疾病控制杂志２００７年２月第１１卷第１期 ・ １ ・ ◇论 著◇ ＨＢＶ宫内传播和ＨＢＶ前Ｓ／Ｓ基因突变的关系的初步分析 张治国 ，苏海霞 ，吴琳 ，闫永平 ，门可 ，张景霞 ，王安辉 ，卢娟 ，徐德忠。 【摘要】 目的研究官内传播中乙型肝炎病毒前Ｓ／Ｓ基因的突变，探讨官内感染乙型肝炎病毒与 ＨＢＶ基因突变的关系。方法根据随访确定新生儿是否发生宫内感染，将ＨＢｓＡｇ阳性母亲分为 病例组和对照组，经ＰＣＲ扩增ＨＢＶ ＤＮＡ，基因克隆、测序，分析前Ｓ／Ｓ基因的突变。结果共得 到６０株ＨＢＶ病毒株序列，所有毒株均属于ｃ基因亚型、ａｄｒ亚型；１６个位点的突变在官内感染组 母亲及其新生儿中没有或很少发生，在对照组母亲中发生率较高，其中ｎｔ２７４９、３０８６、３０９、６７６、 ６８４、３１１４、７０、１６１、３０８、２１３、３７３、４０５位点突变在３组中的发生率差异有统计学意义。结论 所有 病毒株前Ｓ／Ｓ基因均存在突变，某些突变位点在非官内感染组母亲中的发生率较高，ＨＢＶ宫内感 染的发生可能与某些位点基因是否发生突变或其所在的功能区是否发生变化有关。 【关键词】肝炎，乙型；点突变 【中图分类号】Ｒ３９４．１１２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１００８—６０１３（２００７）０１—０００１—０４ Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ ｇｅｎｅ ａｎｄ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ—ｇｕｏ‘，ＳＵ Ｈａｌ—ｘｉａ ，ＷＵ Ｌｉｎ ，ＹＡＮ Ｙｏｎｇ－ｐｉｎｇ ，ＭＥＮ Ｋｅ‘，ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎｇ—ｘｉａ‘，ＷＡＮＧ Ａｎ－ｈｕｉ‘．ＬＵ Ｊｕａｎ‘，ＸＵ Ｄｅ—ｚｈｏｎｇ‘． １．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ ＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ ７１００３２，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍ— ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ ７１００３２，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｃｅｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔＯ ｗｈｅｔｈｅｒ ｎｅｏｎａｔｅ ｗａｓ ｉｎ— ｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ＨＢＶ ｉｎ ｕｔｅｒｕｓ ｉｎ ｆｏｌｌｏｗ—ｕｐｓ，ｔｈｅｉｒ ＨＢｓＡｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｔｈｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎ— ｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｎｏｎ—ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ．ＰｒｅＳ／Ｓ ｇｅｎｅ ｏｆ ＨＢＶ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ），ｔｈｅｎ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｅｏｍ— ｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒｏｕｐｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｌｌ ６０ ＨＢＶ ｓｔｒａｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ ａｎｄ ｓｕｂ— ｔｙｐｅ ａｄｒ．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ １ ６ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｔ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｆｅＷ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ．ｎｔ２７４９，３０８６，３０９，６７６，６８４，３１１４，７０，１６１，３０８，２１３，３７３，４０５ ｉｎ ｎｏｎ—ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃ— ｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｖａｒｉａｌｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ａｌｌ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｓｏｍｅ ｇｅｎｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ’Ｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ．Ｓｏｍｅ ｇｅｎｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ’Ｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ；Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ （Ｃｈｉｎ ＪＤｉｓＣｏｎｔｒｏｌ ２００７，１１（１）：１—４） 乙型肝炎呈世界范围流行，我国属高发区。其 前，由于乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白的使用，新生儿 中母婴传播是ＨＢＶ主要的传播途径之一，也是人 的感染率已明显下降，但仍有５％～１５％…的新生 群中大量ＨＢＶ慢性携带者形成的重要原因。目 儿发生宫内感染。目前其机制并不完全清楚，可能 与病毒本身、母体和胎儿的免疫状况及胎盘因素等 【基金项目】国家自然科学基金资助重点项目（３０２３０３２０） 有关。前Ｓ／Ｓ基因的突变可以使病毒发生免疫逃 【作者单位】 第四军医大学预防医学系流行病学教研室， 避、结合细胞和感染细胞的能力增强、使乙肝疫苗和 陕西西安７１００３２ 第四军医大学生物化学与分子生物学教研室， 乙肝免疫球蛋白保护无效 Ｊ，这些都可能影响宫内 陕西西安７１００３２ 传播的发生。本课题组苏海霞等 ．４ Ｊ发现，非宫内 【作者简介】张治国（１９８０一），男，内蒙古丰镇人，在读硕士 传播组母亲前Ｓ／Ｓ基因突变率要高于宫内感染组 研究生。主要研究方向：分子流行病学。 【通讯作者】徐德忠，教授，博士生导师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕｄｅｚｈ＠ 母亲，提示突变率低的ＨＢＶ病毒株可能更具有选 ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 择优势，容易引起新生儿宫内感染。本研究从ＨＢＶ 维普资讯 http://www.cqvip.com
・２・ 基因突变人手，进一步探讨可能与宫内感染发生有 关的突变位点。 １材料和方法 １．１ 材料 以陕西省妇幼保健院ＨＢｓＡｇ阳性孕妇 及其足月分娩的新生儿为研究对象。病例组母婴的 纳入标准：新生儿于出生时、４月龄、７月龄和１２月 龄随访，ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ均阳性判定为宫内感染 者；其母亲ＨＢＶ ＤＮＡ阳性者、无先兆早产先兆流 产、未接种过疫苗。对照组母亲为与病例组同期入 院，同期随访证实未发生宫内感染者。ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ检测试剂盒购自华美公司；蛋白酶Ｋ购自 Ｍｅｒｃｋ公司；ＬＡ—ＰＣＲ试剂盒、ｐＧＭ Ｔ载体购自 ＴａＫａＲａ公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自 ＴｉａｎＧｅｎ公司。ＰｓｔＩ内切酶、ＩＰＴＧ、Ｘ—ｇａｌ、Ｔ４连接 酶购自北京鼎国公司。 １．２血清Ｉ－ＩＢＶ标志物的检测 采用ＥＬＩＳＡ法检 测，操作按照试剂盒说明书进行。 １．３血清Ｉ－ＩＢＶ ＤＮＡ的提取取２００ ｌ血清与等体 积裂解液（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＣＩ，ｐＨ＝８．０；１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ：８．０；１ ｇ／Ｌ ＳＤＳ，０．８ ｇ／Ｌ蛋白酶Ｋ）混 匀，６５℃４ ｈ，９９℃１５ ｒａｉｎ。离心取上清，酚／氯仿／ 异戊醇（２５：２４：１）抽提３次，无水乙醇沉淀， ７００ ｍｌ／Ｌ乙醇洗涤，干燥沉淀，溶于２０ Ｉ无菌水，作 为ＰＣＲ的模板，～２０℃保存＿５ Ｊ。 １．４多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增目的片段 设计引 物为Ｐ１：ｎｔ１６０６—１６２５ ５’一ＣＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧ— ＧＡＧＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣ３’；Ｐ２： ｎｔ８７３—８５３ ５’一 ＣＣＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＣＡＡＣＧ一 ３’。ＬＡ．ＰＣＲ参数如下：９４℃预变性５ ｍｉｎ，９４℃变 性６０ ｓ。５５℃退火６０ Ｓ，７２℃延长５ ｒａｉｎ，共３５个循 环，７２℃再延长１０ ｍｉｎ。每次ＰＣＲ均设阳性对照 （ＨＢＶ重组质粒）阴性对照（ＨＢｓＡｇ阴性的健康人血 清）和空白对照（无菌水）。 １．５克隆目的片段将ＰＣＲ产物在１０ ｇ／Ｌ琼脂糖 凝胶中电泳，切取长度为２．４ ｋｂ目的片段，胶回收 ＰＣＲ产物，与ｐＧＭ Ｔ载体连接。将重组质粒转入 感受态细胞ＤＨ５ａ，氨苄青霉素和Ｘ—ｇａｌ蓝白斑法筛 选阳性菌落，提取质粒进行限制性内切酶酶切分析 鉴定。 １．６ ＤＮＡ测序 选择经内切酶鉴定ｐＧＭ Ｔ载体 内插入２．４ ｋｂ产物的菌液送检测序，由北京奥科生 物技术公司ＡＢＩ一３７３０型序列分析仪完成。测序引 物为ｐＧＭ Ｔ载体自有的Ｔ７、ＳＰ６测序引物。 １．７序列分析应用ＭｅｇＡｌｉｇｎ软件将获得的测序 Ｃｈｉｎ‘，Ｄｉｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐ删２００７ Ｆｅｂ；１１（１） 结果与ＧｅｎＢａｎｋ中８株ＨＢＶ标准株进行比较和序 列分析。８株标准株代表Ａ～Ｈ ８个基因型，分别为 Ｘ０２７６３ Ｄ００３２９、 Ｍ１２９０６、Ｘ０２４９６ Ｘ７５６６４ Ｘ７５６６３、ＡＦ１６０５０１、ＡＹ０９０４５４。 １．８长链ＰＣＲ保真性分析 将已知序列的ＨＢＶ 全基因重组质粒ｐＣＰ１０进行ＰＣＲ扩增、克隆和测 序，比较与原序列的差异，计算本方法造成的错配 率。 １．９统计学处理 某位点突变在不同组别中的发 生比采用Ｆｉｓｈｅｒ确切概率法进行比较，运用ＳＡＳ软 件分析，规定Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２结果 ２．１一般情况共得到病例组４对母（Ｉ组）婴（Ⅱ 组），对照组８例母亲（Ⅲ组），１６例研究对象ＥＬＩＳＡ 法复查显示ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗一ＨＢｅ阳性，且均经 ＰＣＲ扩增得到２．４ ｋｂ目的片段（表１）。宫内感染组 母亲和未感染组母亲ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ结果两组间差 异无统计学意义（ｔ＝一０．０８４，Ｐ＝０．９３４），ＨＢｅＡｇ ＥＬＩＳＡ结果两组间差异亦无统计学意义 （ｔ＝１．５３６，Ｐ＝０．１５６）。病例组每例母婴各随机选 取４～６个阳性克隆，对照组每例母亲各２～３个克 隆进行测序，共得到６０株克隆的测序结果，其中Ｉ 组：２０株；Ⅱ组：１９株；Ｉｌｌ组：２１株。 衰１ １６例研究对象ＥＬＩＳＡ法复查结果 Ｔａｂｌｅ １ ｌｔｅｔｅｓｔ ＥＬＩＳＡ ｒｅｓⅡＩｔｓ ｏｆｔｈｅ １６ ｏｂｊｅｃｔｓ Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ＯＤ ｖａｌｕｅ ｂｙ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ａｎａｌｙｓａｔｏｒ ２．２ ＩｔＢＶ的基因分型经与ＧｅｎＢａｎｋ中Ａ～Ｈ基 因型标准序列比较，全部６０株序列与Ｃ基因型标 准序列相似率最高，为９６．２％～９８．８％，属于Ｃ基 因型。根据ＨＢｓＡｇ第１２２位和１６０位氨基酸是否 为赖氨酸（Ｋ）或精氨酸（Ｒ），确定其血清型。结果发 现，病例组和对照组全部６０株序列在ＨＢｓＡｇ的１２２ 位为Ｋ，１６０位为Ｒ，均为ａｄｒ亚型。 维普资讯 http://www.cqvip.com
疾病控制杂志２００７年２月第１１卷第１期 ・ ３ ・ ２．３前ｓ／ｓ基因突变方式及比较 将Ｉ组、Ⅱ组、 Ⅲ组共６０株序列与Ｃ型标准株Ｍ１２９０６比对，对前 Ｓ／Ｓ基因所发生的突变进行归类分析。所有突变主 ２１／２１（Ｐ＝０．０００１）。ｎｔ３６、４３９、４６６的突变见于相 同的１６株，在３组中的发生比分别为８／２０、５／１９和 ３／２１（Ｐ＝０．１８７８），而ｎｔ２９９４发生突变的１８株包 要以替代为主，插入和缺失仅散在见于不同株的个 别位点。 ２．３．１无规律的突变 所有序列中共有１１２个位 点发生了散在的突变，即仅个别株存在此位点的突 变，其中只有一株发生突变的位点有９７个，可见于 两株序列中的突变位点共１５个。发生替代的１００ 个位点以Ｔ—Ｃ（３０．０％）、Ａ—Ｇ（２３．０％）、Ｇ—Ａ （１６．０％）、Ｃ—Ｔ（１５．０％）为主。见表２。 表２无规律的突变方式及其分布 Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｒｒｅｇｕｌａｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ２．３．２仅见于发生宫内感染的新生儿和对照组的 母亲的突变对病毒发生的变异进行归类，发现以 下位点的突变在Ｉ组中未发生，只见于Ⅱ组和Ⅲ组， ３组中的发生比统计结果如下（表３）。这样的位点 共１６个，除了发生比分别为０／２０、１／１９、３／２１的４ 个位点其发生比在３组中的差别无统计学意义（Ｐ ＝０．２５７），其余１２个位点的突变在３组中的发生比 差异有统计学意义。此类突变中除ｎｔ３１１４、７０、 ３０８、３７３、６７６为沉默突变外，其余位点突变均为错 义突变。 表３只见于Ⅱ组和Ⅱ组的突变位点及发生比 Ｔａｂｌｅ ３ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎｌｙ ｉｎ ｇｒｏｕｐⅡａｎｄⅡａｎｄ ｉｔｓ ｒａｔｅ ２．３．３ ３组中均存在此位点发生突变，但发生比不 同 ｎｔ２８２０、２８８３、２９３８、３０９９、３１３８、３１４１、３１９８、 ３２０３、１６７、２７４、３２８、３８５、５９８、６７０、６７３、７０８等１６个 位点在Ｉ组、Ⅱ组和Ⅲ组中均有突变发生，其发生比 分别为１２／２０、１４／１９和１８／２１（Ｐ＝０．１８７８）。 ｎｔ２９００在Ｉ组中为１２／２０，而在Ⅱ组和Ⅲ组的发生 比分别为１８／１９和２０／２１（Ｐ＝０．００３４），而ｎｔ２８７４ 突变在３组中的的发生比分别为１２／２０、１９／１９和 括以上１６株，仅在Ｉ组和Ⅱ组中各增加了１株，发 生比在３组中分别为９／２０、６／１９和３／２１ （Ｐ＝０．１０１９）。 ２．３．４ 所有序列中共有的突变位点 ｎｔ２８８８（Ｔ— Ａ）、２８８９（Ｃ—Ｔ）、２８９０（Ａ—Ｃ）、２９０６（Ａ—Ｃ）、２９０７ （Ｃ—Ａ）、３００５（Ｔ—Ｃ）、３００６（Ｔ—Ｃ）、３１９４（Ｔ— Ｃ）、２４１（Ｔ—Ｃ）、５７９（Ｃ—Ｔ）。 ２．４保真性分析结果 将已知序列的ＨＢＶ全基 因重组质粒进行ＰＣＲ扩增、克隆和测序，统计发生 突变的情况。结果在所测８０８ ｂｐ碱基中，仅有１个 碱基出现错配，准确性达９９．８８％，错配率为０．１２％。 ３讨论 ＨＢＶ在宿主体内多数表现为异质性群体，故以 此模板扩增的ＰＣＲ产物亦为异质性分子群体Ｌ６』。 采用将ＰＣＲ产物克隆入载体中进行测序的方法，反 映的是某单一病毒株的序列，所以同一ＰＣＲ产物的 不同克隆分子的测序结果可以反映整个病毒感染株 的情况。一般的ＰＣＲ过程使用的Ｔａｑ酶扩增效率 高，但不具有３’一５’外切酶活性，所以不能精确扩 增长的目的片段，本研究中新生儿血清标本中病毒 含量较低，从而又限制了具有３’一５’外切酶活性、 保真性较高而扩增效率较低的ＤＮＡ聚合酶的使 用。实验中采用了ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶， 该酶具有３’一５’外切酶活性，能纠正错误掺入的核 苷酸，保真性是常规Ｔａｑ聚合酶的５倍以上，且扩增 效率与之相当，在本实验的保真性分析中，核苷酸的 人为错配率仅为１．２ ｂｐ／ｋｂ。 本研究利用上述方法对发生宫内感染的母亲及 其新生儿和未发生宫内感染的母亲ＨＢＶ前Ｓ／Ｓ基 因的进行分析，避免了以ＰＣＲ产物直接测序研究 ＨＢＶ突变的局限性且保真性较高。本研究中３组 ＨＢＶ的基因型和血清亚型相同，且符合在中国的地 理分布特征Ｌ７』，说明宫内感染的发生可能与ＨＢＶ 的基因型和血清亚型无关。本研究对所有突变进行 归类分析，真实地反映了病例组和对照组的突变全 貌。综合考虑发生突变的生物学意义和统计学意 义，筛选出研究中的第２类突变，即Ｉ组中未发生、 只见于Ⅱ组和Ⅲ组的１６个位点。以上位点突变在 宫内感染组母婴没有或者很少发生，而在未发生宫 内感染的母亲中则多见，提示这些位点未发生突变 的毒株似乎更易从母体传播给胎儿，与宫内感染的 维普资讯 http://www.cqvip.com
・４・ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐ ２００７ Ｆｅｂ；１１（１） 发生关系紧密。其中ｎｔ２７４９、３０８６、３０９、６７６、６８４、 ３１１４、７０、１６１、３０８、２１３、３７３、４０５等１２个位点突变 在３组中的发生比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。 此类突变中除ｎｔ３１１４、７０、３０８、３７３、６７６为沉默突变 或这几段肽段编码的蛋白很可能在介导ＨＢＶ通过 胎盘的过程中起到重要的作用。由此也可以推测这 样的结论，ＨＢＶ某位点突变的生物学意义要看该突 变对其所在的、具有某特定功能的肽段的整体功能 改变所造成的影响，肽段中不同位置的氨基酸替代 对其编码蛋白功能的影响可能是相同或相似的。 外，其余７个位点突变均为错义突变，这样的错义突 变在前Ｓ１和前ｓ２区各有一个，其余５个均在Ｓ区。 宫内感染的发生有两个关键环节，一是ＨＢＶ 笔者所在科室在对ＨＢＶ宫内感染机制的研究 中提出两条可能的途径【１１ Ｊ，血源性和细胞源性途 要通过胎盘屏障，二是ＨＢＶ要被新宿主所选择， ＨＢＶ要进入胎盘细胞就需要与细胞膜上的受体结 合。外膜蛋白暴露于病毒的表面，直接与细胞接触、 结合、介导病毒颗粒的进入。目前对于ＨＢＶ如何 与靶细胞上的受体结合、进入细胞的具体机制还不 清楚，但普遍认为，前Ｓ蛋白是病毒与细胞结合的重 要区域。前Ｓ１区的ａａ２１～４７是人肝细胞与病毒颗 粒结合的部位－８ Ｊ，Ｔ、Ｂ细胞和单核细胞也可表达或 经激活后表达这一肽段的特异性受体【９ Ｊ，虽然本研 究中前Ｓ区的两个错义突变未发生在该区域，但是 除肝细胞外，在胎盘细胞膜上可能还存在其它的受 体，如ＩｇＡ受体、ＩＬ．６、ＡＳＧＰＲ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＰＨＳＲ 等－ｌ ，能够与ＨＢＶ前Ｓ／Ｓ蛋白的相应区段结合，因 而，ＨＢＶ可能会凭借这些细胞或表达这一受体的胎 盘细胞而通过胎盘屏障，进入胎儿体内。所以，如果 前Ｓ／Ｓ基因某些位点发生突变，进而影响ＨＢＶ外 膜的编码合成，可能使细胞膜上相应受体不能识别 或结合发生了改变的外膜蛋白，进而使ＨＢＶ对细 胞的感染能力下降，发生宫内感染的机率下降。相 反，如果某些关键位点未发生突变，可能其编码蛋白 就会被相应受体识别，进一步感染细胞，使ＨＢＶ得 以通过胎盘屏障，从而发生宫内感染。本研究中 ｎｔ２７４９、３０８６、３０９、６８４、１６１、２１３、４０５引起的错义突 变在未发生宫内感染的ＨＢｓＡｇ阳性母亲中的发生 比明显高于宫内感染组，推测不具有上述突变的 ＨＢＶ株可能更容易引起新生儿宫内感染。本课题 组Ｓｕ等－４ Ｊ研究发现，分别引起前Ｓ１区Ｌ２１Ｐ、Ｓ区 Ａ４７Ｔ、Ｔ８２Ｉ和Ｐ１１０Ｌ的氨基酸替代的ｎｔ２９０９、 ｎｔ２９３、ｎｔ３９９和ｎｔ４８３位点突变，在发生宫内感染的 新生儿及其母亲中的发生率明显低于未发生宫内感 染的ＨＢｓＡｇ阳性母亲，具体位点与本研究结果不一 致。但是本研究中ｎｔ２７４９、１６１、３０９、４０５的突变，分 别引起前Ｓ１区Ｋ１０Ｑ、Ｓ区Ｔ４５Ａ、Ｐ９４Ｌ和￥１２６Ｉ的 氨基酸替代，这些氨基酸发生变化的区域与Ｓｕ等研 究中的氨基酸替代发生区域位置较为接近，推测两 次研究中的这些氨基酸位点所在的区域可能属于某 段或者某几段具有相同生物学意义的肽段。而这段 径。本次研究为ＨＢＶ可能通过细胞途径感染胎儿 提供理论支持，进一步探讨细胞因子多态性与ＨＢＶ 宫内感染的易感性的关系，为研究宫内感染的机制 提供科学依据【 Ｊ。 【参考文献】 ［１］ＸｕＤＺ，ＹａｎＹＰ，Ｃｈｏｉ ＢＣ，ｅｔ ａｔ．Ｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ａ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２００２，６７（１）：２０．２６． ［２］Ｎｇｕｉ ＳＬ，Ｈａｌｌｅｔ Ｒ，Ｔｅｏ ＣＧ．Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｉａｔｒｏｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｒｅｖ ＭｅｄⅥ ，１９９９，９（３）：１８３．２０９． ［３］苏海霞，囝永平，徐德忠，等．官内传播中乙型肝炎病毒前Ｓ／Ｓ 基因序列分析［Ｊ］．中国公共卫生，２００３，１９（７）：７７０．７７２． ［４］ＳｕＨＸ，ＸｕＤＺ，ＬｉＤ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅ ｈｅｐａｔｉ－ ｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ【Ｊ Ｊ．Ｊ ＭｅｄⅥ ， ２００５，７７（２）：１８０－１８７． ［５］ 苏海霞，闫永平，徐德忠，等．官内感染乙型肝炎病毒的新生儿 及其母亲ＨＢＶ基因结构分析［Ｊ］．第四军医大学学报，２００３， ２４（２）：９７．１０１． ［６］ＬｉｕＣＪ，ＣｈｅｎＰＪ，Ｌａｉ ＭＹ，ｅｔ ａ１．ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ ｖａｒｉｎａｔｓｉｎｐａ． ｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｉｌａ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄｓ ａｎｄ ｆｕｌ１．１ｅｎｇｔｈ ｖｉｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００１，３４（３）：５８３－５８９． ［７】Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕ￣ｚ Ａ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｓ．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｕｒｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ：ｃｏｍ． ｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｒｅｖ ＭｅｄⅥ ，２００４，１４ （１）：３．１６． ［８］Ｌｅ Ｓｅｖｅｃ Ｊ，Ｃｈｏｕｔｅａｎ Ｐ，Ｃａｎｎｉｅ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｕｒｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅ．Ｓ１ ｄｏｍａｉｎ［Ｊ］．ＪⅥ ，１９９９，７３（３）：２０５２．２０５７． ［９］ 骆抗先．乙型肝炎基础和临床［Ｍ］．第２版．北京：人民卫生 出版社．２００１． ［１０］ 陈敏，张军．陈睦传，等．乙型肝炎受体研究进展［Ｊ］．病毒学 报，２００２，ｌ８（２）：１８５．１９３． ［１１］Ｘｕ ＤＺ，Ｙａｎ ＹＰ，Ｚｏｕ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔｌａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｔｒｎａｓｍｉｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏ１．２００１，１８Ｓ（４）：９８１－９８７． ［１２］ 徐元勇，门可，邵中军，等．新生儿乙型肝炎病毒官内感染及 其影响因素的随访研究［Ｊ］．疾病控制杂志，２００６，１０（１）： ４２．４４． （收稿日期２００６．０９．０４） （修回日期２００６—１２．０４） （陈国平校）
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容