１１８ 临床肺科杂志２０１３年１月 第ｌ８卷第１期 慢性阻塞性肺疾病动物模型的研究进展 辛亚男 综述郭阳 审校 慢性阻塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）是一种具有气流受限为特征 的肺部疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展。由于肺气 肿和慢性支气管炎密切相关，已经成为ＣＯＰＤ发生的两大主 因。在我国ＣＯＰＤ的患病率，已占４０岁以上人群的８．２％，欧 美国家约为４％一１０％…，ＣＯＰＤ患病率和死亡率均高，死亡 率现已成为全球死亡原因的第４位，且有逐年增加的倾向 。 有报道到２０２０年ＣＯＰＤ将成为世界疾病经济负担的第五位。 因此，如何创建一种制作简便、经济、易行，构建标准化， 并与实际临床特征相符的动物模型十分重要。本文根据 ＣＯＰＤ动物模型近几年的研究进展，对其标准化、致病因素等 进行了相关探讨，并介绍一些研究者常用的ＣＯＰＤ模型。 ＣＯＰＤ动物的选择及其标准化 ＣＯＰＤ动物模型应具有与人类肺内炎症细胞浸润，气道、 肺血管及肺实质损伤为特征的临床改变，并有以不完全可逆 的慢性气道阻塞为特征的肺功能改变。郑鸿翱曾发表报道， 认为理想的ＣＯＰＤ动物模型应符合临床特征：①损伤因素与 诱发临床ＣＯＰＤ常见病因相似②必须存在慢性气道阻塞，小 气道受阻增大，肺动态顺应性降低③或伴有气道高反应性④ 气道重塑。 动物模型不同，适用的造模方法也不同。目前认为，龋齿 类动物模型是制作模型的最佳选择，如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、 比格犬等。豚鼠对烟雾较敏感，是最早用于熏烟模型的，但其 价格相对较高，且无研究分子学的工具和相关蛋白抗体 ， 因而逐步被大鼠，小鼠所替代。 大鼠、小鼠在熏烟造模中经常用到，且具有一定优势 ： ①体形较小、繁殖周期短而数量多、药物使用成本较低②可用 于许多近交繁殖及其突变体并应用相关酶活性抗体和基因探 针③研究者对鼠类生物习性较熟悉④通过研究发现其基因序 列与人类基因序列较为相似，在相关免疫实验中可操控它们 的基因表达。因此，小鼠作为组织学术研究，特别适用于电镜 研究；在做功能研究时，多选用大鼠。但其也有相应的缺点： ①小鼠的呼吸道结构、功能与人类不同②大鼠支气管炎症的 介导物与人类不同，熏烟诱导的肺气肿样损伤的抵抗力又较 强③缺少明确的呼吸性细支气管，因而无法进行小叶中央型 肺气肿的解剖。 ＣＯＰＤ动物模型的判定方法 目前推荐细胞组织病理学和肺功能相结合的方法判定 ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—６６６３．２０１３．０１．０６２ 作者单位：８３００５４新疆乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院 通讯作者：郭阳，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｙｙ￣２００９＠１６３．ｃｏｒｎ ＣＯＰＤ动物模型是否成功。 一、ＣＯＰＤ典型的气道病理表现如下：在中央气道有黏液 分泌腺增大及炎症细胞浸润，黏液分泌增加。在外周气道有 气道壁损伤和修复过程反复发生。纤毛功能失调，出现倒伏、 变短、粘连，部分脱落。再生的上皮杯状细胞增生、并发生鳞 状上皮化生，在终末细支气管黏膜上皮也可见到杯状细胞；黏 膜下腺体增生肥大和浆液性上皮发生粘液腺化生，导致周围 有大量炎细胞浸润，肺内源性蛋白酶和抗蛋白酶失衡，气道平 滑肌增厚；肺泡出现扩张，肺泡壁变薄，并逐步断裂融合成肺 大疱，肺泡数目显著减少。 二、肺功能的测定是判断模型是否出现气流受限的主要 客观指标。通常采用小动物呼吸功能测定仪测定，包括呼吸 频率（ＲＲ）、呼气峰流速（ＰＥＦ）、０．３ｓ用力呼气量（ＦＥＶ０．３）、 肺顺应性（ＣＬ）、气道阻力测定（ＲＡＷ）、分钟通气量（ＭＶＶ）、 潮气量（ＶＴ）、肺总量（ＴＬＣ）、吸气阻力（ＲＩ）、呼气阻力（ＲＥ） 等。 常用的ＣＯＰＤ模型 一、理化因素 １．烟雾吸入法 在环境污染因素中，最重要的危险因素是吸烟。调查显 示我国３５岁以上的男性吸烟率为７４％。 烟草中多种有害 化学物质可直接促使支气管上皮纤毛变短、倒伏或脱落，削弱 肺泡吞噬细胞的吞噬和灭菌作用，为呼吸道感染创造条件，降 低了局部抵抗力，引起气道炎症反应而造成气道损伤，从而形 成ＣＯＰＤ的病理过程。相比吸烟而言，暴露在烟雾中更能促 进ＣＯＰＤ的发展。 沈锋、赵鸣武等 采用熏烟法（都包牌香烟）把大鼠随机 分为被动吸烟４、６、１０周，１．５ｈ／次，２次／ｄ（时间间隔至少６ ｈ）用来观察被动吸烟大鼠在不同时期的气道肺组织病理特 征的变化规律及肺功能改变。实验表明ＣＯＰＤ的形成与吸烟 量及吸烟时间有关，为ＣＯＰＤ动物模型制作提供了有价值的 参考资料。 曹君、陈平等 在此基础上采用自制熏烟箱对Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ 小鼠建立肺气肿模型，１５ ｍｉｎ／次，６支／次，４次／ｄ，持续９０ 天，研究发现所建模型稳定性好，病理生理学观察符合ＣＯＰＤ 的相关特征，与人类ＣＯＰＤ戒烟后，持续肺损害进展相符。 ２．ＳＯ，吸入法 ｓ０ 是空气污染中的有害成分之一，吸入后可引起慢支 及肺气肿。ｓ０：溶于水后形成Ｈ：ｓＯ ，后者可使气道上皮受 损，进一步为细菌感染创造了条件。据资料记载，长期吸入 ｓ０ 气体的大鼠模型，其终末细支气管和大气道分泌粘液性 临床肺科杂志２０１３年１月 第１８卷第１期 物质，粘液腺体肿大且细胞化生。许建英等研究者在早年采 用长期吸入高浓度ｓ０ 气体的方法（２５０×１０～，５ ＩＶｄ，５ ｄ／ Ｗ，共７ Ｗ）建立模型，实验结果显示：其建立的模型符合ＣＯＰＤ 的病理学特征及肺功能改变。后有学者在此基础上研究认 １１９ 现了与人ＣＯＰＤ炎症和肺部相似的病理改变。在我国，马楠 首次将ＬＰＳ注入气管，他参照国外一些研究者的方法，成功 塑造了大鼠慢性支气管炎模型，且研究发现其符合ＣＯＰＤ的 病理改变。 为：此类模型若用于ＣＯＰＤ的研究，需提前测定反映气流阻塞 的指标。 ３．ＮＯ，吸入法 最近，刘君波，黄梦珊 等向模型组大鼠气管内注入２００ ｇ脂多糖，向正常对照组气管内滴入等量生理盐水，每周１ 次，持续８周。肺功能测定及肺组织病理学检查发现：模型组 大鼠气道阻力明显升高，肺动态顺应性显著下降；光镜下可见 病变呈慢支及肺气肿样改变。可见，气管、支气管及肺组织病 ＮＯ：也是烟雾中的重要成分之一。有报道指出：地鼠若 长期吸入ＮＯ ，可促使小气道炎性细胞浸润、黏液分泌增加， 已至上皮坏死、肺组织内弹性纤维明显减少。Ｌａｍ等让哺乳 期地鼠从出生后３天到１３天内吸入ＮＯ：，观察到地鼠在１岁 时会出现肺气肿特征，与对照组相比，其肺体积及肺泡平均内 衬面积明显增大。但若让地鼠从出生后２１天到３１天期间吸 人ＮＯ ，则在１岁时无肺气肿病变。因为动物常常需要连续 ２３ ｈ／ｄ吸人ＮＯ２，持续至少３周以上，才有可能产生ＣＯＰＤ，因 而使用成年动物来造模则较难。因此，我们现在认为ＮＯ：诱 导ＣＯＰＤ与动物的生长年龄阶段有关。 ４．其他方法 研究人员使用氯化镉（ＣａＣＬ：）诱导和高浓度氧吸入诱发 肺气肿模型，但效果均不如以上两种。其次，高浓度吸氧， ＮＨ３ Ｈ２ Ｏ，ＣＬ：也可使动物模型诱发ＣＯＰＤ，但模型是否可靠， 仍存在争议。 二、感染因素 人类ＣＯＰＤ发生、发展及演变过程中最重要的因素之一 是反复的呼吸道感染． １．细菌植入 根据报道，细菌在与气道上皮细胞相互作用所导致的 ＣＯＰＤ发病机制中，所起到的作用可能更加重要。许浒制作 大鼠模型的方式是多次将肺炎链球菌和肺炎克雷伯杆菌经鼻 腔注入，来观察单一细菌感染因素在ＣＯＰＤ发病中的作用。 结果显示该动物模型符合前面描述的ＣＯＰＤ病理学特征。但 郑鸿翱认为：此方法确实方便可行，但易致动物死亡，因此在 实验前需计算合适的活菌感染量，且在具体实行时严格控制 所给活菌量，若想使模型复制的成功率提高，需恰当地进行多 次重复染菌处理；而且因细菌进入肺内的途径不同，所以引起 的病理变化也不同。 ２．脂多糖诱导 脂多糖（ＬＰＳ）是革兰阴性细菌细胞壁的一种内毒素，是 呼吸道感染的一种主要诱发因素，存在于香烟烟雾（约０．１２ ～０．２ Ｉｘｇ／支香烟）、空气污染中，可刺激宿主细胞产生白介 素和肿瘤坏死因子，使气道和肺组织发生炎症反应，从而导致 蛋白酶／抗蛋白酶系统失衡，以致肺气肿形成。 有两种方式可以塑造ＣＯＰＤ模型：①静脉注入：早年 Ｂｌａｃｋ Ｗｏｏｄ把０．５ ｍｇ大肠杆菌内毒素静脉注入具有 １一抗 胰蛋白酶（ １一ＡＴ）缺乏的大鼠。其实验表明细菌内毒素可以 诱发大鼠模型产生形态学特征的肺气肿。②气管内滴入：早 年有国外学者多次，使小鼠产生了持续的慢性肺部炎症，并出 理学的改变均符合人类该病的病理特征，可应用于实验研究。 三、促弹性蛋白水解酶 迄今为止，国内外一些学者利用促弹性蛋白酶，如中性粒 细胞弹性蛋白酶（ＨＮＥ）、猪胰弹性蛋白酶（ＰＰＥ）、木瓜蛋白酶 （Ｐａｐａｉｎ）及蛋白酶－３（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３），成功地复制了动物肺气肿 模型，其中最早应用到诱导实验动物肺气肿的促弹性蛋白分 解酶的是木瓜蛋白酶。 现在应用蛋白酶复制肺气肿动物模型有气管切开注入、 气管内滴人、静脉注射、雾化吸入等给药途径。其中因操作较 简单，容易掌控注射剂量、动物感染较少等优势，气管内注入 被推广应用。１９６５年，Ｇｒｏｓｓ将木瓜蛋白酶经大鼠气管内滴 入，首次成功建立了肺气肿动物模型。近年来，张旭晨、张宏、 曾勉也分别应用此方法成功地复制了大鼠肺气肿模型。 与熏烟模型相比，将蛋白酶经气管注入反而更容易诱发 ＣＯＰＤ的发生和肺功能的明显异常 。但应注意，在操作过 程中准确计算动物的麻醉量，并且注意勿把塑料套管针误插 入食管内 …。 四、基因相关模型 近来，多项研究表明ＣＯＰＤ是一项复杂的多基因疾病。 随着全球有关基因组分析技术的深入展开，使得人们有了新 的方法突破对ＣＯＰＤ的病因学研究。 １．自然变异的ＣＯＰＤ模型 有资料显示ＣＯＰＤ的发生有家族聚集倾向，遗传因素也 被认为是ＣＯＰＤ的一种易感因素。 动物的品种不同，对ＣＯＰＤ的易感性亦不同。有报道发 现：在２到４周龄时，紧皮、苍白及斑点基因型的小鼠会出现 气腔空间进行性扩大、气道结构不同程度的异常 。研究显 示动物血清中ａｌ—ＡＴ的含量较低，对ＣＯＰＤ的易感性反而较 高。因此动物肺气肿的易感性与ａｌ—ＡＴ的含量是有某种联 系的，但肺气肿的发病是否受该因素直接影响，目前尚在研究 中 。 ２．转基因模型 若想获得不同的动物基因特性，必须将产物基因表达插 入到相关的实验动物基因组中。因插入的基因持续低水平表 达相关产物，动物成年期即可出现ＣＯＰＤ疾病。如：将基因 插入到Ｋｌｏｔｈｏ鼠内，可使Ｋｌｏｔｈｏ基因对蛋白质的编码进行阻 断，促使大鼠出现肺气肿特征。因此，此方法为ＣＯＰＤ动物模 型的研究提供了一个新的道路。 １２０ ３．基因缺失模型 临床肺科杂志２０１３年１月 第１８卷第１期 理特征和临床特点来选择适合的实验动物，研究多种致伤因 素干预的动物模型。总之，ＣＯＰＤ动物模型的发展，已为阐明 近年来，研究者为使实验动物模型缺少某种独立的蛋白， 特通过胚胎干细胞对遗传基因进行诱导突变，从而使某种特 定功能失效 。 五、多因素诱导的ＣＯＰＤ模型 ＣＯＰＤ的病原学及治疗方法的研究作出了巨大的贡献，促进 了人类对ＣＯＰＤ发病机制的理解和新的治疗药物的发展 。 参考文献 ［１］ 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组．慢性阻塞性 肺疾病诊治指南（２００７年修订版）［Ｓ］．中华结核和呼吸杂志， ２００７，３０：８—１７． ＣＯＰＤ的发生、发展过程之所以复杂，是因为多种因素相 互共同作用的结果，因此许多学者采用多因素诱导ＣＯＰＤ动 物模型。如：①内毒素经气管内注入加熏香烟法②气管内滴 入蛋白酶加二氧化硫刺激法③持续细菌感染加吸烟法④气 道内注入促弹性蛋白酶和脂多糖⑤气道内注入蛋白酶加常 压低氧法＠ＣａＣＬ￣联合山黎豆类制剂。 现主要介绍最常用的三种方法：①内毒素经气管内注入 加熏香烟法：宋一平等研究者首次将ＬＰＳ经气管两次注入， 随后加用熏烟法复制了大鼠ＣＯＰＤ模型。实验发现这种模型 的病理生理特征及肺功能改变均符合人类的ＣＯＰＤ特征，是 一种不错的研究模型。金焱等学者参考宋一平及国外一些研 究者的造模方法，增加ＬＰＳ的给药次数，减少熏烟时间，成功 复制了ＣＯＰＤ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠模型。Ｎｏ ｂｕａｋｉ等用此方法也成 功建立了ＣＯＰＤ模型，观察到豚鼠肺部炎症反应增加、支气管 黏膜上皮细胞增生及肺功能等变化。周玉皆 在气道内加 入小量内毒素并熏烟建立了ＣＯＰＤ大鼠模型，结果显示：模型 组较对照组的支气管黏膜下炎症细胞数有显著性差别，模型 建立成功。 ②气管内滴入蛋白酶加二氧化硫刺激法：早年，Ｋｏｄａｖａｎｔｉ 等先在ＳＤ大鼠气管内滴入弹性蛋白酶，２周后再用２５０ＰＰＭ 的ＳＯ，熏吸。结果证明该模型病理形态学改变和肺功能检查 均符合人类ＣＯＰＤ特征。有报道证明，若让ＳＤ大鼠持续１５ 天吸入２００ＰＰＭ的ＳＯ２，３ｍｉｎ／ｄ，然后在第１６天开始雾化吸人 ５ ｇ／Ｌ的木瓜蛋白酶，每次持续１０ ｍｉｎ，隔一天重复一次，共５ 次，停止吸入ＰＡＥ后１５天，再用ＳＯ２刺激１次，过ｌ０天处死 动物，发现了肺气肿样改变。 ③气管内注入弹性蛋白酶加吸烟法：据报道早年张宏给 动物模型气道内滴注了弹性蛋白酶并吸烟法来探究此法给动 物模型所产生的影响，其实验显示：倘若给气道内注入定量的 弹性蛋白酶，肺部的炎症反应就会达到某种程度，随后吸入的 烟雾对其已经作用不大。孙圣华、唐文祥 等使用猪胰弹性 蛋白酶代替脂多糖，采用气管内注入猪胰弹性蛋白酶加吸烟 法建立ＣＯＰＤ模型。其结果表明，此模型具备人类ＣＯＰＤ的 气道非特异性炎症和肺气肿等病理解剖学特征，并具有阻塞 性通气障碍的临床特征，因此，可以认为其建立的大鼠ＣＯＰＤ 模型是成功的。 结论和前景 综上所述，每种建立ＣＯＰＤ模型的方法各有千秋，但是由 于疾病的发生、发展及演变过程较为复杂，上述ＣＯＰＤ模型 的方法只在一定程度上复制了人类ＣＯＰＤ的主要病理特征和 临床改变。因此，我们应总结上述方法的利弊及结合肺部病 ［２］Ｈａｌｐｉｎ ＤＭ，Ｍｉｒａｖｉｔｉｔｌｌｅｓ Ｍ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ： ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｕｒｄｅｎ ｔｏ ｓｏｃｉｅｔｙ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｏｃ， ２００６，３：６１９—６２３． ［３］Ｗｆｉｇｈｔ儿，Ｔａｉ Ｈ，Ｃｈｕｒｇ Ａ．Ｖａｓｏａｃｆｉｖｅ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ［Ｊ］．Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００６，１００（２）：６７２—６７８． ［４］Ｂｒｕｓｓ ｅｌｌｅ ＧＧ，Ｂｒａｃｋｅ ＫＲ Ｍａｅｓ Ｔ，ｅｔ １ａ．Ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＣＯＰＤ ［Ｊ］．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００６，１９（３）：１５５— １６５． ［５］杜井波，任蕾．ＣＯＰＤ与吸烟．临床肺科杂志［Ｊ］，２００９，１４（２）． ［６］ 沈锋，赵鸣武，贺蓓，等．不同时间被动吸烟大鼠肺功能及肺组 织病理观察［Ｊ］．贵阳医学院学报，２００６，３１（３）：４２４７—２５０． ［７］ 曹君，陈平，杨悦，等．烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型的建立与 评价［Ｊ］．中国实验动物学报，２０１０，１８（４）：２７８—２８２． ［８］刘君波，黄梦珊，余晨曦，等．气管内反复滴人脂多糖法建立大 鼠慢性阻塞性肺疾病模型［Ｊ］．中国实验动物学报，２０１１，１９ （２）：１２９—１３３． ［９］ 范励侦，赖国祥．慢性阻塞性肺疾病动物模型研究进展［Ｊ］．福 建医药杂志，２０１１，３３（１）：１３９—１４１． ［１０］Ｃｈｕｒｇ Ａ，Ｃｏｓｉｏ Ｍ，Ｗｒｉｇｈ ｔ Ｊ Ｌ＿Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ— ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＯＰＤ：ｉｎｓｉｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，２９４（４）：１．６１２—６３１． ［１１］Ｂｒｕｓｓｅｌｌｅ ＧＧ，Ｂｒａｃｋｅ ＫＲ，Ｍａｅｓ，Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＣＯＰＤ ［Ｊ］．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ，２００６，１９：１５５—１６５． ［１２］陈丕仁，崔立，等．慢性阻塞性肺病（ＣＯＰＤ）动物模型的研究进 展［Ｊ］．中国实验动物学报，２００７，３（６）：２３８—２４２． ［１３］Ｎｏｂｕａｋｉ Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｊｕｎ－ｉｃｈｉ Ｆｕｃｋ ｉｋａｍ ｉ，Ｍａｋｉ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ ａ１． Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｅｍｐｈｙｓｅｍａ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ Ｓｍｏｋｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉ— ｐｏｐｏｌｙ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，２００９，３２ （９）：１５５９—１５６４． ［１４］周玉皆．ＣＯＰＤ大鼠模型气道炎症及其干预的研究［Ｊ］．临床肺 科杂志，２００７，１２（８）． ［１５］孙圣华，唐文祥，刘纯，等．ＴⅣＦ—ａ对ＣＯＰＤ大鼠模型呼吸肌蛋 白质分解代谢的影响［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２００７，３０（３）： １８６—１９１． ［１６］Ｆｏｘ ＪＣ，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＭＦ．Ｔｈｅ ｒｕｌｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏ— ｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍ ｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍ ｅｎｔ ｏｆ ＣＯＰＤ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００９，９（３）：２３１ —２４２． ［收稿日期：２０１２—０７—０５］