高速逆流色谱

高速逆流色谱及其应用

王莉

(贵州大学化学与化工学院，贵阳，550003)

摘要：高速逆流色谱是近年发展起来的，不使用固定相载体的新型液液逆流色谱。本文介绍了高速逆流色谱的工作原理，HSCCC在的分离方面具有很大的优势，具有非常广阔的应用前景。本文主要综述了HSCCC在天然产物、生物医药和其他方面的应用情况。

关键词：高速逆流色谱；天然产物；分离；应用

Application of High Speed Countercurrent Chromatography

WANG Li

（School of Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550003，China） Abstract: The high-speed countercurrent chromatography (HSCCC) is developing in recent year which without fixed carrier. The work principle，characteristics of HSCCC were introduced in this paper，which summarized the application and purification of HSCCC on the natural product，biomedicine and so on，especially the application on the fields of purification and isolation natural product．

Key words: HSCCC; natural product; isolation; application

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引言

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。

由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。

它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前HSCCC技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。

1 高速逆流色谱原理

高速逆流色谱是建立在一种特殊的流体动力学平衡的基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程。流动相不断穿过固定相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小次序被依次洗脱。高速逆流色谱仪器的装置如图1所示，它的公转轴水平设置，螺旋管柱距公转轴R处安装，两轴线平行。通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时，绕自转轴作相同方向相同角速度的自转。

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图 1 高速逆流色谱仪器装置示意图

Fig.1 Illustrative diagram of instrument installation of HSCCC

在对管柱里两相溶剂状态进行频闪观察时发现，在用选定溶剂体系的下相作流动相的条件下，管柱里会出现如图2所示的分布区带。在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个绝然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，呈现两相的激烈混合(混合区)；其余区域两溶剂相分成两层(静置区)，较重的溶剂相在外部，较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。然后根据各自的分配系数不同而先后被洗脱出来，达到分离的目的。

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图2 高速逆流色谱螺旋管内溶剂体系的区域分布图

Fig.2 Diagram of distribution of solvent system in the rotating coil in HSCCC

2 HSCCC的应用

2.1 HSCCC在生物医药中的应用

随着当前生物医药等研究领域的迅猛发展，越来越多的天然产物(包括对一些具有高附加值的天然活性分子)的提取分离，特别是药物中间体的合成过程中有效成分的分离，都需要建立快速、高效的现代分离方法，而高速逆流色谱法对于加强上述领域的药物开发支持体系提供了一条崭新的途径。

2.1.1 氟吗啉原药中有机杂质的分离

氟吗啉(flumorph)是沈阳化工研究院创制开发的含氟二苯丙烯酰吗啉类杀菌剂，化学名称为4-[3-(3, 4-二甲氧基苯基)-3-(4-氟苯基)丙烯酰]吗啉。氟吗啉有2种互变异构体z型和E型。王远[1]等应用高速逆流色谱，选择正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(体积比1：l：1：1 )为两相体系对氟吗啉原药进行分离纯化，并用高效液相色谱法测定分离物的纯度。结果表明：经过高速逆流色谱1次分离，除活性组分氟吗啉外共分离得到3个纯度超过95％的有机杂质。

2.1.2 分离纯化续随子种子中七叶内酯

药理实验表明：七叶内酯具有抗炎、抗菌止咳、祛痰、平喘等药理作用[2]。现代研究证明：续随子种子中含有香豆素类成分，其中七叶内酯具有促进血液循环的作用，动物实验结果表明其具有增加尿量和促进尿酸从组织中排出的效果，这与中医的逐水消肿作用一致[3]

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余霞等[4]建立了HSCCC技术分离纯化续随子种子中七叶内酯的方法。将续随子种子的乙酸乙酯萃取物直接进行高速逆流色谱分离，考察了不同溶剂系统的分离效果。结果表明，最佳的溶剂系统为氯仿-甲醇-水(体积比为4：3：2)，以其上相为固定相，下相为流动相。从200 mg续随子种子乙酸乙酯萃取物中分离得到80 mg七叶内酯，纯度为99.04％。HSCCC技术可高效分离纯化续随子种子中的七叶内酯，为得到高纯度的七叶内酯提供了制备技术 。

2.1.3 分离制备麦角甾醇纯品

蝙蝠蛾拟青霉最早是从冬虫夏草样品(昆虫为虫草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus Oberthiir的幼虫(僵虫))上分离得到的，其菌丝粉在化学成分、药理作用及临床效果上与天然虫草基本一致，具有补肺益肾、秘精益气之功效。现代研究表明，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的主要化学成分有麦角甾醇(ergosterol)、麦角甾醇过氧化物、正二十五烷酸、大豆素、对羟基苯乙酸甲酯、类生物碱物质等，其中麦角甾醇是主要有效成分。麦角甾醇是脂溶性维生素 D2的前体，当受到紫外线照射时可转化为维生素D2，它是一种重要的医药化工原料，可用于可的松、黄体酮等药物的生产，在食品、医药和饲料工业中应用广泛。

章能胜等[5]建立了用高速逆流色谱从蝙蝠蛾拟青霉中高效、快速分离制备高纯度麦角甾醇的方法。将蝙蝠蛾拟青霉的乙酸乙酯提取物直接进行高速逆流 色谱分离，考察了不同溶剂系统的分离效果。结果表明，最佳的溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为 6：1.7：6：0.3)，以上相为固定相，下相为流动相，转速为850r／min，流速为2 mL／min，检测波长为280nm。制备所得的麦角甾醇经紫外光谱(UV)和高分辨质谱(HRMS)鉴定及与标准品对照定性；纯度经高效液相色谱( HPLC)分析为99.2％ (峰面积归一化法)。该方法制备麦角甾醇简便、快速，所得产物的纯度高，适合于麦角甾醇对照品的制备。

2.2 HSCCC在天然产物分离中的应用

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2.2.1 生物碱类

生物碱是重要的天然含氮化合物，对疾病治疗和药物开发等具有重要意义。近年来，用HSCCC已成功分离了多种生物碱。分离生物碱成分常用的溶剂体系是正已烷-乙酸乙酯-甲醇 (或者乙醇、正丁醇)-水体系及三氯甲烷-甲醇-水体系[6]。

程悦[7]等应用高速逆流色谱法分离制备了苦茶中的苦茶碱。以正己烷-二氯甲烷-甲醇-水 (体积比为1：5：4：2 )为两相溶剂系统，在主机转速800 r／min、流速2.0 mL／min、检测波长278 nm条件下进行分离制备。所得流分经高效液相色谱法检测，与对照品进行比较，并通过质谱、核磁共振氢谱、碳谱鉴定化合物的结构。结果表明，从2.22 g苦茶总生物碱提取物中分离得到了3个化合物，分别为可可碱5 mg，苦茶碱389 mg，咖啡碱41 mg，纯度均在99％以上，系首次采用高速逆流色谱法对苦茶中的苦茶碱进行分离。该法具有简便、快速的优点。

Tang[8]等以乙酸乙酯-n-正丁醇-甲醇-2％盐酸(3.5：1.5：2：4.5)为两相系统从黄花乌头中分离开出GFT，GFU两种生物碱，并且两种生物碱的纯度都大于95％。

2.2.2 黄酮类

黄酮类化合物多存在于高等植物和蕨类植物中，常以游离或与糖结合成苷的形式存在，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木质部组织中多为游离苷元。主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。分离极性较大的黄酮苷类成分时，一般应用正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶剂系统，并适当增加体系的极性。分离游离的黄酮类化合物常用氯仿-甲醇-水体系。利用HSCCC技术能够有效地分离黄酮类化合物。

已见报道用氯仿-甲醇-水(4：3：2 )体系分别分离了陈皮和沙棘中的橙皮苷和茨非醇[9]；用氯仿-甲醇-水(4：3：2)体系曾从芫花总黄酮中分离得到羟基芫花素、洋芹素、木樨草素”[10]；用正己烷

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-乙酸乙酯-甲醇-水(1：3：l：6)体系从红茶分离了茶黄素[11]；用氯仿-甲醇-水(10：7：3)分离了雪莲中的黄酮类成分[12]；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9：l：5：5)从掌叶大黄的根茎中分离出大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素”[13]。用乙酸乙酯-正丁醇-水( 2：l：3) 溶剂系统，可以从葛根粗提物中进一步分离包括葛根素在内的七个异黄酮化合物[14]。

2.2.3 木脂素和香豆素类

报道用正己烷-甲醇-水( 6：5：5 ) 溶剂系统从江花五味子果实的核的乙醇萃取物中分离了2个结构十分相似的木脂素的成分-schisanhend及其乙酸化物[15]；氯仿-甲醇-水( 13：7：8 ) 的两相体系分离并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素和7-羟基香豆素[16]。

2.3 HSCCC的其他应用

HSCCC也广泛应用于其他研究领域。胡江涌等[17]采用超微回流提取方法提取土豆叶中的茄尼醇，用HSCCC对粗提物中的茄尼醇进行分离纯化。以正己烷-甲醇作为两相溶剂系统，以其下相为流动相，上相为固定相，从60mg茄尼醇粗提物中分离得到了5mg纯度为98.7%的茄尼醇。并进一步对茄尼醇进行大气压化学电离质谱解析，研究了茄尼醇的大气压化学电离质谱的一级电离规律和二级质谱裂解规律。

肖阳等[18]选择溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，采用水中直接蒸馏的方法提取小茴香精油，并用气-质联机（GC-MS）确认香精油结构。

夏兴等[19 ]采用HSCCC技术，对真菌HCCB00106 的雄甾烯二酮（4AD）转化产物进行了分离研究，在选定体系中底物4AD、杂质及主要产物得到了较好的分离，主要产物为睾内酯（17α-氧代-D-扩环-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮）。

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3. 展望

HSCCC仪器价格低廉、性能可靠、分析成本低、易于操作，是一种适用于中药和天然产物研究的现代化仪器。经过多年的发展，HSCCC作为一种分析及制备技术日趋成熟和完善，将其应用于天然产物分离的研究方兴未艾。目前，尽管HSCCC还有许多理论和技术问题需要深入的研究，还存在一些不足之处，如消耗溶剂多、检测限较低、灵敏度较差等[20]；但由于HSCCC与其他色谱分离技术相比具有不可比拟的优势，随着各种相关技术的不断发展和改进，HSCCC将会在天然药物化学的相关研究中发挥更为重要的作用。

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