猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检

*CN103305638A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103305638 A(43)申请公布日 2013.09.18

(12)发明专利申请

(21)申请号 201310275996.2(22)申请日 2013.07.02

(66)本国优先权数据

201310055419.2 2013.02.21 CN

(71)申请人北京世纪元亨动物防疫技术有限公

司

地址100094 北京市海淀区北清路68号院

中区13号楼(72)发明人孙明 陈西钊 乔明明 陈南华(74)专利代理机构北京海虹嘉诚知识产权代理

有限公司 11129

代理人张涛

(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)G01N 21/64(2006.01)

权利要求书1页 说明书12页权利要求书1页 说明书12页

序列表3页 附图1页序列表3页 附图1页

(54)发明名称

猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法(57)摘要

本发明公开了猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法。本发明涉及猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测引物对，其特征在于，特异性猪圆环病毒1型引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示，探针包含SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；特异性猪圆环病毒2型引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6所示，探针包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。本发明试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，可以同时进行大批量的样本分析，一次反应便能鉴别诊断样本是猪圆环病毒1型感染，或猪圆环病毒2型感染，或两者共同感染，为猪圆环病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

CN 103305638 ACN 103305638 A

权 利 要 求 书

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1.一种猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测引物对，其特征在于，特异性猪圆环病毒1型引物对包含如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；

特异性猪圆环病毒2型引物对包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

2.一种猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述猪圆环病毒1型探针包含SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，所述猪圆环病毒2型探针包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

3.包含权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针的组合物。4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述组合物。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，两种探针分别使用不同检测通道的荧光素标记，所述荧光素选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种。

6.权利要求4或5所述的试剂盒同时检测猪圆环病毒1型和2型的用途。7.一种猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）使用权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针；（2）分别用不同检测通道的荧光素标记猪圆环病毒1型和2型的探针；（3）将用于检测或鉴别猪圆环病毒1型或2型的引物和探针，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，两种探针分别用不同检测通道的荧光素标记，所述荧光素选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种。

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说 明 书

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猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测引物对、探

针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及双重实时荧光PCR检测，具体涉及猪圆环病毒1型

和2型双重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法。

[0001]

背景技术

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属。该病毒是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，以滚环方式进行复制，是目前发现的最小的动物病毒。Brain、Allan等认为可根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列可将PCV分成PCV1和PCV2两种基因型。目前一般认为PCV1无致病性，包括PCV-PK15及其它流行于猪群但无致病性的分离株，实验证明其广泛存在于猪原代细胞系及猪群中；PCV2具有致病性，与近年来世界各国广泛流行的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post Weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）密切相关，该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，已给全球养猪业造成相当严重的经济损失。PCV1和PCV2核苷酸同源性为68%。GenBank登录的各个PCV2毒株之间序列同源性均有95%以上。因此PCV1与PCV2有一定亲缘关系，但也发生了较大的变异。PCV1和PCV2ORF2基因的核苷酸同源率较低，为65%～67%。先前在绝大多数学者看来，PCV1虽然广泛存在于猪体内但却不具有致病性，因而对PCV的研究也一直以PCV2为主。然而Krakowka等用体外细胞传代的PCV1、PCV2和PPV单独和联合接种1日龄的新生仔猪，结果所有单一病毒感染的仔猪均没出现临床症状，但其中一头接种PCV1和PPV的仔猪出现长达2周的PPV病毒血症，结肠袢伴有肉芽肿性的淋巴结炎；Rosell等对感染PCV1的仔猪进行免疫荧光实验发现在淋巴组织、肺和肠道都有PCV1抗原存在，因此，不能排除PCV1对免疫系统的损伤作用。同时生产实践中PCV1的感染率也是很高的，猪体以及猪源性细胞中都有可能存在PCV1。[0003] 目前检测PCV的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但这些常规方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。目前对PCV检测方法中，建立的主要针对PCV2的实时荧光PCR检测方法，或PCV1实时荧光PCR检测方法，只能单一的检测PCV2或PCV1，不能对PCV2和PCV1进行双重实时荧光PCR检测。[0004] 因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的PCV1和PCV2鉴别的检测方法意义重大。

[0002]

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR

检测引物、探针、试剂盒及检测方法。本发明试剂盒只需一次检测便能判定样本是否含有PCV1或者含有PCV2，或者两者共同感染，灵敏，便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，可以同时进行大批量的样本分析，有很好的应用前景。[0006] 本发明通过以下技术方案实现的：

[0005]

3

CN 103305638 A[0007]

说 明 书

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本文所列出的核苷酸序列，均有5’端向3’端方向书写。

[0008] 本发明一个方面涉及两种引物对（包含四条引物），其中猪圆环病毒1型引物对包含如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，猪圆环病毒2型引物对包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。本发明的另一方面涉及两种探针，猪圆环病毒1型探针包含SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，猪圆环病毒2型探针包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

[0009] 本发明还涉及一种用于同时检测PCV1和PCV2的寡核苷酸引物对和探针的组合物，包括上述的引物对以及探针。[0010] 此外，本发明还提供包括上述组合物的试剂盒。

[0011] 上述试剂盒的两种探针分别使用不同检测通道的荧光素标记，所述荧光素选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种。[0012] 进一步的，本发明还涉及试剂盒在同时检测PCV1和PCV2的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，且两种探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM（羧基荧光素）、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

[0013] 一种利用上述两种引物对和两种探针同时检测PCV1和PCV2的双重实时荧光PCR方法，包括：

[0014] 针对PCV ORF2基因设计的能鉴别PCV1和PCV2的特异性引物和探针序列。用荧光素标记的PCV1的探针，以及通过不同检测通道检测的另一种荧光素标记的PCV2的探针；其中的探针用任意一种荧光素标记，且两种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。将用于检测PCV1或PCV2的引物和探针序列，或用于鉴别PCV1与PCV2的引物和探针序列，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。[0015] 本发明的显著特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核苷酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对同一个样本进行一次检测操作即可完成PCV1和PCV2的鉴别检测，可以确定样本是PCV1感染，或者是PCV2感染，或者是两者共同感染。具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检测效率等优点。[0016] 多重实验即在一个反应管中通过扩增多个靶标进行定量实验，在一个反应管中，任何一个靶标的扩增都能影响其他靶标的扩增，所以要进行周密的实验设计和反应条件的优化，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。多重荧光PCR实验普遍存在的问题是扩增样本中浓度明显差异的所有靶标，在同一反应管中扩增时，如果出现一种基因扩增效率高于另一种基因时，其中一种基因的扩增可能受到抑制，最终导致样本中两种基因的扩增效率不一致。本发明通过引物和探针的设计，反应条件的优化，使样本中两种基因的扩增效率一致，与每个单重反应的灵敏度是一致的。[0017] 本发明的显著特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核苷酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对同一个样本进行一次检测操作即可完成PCV1和PCV2的鉴别检测，可以确定样本是PCV1感染，或者是PCV2感染，或者是两者共同感染。具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检测效率等优点。附图说明

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CN 103305638 A[0018]

说 明 书

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图1为PCV1特异性结果示意图

[0019] 图2为PCV2特异性结果示意图

具体实施方式：

[0020] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。[0021] 荧光素介绍：

[0022] 一般仪器FAM对应1通道，VIC、HEX、JOE对应2通道，NED、TAMRA对应3通道，CY3、ROX对应4通道，CY5对应5通道。[0023] FAM：羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，广泛存在于荧光标记试剂盒，也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。[0024] VIC：绿色荧光蛋白，Greenfluorescent protein，GFP，是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白。[0025] HEX：六氯荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=535/556nm。[0026] JOE：羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素，Carboxy-4',5'-dichloro-2'，JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。[0027] TAMRA：全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的。[0028] ROX：5-和6-羧基-X-罗丹明，校正染料。[0029] Cy3或Cy5，Modification，是新的荧光分子，具有较好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率。它们的激发光谱和发射光谱峰值分别为548/562nm与646/664nm。Cy3和Cy5的分子结构和分子量都非常相似，但两者之间的光谱却分得很开，因此，Cy3和Cy5常被用于很多双色实验中，如被广泛应用于基因芯片和蛋白质芯片领域。[0030] NED：2’-氯-5’-氟-7’，8’-苯-1,4-二氯-6-羧基荧光素。

[0031] 以上荧光素检测时所对应的检测通道是本发明在实验过程中所用FTC-3000仪器所对应的检测通道，本领域技术人员在重复本发明的过程中，所用仪器不同有可能荧光素所对应的通道不同，同时两种或多种荧光素在使用第一种仪器时所对应的检测通道是不同的，在使用第二种仪器时所对应的检测通道有可能是相同的。本发明的宗旨是，无论使用哪种仪器来重复本发明，只要在使用同一种仪器时，用于标记猪圆环病毒1型和2型的探针的荧光素在不同的检测通道就可以实现本发明。[0032] 本发明实验材料的来源：[0033] 生物材料：

[0034] 本发明所用到的生物试剂的来源和规格：[0035] 猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV），

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说 明 书

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由中国动物疫病预防控制中心惠赠。[0036] 申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。

[0037] 本发明试剂的来源及规格：[0038] RealMasterMix（Probe）试剂盒购自天根生化科技有限公司。PCV1和PCV2TaqMan探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。[0040] Biospin组织基因组DNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司。[0041] 下面实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版（北京：科学出版社，2002），仪器的使用参照仪器操作说明书。

[0042] 实施例1.猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR方法特异性引物和探针筛选[0043] （1）猪圆环病毒的引物与探针设计

[0044] 猪圆环病毒PCV1与PCV2的特异性引物，指的是：长度20个碱基左右的寡核苷酸链，猪圆环病毒ORF2基因高度保守的特异性核苷酸片段；[0045] 猪圆环病毒PCV1与PCV2的特异性探针，指的是：长度为13到30个碱基之间的寡核苷酸链，其5’端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团。[0046] 根据获得的ORF2基因特异性高度保守区域，利用Primer Express3.0软件设计了针对猪圆环病毒PCV1与PCV2的多个实时荧光PCR扩增引物和TaqMan探针，引物对与探针的具体序列见表1。

[0047] 表1 用于猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光筛选的引物和探针

[0039] [0048]

名称PCV2-F1PCV2-F2PCV2-F3PCV2-R1PCV2-R2PCV2-R3PCV2-PPCV1-F1PCV1-F2PCV1-F3

序列（5’-3’）ATCCACTCCCCTGTCACCCTCCCTGTCACCCTGGGTGATATCCCCTGTCACCCTGGGTCCGCTCTGTGCCCTTTGATCGTGCCCTTTGAATACTACAGAATACCTGTGCCCTTTGAATACTACAGA

FAM-TTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCC-BHQ1TGTGGCGGGAGGAGTAGTTAATCGGGAGGAGTAGTTAATATAGGGGTTGTGGCGGGAGGAGTAGTTAATATA

SEQ ID NO:12345678910

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PCV1-R1PCV1-R2PCV1-R3PCV1-P

说 明 书

ACTGTTGTTATCTTGGATGCCAACTCCACTGTTGTTATCTTGGATGCCAGGGTCCACTGTTGTTATCTTGGA

HEX-TAACCCCCTCCACCAACTTGGCCTA-BHQ1

11121314

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[0049] （2）猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR方法的反应体系及条件[0050]

猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR方法的反应体系见表2，反应条件见表表2 猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR方法反应体系

反应试剂

dNTP和TaqE）反应缓冲液（含MgCl2、10pmoL/μL引物对10pmoL/μL探针ROX染料模板补水至

终浓度1×400nM200nM1×2μL25μL

3。

[0051] [0052]

[0053] [0054] [0055]

表3 猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR方法的反应条件

[0056] （3）结果判定

①结果分析条件设定[0058] ②读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，以显示结果为准。

[0059] ③结果描述及鉴定

[0060] 对比不同引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则，敏感性原则和最高扩增原则，选定特异性好，敏感性高，可靠性好的猪圆环病毒1型和2型检测用引物对与探针最佳组合。（4）筛选试验方法与结果

[0057]

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说 明 书

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引物与探针的优化筛选方法如下：

[0062] 任意选择一对引物与一条探针进行组合（如引物对PCV1-F1/PCV1-R1，加上探针PCV1-P；引物对PCV1-F2/PCV1-R2，加上探针PCV1-P；引物对PCV2-F1/PCV2-R1，加上探针PCV2-P；等等），以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。

[0063] 通过多次重复、对比试验，选定猪圆环病毒1型和2型检测用引物对与探针的最佳组合，组合筛选结果图略，具体序列见表4

[0064] 表4 猪圆环病毒1型和2型检测用引物对与探针的最佳组合序列

[0065]

实施例2.猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测方法的优化

[0067] （1）猪圆环病毒1型实时荧光PCR方法的引物与探针设计

[0068] 猪圆环病毒1型实时荧光PCR方法的引物与探针设计参见实施例1，具体序列见表4。

[0069] （2）猪圆环病毒1型实时荧光PCR方法的反应体系及条件[0070] 猪圆环病毒1型实时荧光PCR方法的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。[0071] a、最佳荧光引物浓度的确定：荧光引物浓度在300nM到800nM之间进行筛选。[0072] b、最佳探针浓度的确定：探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。[0073] 经过优化，猪圆环病毒1型实时荧光PCR方法的反应体系见表5，反应条件见表6。[0074] 表5 猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测体系

[0066]

8

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说 明 书

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[0075]

[0076] [0077]

表6 猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测扩增条件

[0078] （3）结果判定

①结果分析条件设定[0080] 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。[0081] ②质控标准

[0082] 阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；[0083] 阳性对照的Ct值应≤30，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。[0084] ③结果描述及判定

[0085] 阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无猪圆环病毒1型。[0086] 阳性样本Ct值≤30，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有猪圆环病毒1型。[0087] 有效原则：样本Ct值在30＜Ct＜37之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct＜37时样品为阳性，否则为阴性。[0088] （4）样本检测试验及结果[0089] 试验对猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）进行扩增，结果只有猪圆环病毒1型（PCV1）得到特异性的荧光扩增曲线。

[0090] 实施例3.猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法的优化[0091] （1）猪圆环病毒2型实时荧光PCR方法的引物与探针设计

[0092] 猪圆环病毒2型实时荧光PCR方法的引物与探针设计参见实施例1，具体序列见表

[0079]

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说 明 书

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4。

[0093] （2）猪圆环病毒2型实时荧光PCR方法的反应体系及条件

猪圆环病毒2型实时荧光PCR方法的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。[0095] a、最佳荧光引物浓度的确定：荧光引物浓度在300nM到800nM之间进行筛选。

[0094]

b、最佳探针浓度的确定：探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。[0097] 经过优化，猪圆环病毒2型实时荧光PCR方法的反应体系见表7，反应条件见表8。[0098] 表7 猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测体系

[0096]

[0099]

[0100] [0101]

表8 猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测扩增条件

[0102]

[0103] （3）结果判定

④结果分析条件设定[0105] 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。[0106] ⑤质控标准

[0107] 阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；[0108] 阳性对照的Ct值应≤30，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。[0109] ⑥结果描述及判定

[0110] 阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无猪圆环病毒2型。[0111] 阳性样本Ct值≤30，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有猪圆环病毒2型。[0112] 有效原则：样本Ct值在30＜Ct＜37之间时需要进行重复试验。重复试验结果

[0104]

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说 明 书

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Ct＜37时样品为阳性，否则为阴性。[0113] （4）样本检测试验及结果[0114] 试验对猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）进行扩增，结果只有猪圆环病毒2型（PCV2）得到特异性的荧光扩增曲线。

[0115] 实施例4.猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒组成[0116] 1、PCR反应液：每个反应包括反应缓冲液（含MgCl2、dNTP和TaqE）12.5μL，分装至1mL血清管，750μL/管，-20℃保存；[0117] 2、荧光探针：每个反应包括10μM探针PCV10.6μL、10μM探针PCV20.6μL和ROX染料0.5μL组成，共1.7μL，分装至0.5mL棕色血清管，100μL/管，-20℃保存；[0118] 3、引物：每个反应包括组成10μM PCV1引物对1.8μL、10μM PCV2引物对1.8μL，共3.6μL，分装至0.5mL血清管，220μL/管，-20℃保存；[0119] 4、无菌无核酸酶水：分装至0.5mL血清管，600μL/管，-20℃保存；[0120] 5、PCV1阳性对照：加入裂解液的PCV1病毒液，Ct值<30，600μL/管，-20℃保存。[0121] 6、PCV2阳性对照：加入裂解液的PCV2病毒液，Ct值<30，600μL/管，-20℃保存。7、阴性对照：灭菌去离子水，600μL/管，-20℃保存。[0123] 8、消化液：11ml/瓶，分装至白色透明的白盖塑料瓶中，室温保存。[0124] 9、DNA结合液：16mL/瓶，分装至白色透明的白盖塑料瓶中，室温保存。[0125] 10、DNA洗涤液：52mL/瓶，分装至白色透明的白盖塑料瓶中，室温保存。[0126] 11、DNA洗脱液：4mL/瓶，分装至白色透明的白盖塑料瓶中，室温保存。[0127] 12、DNA吸附柱和收集管：50套/袋，室温保存。

[0128] 实施例5.猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法[0129] 1样品制备

[0130] 1.1样品采集：病死或扑杀的猪，取肺、淋巴结等病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5mL。2～8℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）

[0131] 1.2样品处理：每份样品分别处理。[0132] 1.2.1组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.02g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中，再加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56℃水浴中消化1小时。[0133] 1.2.2全血样品处理：待血凝后取血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。[0134] 1.2.3阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。[0135] 1.2.4阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。[0136] 2操作步骤

[0137] 2.1病毒DNA的提取

[0122]

2.1.1取出样品管，降至室温后，加入300μL DNA结合液（Biospin组织基因组DNA

提取试剂盒），颠倒混匀，将全部液体移入吸附柱中，室温静置3min，10000rpm离心30s。[0139] 2.1.2弃去收集管中液体，加入500μL DNA洗涤液，10000rpm离心30s。

[0138]

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2.1.3重复步骤2.1.2。

[0141] 2.1.4弃去收集管中液体，10000rpm离心30s，以除去残留的DNA洗涤液。[0142] 2.1.5将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入56℃预热的DNA洗脱液50μL，室温放置2min，10000rpm离心30s，离心管中液体即为模板DNA。[0143] 3实时荧光PCR操作[0144] 3.2.1反应体系配制[0145] 设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为N，则反应体系配制如下：

[0146]

将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各23μL。[0148] 3.2.2扩增

[0149] 分别取2.1.5中已溶解的病毒DNA2μL，加入相应反应管中，混匀并作好标记，其中PCV-2荧光报告基团为FAM，PCV-1为Hex，淬灭基团均为None，在荧光PCR仪上进行以下反应：95℃30s；95℃5s，60℃35s，40个循环，每个循环的第二步分别收集荧光信号。[0150] 4结果判定

[0151] 4.1结果分析条件设定[0152] 阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。[0153] 4.2结果描述及判定

[0154] 阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立；被检样品若FAM荧光信号Ct值≤30并出现特定的扩增曲线为PCV-2阳性；被检样品若Hex荧光信号Ct值≤30并出现特定的扩增曲线为PCV-1阳性；被检样品30＜Ct＜37并出现特定的扩增曲线，需重新再做一次后进行结果判定，如两次结果相同，则判定为阳性；被检样品Ct值≥37时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性。

[0147]

实施例6.本发明试剂盒的效果验证[0156] 1.特异性试验

[0157] 采用本发明提供的方法制备20120809、20120811、20120816三个批号的猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒分别对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒（PPV）、PK-15细胞及猪圆环病毒阴性猪肺脏、淋巴结、心肌进行特异性试验，PCV1检测结果为阴性（图1），PCV,2检测结果为阴性（图2），以上结果充分证明该试剂盒具有很好的特异性。[0158] 对猪圆环病毒1型和2型细胞毒及其他2株2型及1株1型进行检测，检测结果

[0155]

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说 明 书

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均为阳性。初步证明该方法对猪圆环病毒检测适应性良好。[0159] 2.灵敏度试验[0160] 对PCV1细胞毒，根据实施例5DNA提取方法进行提取，对得到的DNA进行10-1到10-5梯度稀释，检测其灵敏度，结果见表7。[0161] 对PCV2细胞毒，根据实施例5DNA提取方法进行提取，对得到的DNA进行10-1到10-6梯度稀释，检测其灵敏度，结果见表9。

[0162] 表9 猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒灵敏度结果

[0163]

Ct值与模板拷贝数的对数呈线性关系，相邻两个模板浓度间的Ct值相差约3.3，

与理论上计算的模板浓度相差10倍，Ct值相差3.3相符。[0165] 3.重复性试验[0166] 使用20120809、20120811、20120816三个批号的猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒，按照实施例5的使用方法对猪圆环1型和2型细胞培养液10倍连续稀释的DNA分别进行3次重复检测，以确定此方法的批内重复性；3批试剂盒对同样的稀释样品进行检测，以确定此方法的批间重复性。结果见表10。[0167] 表10 三批试剂盒重复性试验结果

[0164] [0168]

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检测结果显示：批内变异系数及批间变异系数分别为0.39%～2.50%和0.65%～

2.00%，均小于5%，说明20120809、20120811、20120816这3批试剂具有很好的批间可重复性。

[0170] 4.稳定性试验[0171] 使用20120809、20120811、20120816三个批号的猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒，按照实施例5的使用方法对3个样本，每月进行一次检测，每批做3个重复，持续6个月，检测试剂盒的稳定性。结果显示：20120809、20120811、20120816三个批号的猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒，6个月内的Ct值变化不大，说明猪圆环病毒1型和2型双重实时荧光PCR检测试剂盒在6个月内具有很好的稳定性。

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图1

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