能与目标mRNA完全互补配对。
2.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述量子点(2)的表面用链霉亲和素修饰。
3.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述纳米金颗粒(5)的直径为2nm-15nm。
4.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述量子点(2)与纳米金颗粒(5)的物理距离不大于20nm。
5.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述捕捉探针(3)的结构为biotin-5’-(A,T,C,G)m-3’；其中，biotin为用于偶联量子点(2)的生物素，5’-(A,T,C,G)m-3’提供捕获目标mRNA的配对区域，20≤m≤25。
6.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述报告探针(4)的结构为5’-(A,T,C,G)n-3’-SH；其中，-SH为用于偶联纳米金颗粒(5)的巯基，5’-(A,T,C,G)n-3’提供与捕捉探针(3)配对的区域，15≤n≤18。
7.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述的穿透肽(1)为细胞生长因子EGF，一端用生物素修饰。
8.权利要求1-7任一项所述的纳米探针用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的方法，其特征在于，用不同发射波长的量子点(2)分别与面向多个目标mRNA的不同序列的捕捉探针(3)结合，得到针对不同目标mRNA的多种纳米探针；将得到的针对不同目标mRNA的多种纳米探针导入到活细胞内，在同一种波段的激发光下，不同的纳米探针所发出的荧光的颜色不同；用共聚焦显微镜、荧光显微镜或荧光分光光度计，检测不同颜色荧光信号的变化，即可对活细胞内的多种mRNA含量进行实时并行检测。
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说 明 书
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用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的纳米探针
技术领域
[0001]本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的纳米探针。
背景技术
[0002]基因是遗传变异的物质基础，支配着生命的基本构造和性能。基因的序列分析是其研究中最直接的、最重要的组成部分，也是进一步改造基因的基础。传统的基因分析针对群体细胞，其结果只是细胞群体信号的平均值或其中占优势数量的细胞信息。即使来源相同的单个细胞，由于随机的生物过程和环境扰动等原因，彼此在许多方面也存在差异，即细胞存在异质性。与现有基因测序技术相比，单细胞测序技术不仅有助于认识细胞异质性，而且还能检测到微量的基因表达子或者罕见非编码RNA，也可以用于寻找新的细胞类型、进行细胞亚型鉴定等领域。而在单细胞层面进行核酸的准确高通量检测是单细胞测序技术的基础工作。
[0003]mRNA是携带遗传信息的基因与执行生命活动的蛋白质之间沟通的桥梁，是细胞表型和功能的传递者。细胞内mRNA的含量直接反映了该细胞对应基因的表达情况，而细胞异质性的生物学本质即是基因的表达差异或突变基因的表达，因此对细胞内mRNA的检测和研究是生物医学研究的重要领域。[0004]2005年，美国约翰霍普金斯大学的Zhang等开发了一种基于量子点和Cy5染料的夹心式发光探针，能够用来测定核酸的含量，遗憾的是，该检测需要复杂的细胞核提取等预处理过程，不能应用于活细胞的检测。2010年，韩国科学技术院的Taejoon等人利用目标DNA单链将纳米金颗粒和金纳米线连接起来，并观察到表面拉曼增强效应(SERS)，实现了对多种病原体核酸的并行检测，但该方法的材料合成过程繁琐，对纳米线的操作困难，且拉曼光谱检测设备较为昂贵。2014年，德国的Michaelis等人利用核酸分子杂交前后荧光分子的连接位置的改变实现荧光共振转移效率的变化，从而检测目标核酸分子的含量，然而该检测过程是在细胞外进行的，难以实现多种核酸的并行检测。[0005]核酸扩增技术是核酸检测的传统方法，具有灵敏度高、样品纯度要求低等优点，但是核酸扩增的过程中容易发生假阳性、外源污染、温度控制复杂等问题。实时荧光定量PCR技术可以实现多核酸的并行检测，但是仪器设备价格昂贵、配套资源要求高，且难以应用在活细胞中。核酸可以通过碱基配对特异性连接互补探针，进而根据系统的质量改变、谐振频率偏移、表面拉曼增强等效应对目标核酸进行检测，但是其灵敏度较低、偶联物复杂、过程繁琐，难以取得实用。另外，现有的纳米探针，例如分子信标技术，用于胞内检测时存在假阳性干扰，稳定性不足，对细胞毒性较大，且灵敏度、速度、通量等方面均有待进一步提高，目前难以用于单细胞核酸并行检测。同时目前基于荧光检测mRNA等核酸的成熟方法，采用荧光蛋白或有机染料，都面临荧光漂白的问题。荧光强度自身漂白很快，一方面会给检测结果带来很大误差，同时也不能够长时间检测。[0006]如果需要更加整体、准确地了解不同基因在细胞内部的表达、含量变化、物理空间
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说 明 书
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位置变化，单独分析一种mRNA往往是不够的。细胞作为一个生命体，其中各种物质往往同时发生作用，相互影响，相互调节。如癌细胞生长信号的表达和运输，通常不是单独发生作用，而它们是何时发生作用的，又是以怎样的顺序发生作用的，这些问题的答案都是目前的检测方法无法给出的。有些mRNA只在细胞生理周期的某个阶段表达，而目前的检测方法也无法监测mRNA的这种瞬态活性变化。[0007]综上，实现长时间实时并行检测活细胞内多种mRNA的含量很有必要，也具有广泛的应用前景。
发明内容
[0008]本发明的目的在于提供一种用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的纳米探针，采取的技术方案如下：
[0009]一种用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的纳米探针，所述纳米探针包括穿透肽1、量子点2、捕捉探针3、报告探针4和纳米金颗粒5；其中，量子点2作为供体与捕捉探针3相连，纳米金颗粒5作为受体与报告探针4相连，捕捉探针3与报告探针4通过部分碱基互补配对，形成能量转移供受体对；穿透肽1与量子点2相连，修饰能量转移供受体对；所述捕捉探针3能与目标mRNA完全互补配对。
[0010]所述量子点2的表面用链霉亲和素修饰。[0011]所述纳米金颗粒5的直径为2nm-15nm。
[0012]所述量子点2与纳米金颗粒5的物理距离不大于20nm。[0013]所述捕捉探针3的结构为biotin-5’-(A,T,C,G)m-3’；其中，biotin为用于偶联的量子点2的生物素，5’-(A,T,C,G)m-3’提供捕获目标mRNA的配对区域，20≤m≤25。[0014]所述报告探针4的结构为5’-(A,T,C,G)n-3’-SH；其中，-SH为用于偶联纳米金颗粒5的巯基，5’-(A,T,C,G)n-3’提供与捕捉探针3的配对区域，15≤n≤18。[0015]报告探针中C、G碱基的数目较少，因此报告探针4与捕捉探针3形成的dsDNA具有较低的退火温度(35-40℃)，在室温下(25℃)反应时竞争性偶联的效率较高。[0016]报告探针4的碱基数目少于捕捉探针3，碱基数差基本上决定了供受体间距。碱基数差过大，供受体之间的能量转移效率将变低；而碱基数差过小，报告探针4与捕捉探针3形成的配对区域不容易被目标mRNA接触，产生空间位阻效应，竞争性偶联效率较低。[0017]所述的穿透肽1为细胞生长因子EGF，一端用生物素修饰，以结合在量子点2的表面。
[0018]用光源激发量子点2，当纳米探针没有接触到目标mRNA时，量子点2吸收的光能不以光子的形式发射出去，不具有发光特性；当纳米探针与目标mRNA接触后，目标mRNA取代报告探针4偶联于捕捉探针3上，量子点2恢复发光特性。
[0019]所述的纳米探针用于活细胞内多种mRNA含量实时并行检测的方法为：用不同发射光谱的量子点2分别与面向多个目标mRNA的不同序列的捕捉探针3结合，得到针对不同目标mRNA的多种纳米探针；将得到的针对不同目标mRNA的多种纳米探针导入到活细胞内，在同一种波段的激发光下，在同一种波段的激发光下，不同的纳米探针所发出的荧光的颜色不同；用共聚焦显微镜、荧光显微镜或荧光分光光度计，检测不同颜色荧光信号的变化，对活细胞内的多种mRNA含量进行实时并行检测。
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说 明 书
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本发明的有益效果为：所述纳米探针能高效地进入细胞，进入方式不会对细胞产
生伤害；抗光漂白性能强，能够在长达一个月的时间内检测活细胞内mRNA含量。将针对不同目标mRNA的多种探针导入到活细胞中，能够实现活细胞内多种mRNA含量的长时间实时并行检测。检测结果能够反映出mRNA在细胞内的分布，并实时反映出各目标mRNA转录合成的时间，以及细胞中不同基因表达水平的差异，为更加全面地了解细胞中不同基因的表达水平以及不同基因之间的相互影响提供保障。
附图说明
[0021]图1为所述探针的结构示意图；其中，1-穿透肽，2-量子点，3-捕捉探针，4-报告探针，5-纳米金颗粒。
[0022]图2为所述探针的能量转移示意图。
[0023]图3为目标mRNA竞争性取代报告探针的示意图。
具体实施方式
[0024]本发明可用于活细胞内多种mRNA含量的长时间实时并行检测。下面结合附图和实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。[0025]K-ras基因是RAS基因家族成员之一，与肿瘤的生成、增值、迁移、扩散以及血管生成均有关系，在肿瘤细胞中常发生突变；survivin具有肿瘤特异性，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关，survivin基因在常见的肿瘤细胞中均有表达。设计出本发明中的相应纳米探针，即可对肿瘤细胞中涉及到的多种基因转录的产物mRNA进行并行检测。[0026]实施例1
[0027](1)原料的准备
[0028]取1pmol量子点QD605(CdSe/ZnS量子点，发射波长为605nm)，在每个量子点的外围连接4-8个链霉亲和素；
[0029]纳米金颗粒的数量为链霉亲和素数量总结合位点个数的5-10倍；一个链霉亲和素的可用结合位点为3个，所以纳米金颗粒的数量为链霉亲和素的15-30倍，试验中取直径为2nm的纳米金颗粒；
[0030]设计并合成捕捉探针、报告探针和穿透肽，合成的针对K-ras基因和survivin基因的探针序列如表1所示。其中，报告探针中带下划线的部分代表报告探针末端的非配对碱基，在报告探针末端设置2-3个非配对碱基可以增强竞争性偶联的效率；待测基因序列中带下划线的部分为靶向序列区。[0031]表1：针对K-ras基因和survivin基因的探针序列
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说 明 书
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(2)纳米金颗粒-报告探针的合成
[0034]首先将纳米金颗粒和3’端修饰有-SH的报告探针通过Au-S键偶联结合；为保证每个纳米金颗粒都能和报告探针连接，报告探针需过量，一般报告探针的分子数为纳米金颗粒的2-10倍；
[0035]将300pmol的报告探针与160pmol的纳米金颗粒混合，加入PBS缓冲液，使最终反应体积为300ul；然后在4℃环境下反应24h，无需搅拌；反应结束后，将反应液转移到容量为500ul、截留分子量为10K的超滤离心管中，调节离心机的转速为6000r/min，离心20min，重复两次，去除未与纳米金颗粒结合的报告探针，得到约20ul的“纳米金颗粒-报告探针”溶液；反应中采用的纳米金颗粒的分子量约为15K，报告探针的分子量约为7K，所以用截留分子量为10K的超滤离心管能将未参与反应的报告探针去除。[0036](3)纳米金颗粒-dsDNA的合成[0037]将5’端修饰有biotin的捕捉探针与纳米金颗粒-报告探针以1:1.2的摩尔比混合，室温下反应8h，使捕捉探针与报告探针不完全配对结合成dsDNA，得到40ul“纳米金颗粒-dsDNA”溶液；其中，捕捉探针能与K-ras基因的mRNA完全互补配对。[0038](4)特异性检测K-ras基因转录的mRNA含量的纳米探针的合成
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将100pmol量子点QD605、300pmol穿透肽EGF的混合溶液(1ul)加入到纳米金颗粒-dsDNA溶液中，然后加入PBS缓冲液，形成100ul的反应体系，室温反应45min，让纳米金颗粒-dsDNA、一端连接有生物素的EGF与量子点外围的链霉亲和素充分反应，形成能特异性检测
K-ras基因转录的mRNA含量的纳米探针，其结构如图1所示。
[0040](5)特异性检测survivin基因转录的mRNA含量的纳米探针的合成[0041]构建检测survivin转录的mRNA含量的纳米探针时，只需根据survivin的碱基序列将捕捉探针、报告探针的序列替换；同时为了和K-ras区分，采用的量子点的发射波长为525nm，其它步骤与构建检测K-ras基因转录的mRNA含量的纳米探针的步骤相同。[0042](6)活细胞内K-ras，survivin的mRNA含量的实时并行检测[0043]当纳米探针没有接触到目标mRNA时，纳米探针上的量子点和纳米金颗粒的物理距
用光源激发量子点时，量子点吸收的光能不以光子的离在20nm以内，会发生表面能量转移；
形式发射出去，而是通过电偶极的作用传递给受体纳米金颗粒，如图2所示，此时量子点不具有发光特性；
[0044]当纳米探针与目标mRNA接触后，目标mRNA与捕捉探针的亲和性更强，通过竞争性关系取代报告探针偶联于捕捉探针上，使量子点和纳米金颗粒之间的距离增大，超出能产生能量转移的有效距离，此时用光源激发量子点时，量子点恢复发光的特性，过程如图3所示。
[0045]试验中采用Hela细胞作为检测对象，利用构建的纳米探针对Hela细胞内的K-ras，survivin两种mRNA含量进行实时并行检测。[0046]在96孔板中培养Hela细胞，每孔中加入的细胞个数为5×104个，实验组细胞中加入上述构建的纳米探针，对照组细胞不加入纳米探针；然后采用共聚焦显微镜、荧光显微镜或荧光分光光度计对实验组细胞、对照组细胞进行荧光检测，观察纳米探针的荧光信号变化，根据荧光信号的变化对Hela细胞内的K-ras，survivin两种mRNA含量进行实时并行检测；其中，发射峰为605nm的荧光强度表征K-ras转录mRNA的含量，发射峰为525nm的荧光强度表征survivin转录mRNA的含量。
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说 明 书 附 图
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说 明 书 附 图
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