低温胁迫下苦瓜苗期生理变化与耐冷性评价的关系分析

低温胁迫下苦瓜苗期生理变化与耐冷性评价的关系分析

作者：陈小凤 黄如葵 黄玉辉 冯诚诚 黄熊娟 梁家作 刘杏连 来源：《南方农业学报》2017年第07期

摘要：【目的】分析低温胁迫下苦瓜苗期生理变化与耐冷性评价的关系，筛选适宜苦瓜苗期耐冷性评价的取材时期，为提高苦瓜耐冷性评价的准确性和可靠性提供参考依据。【方法】对已知耐冷性存在差异的苦瓜材料MC108、MC45和MC6幼苗进行10 ℃低温胁迫，分别测定其叶片在胁迫0、2、4、6、8和10 d时的生理指标，绘图显示生理指标的变化情况，结合隶属函数值对各胁迫时期苦瓜耐冷性的评价结果，筛选适宜苦瓜苗期耐冷性评价的取材时期。【结果】耐冷性存在差异的苦瓜材料对冷害胁迫反应机制不同，与低温胁迫0 d（对照）相比，低温胁迫第10 d时冷敏材料MC6的可溶性蛋白含量降幅较大，脯氨酸（Pro）含量增加量更多；與MC45和MC6相比，低温胁迫0、2、4、6、8和10 d时耐冷材料MC108的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性变幅相对较小。除丙二醛（MDA）含量峰值出现的时间不同外，MC108、MC45和MC6的Pro、可溶性蛋白含量及SOD、POD活性降低的共同时间点均为低温胁迫处理第10 d。结合隶属函数值对苦瓜耐冷性的评价结果判断，低温胁迫处理第10 d的叶片生理指标适宜作为其苗期耐冷性评价指标。【结论】苦瓜材料幼苗进行10 ℃低温胁迫处理第10 d是进行苗期耐冷性评价的适宜取材时期。 关键词： 苦瓜；低温胁迫；生理指标；耐冷性评价

中图分类号： S642.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）07-1237-05 0 引言

【研究意义】苦瓜（Momordica charantia L.）起源于东南亚的热带地区，属喜温蔬菜，气温低于10 ℃则生长发育不良。在春季提早栽培中，苦瓜苗期遇低温冷害天气会生长缓慢，甚至形成僵苗而停止生长，影响苦瓜种植范围的扩大和上市时节的调节，生产上也缺乏耐冷性强且综合性状好的苦瓜品种。苦瓜耐冷育种多采用生理生化指标法须首先对育种材料进行苗期耐冷性评价。由于不同苦瓜育种材料对低温冷害胁迫有不同的反应机制，获取精确的生理变化指标已成为评价其耐冷性的关键。因此，分析低温胁迫下苦瓜苗期生理指标变化与其耐冷性评价的关系，对促进苦瓜耐冷育种具有重要意义。【前人研究进展】黄玉辉等（2008a，2008b）研究认为，10 ℃胁迫第7 d时苦瓜叶片的丙二醛（MDA）相对增加量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性及可溶性糖含量可作为苦瓜耐冷性评价的指标。利用生理指标变化进行作物耐冷性评价，其低温胁迫处理方法有3种类型，一是直接利用某一低温进行相同时间处理（黄玉辉等，2008a，2008b）；二是设置不同温度梯度进行相同时间处理（许桂芳

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等，2009）；三是与自然条件下不同环境温度进行比较（洪永聪等，2009；张晓红等，2015），其共同点是未设置同一温度下不同胁迫时间以获得更精确的生理指标变化情况。张红梅等（2011）研究发现，低温弱光（昼温15 ℃/夜温7 ℃，80 μmol/8 m2·s）处理10 d后苦瓜的形态学指标、生理及光合指标的综合隶属函数值可用于对参试苦瓜材料进行耐低温弱光性分类。董万鹏等（2015）研究发现，西番莲应对低温的内在变化可反映为生理生化变化，并可用来鉴定与评价其耐冷性。【本研究切入点】目前，对苦瓜材料耐冷性评价由于评价条件、低温胁迫时间和方法不同，获得的评价结果也不一致或相互矛盾，降低了耐冷性评价的准确性和可靠性，而利用生理生化指标法对苦瓜苗期进行耐冷性评价时，针对利用生理指标测定适宜取材时期的研究未见报道。【拟解决的关键问题】利用已知耐冷性存在差异的苦瓜材料进行苗期低温胁迫处理，测定其不同胁迫时期叶片的生理指标，筛选苦瓜苗期耐冷性评价的适宜取材时期，为提高其耐冷性评价的准确性和可靠性提供参考依据。 1 材料与方法 1. 1 试验材料

供试苦瓜材料为经鉴定存在耐冷性差异的材料MC108、中间材料MC45和冷敏材料MC6，由广西农业科学院蔬菜研究所提供。 1. 2 试验方法

1. 2. 1 低温胁迫处理 苦瓜种子催芽后，将露白种子播于穴盘中，采用同一穴盘不同材料间隔育苗法育苗，按正常方法进行苗期管理。待苗长至4叶1心时移至人工气候箱中，在湿度90%、温度10 ℃条件下进行冷胁迫处理2、4、6、8和10 d，以胁迫处理0 d为对照，分别取各胁迫时期苦瓜功能叶，剪碎混均后进行生理指标测定。每处理3次重复，每重复15株。 1. 2. 2 冷害指数测定 处理后第10 d进行冷害指数测定。冷害指数中的冷害级别参照于贤昌等（1998）的方法进行分级。冷害指数=∑（各级冷害株数×冷害级数）/总株数×100。冷害指数与植物的耐冷性呈负相关，冷害指数越低表明植株越耐冷（黄玉辉等，2008a）。 1. 2. 3 干重和鲜重测定 将子叶出土刚露真叶的幼苗置于10 ℃培养箱中进行冷害胁迫处理，处理后第10 d进行干、鲜重测定，以置于室外常温下生长第10 d幼苗为对照。每处理3次重复，每重复15株。单株重为每重复株数重量的平均值。

1. 2. 4 生理生化指标测定 可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250染色法、脯氨酸（Pro）含量用酸性茚三酮法、MDA含量用硫代巴比妥酸法、SOD活性用氮蓝四唑还原法、POD活性用愈创木酚法进行测定。 1. 3 统计分析

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利用Excel 2003进行数据点折线图分析，用DPS 3.01进行新复极差方差分析。隶属函数值的计算公式如下：

综合隶属函数值Xi（u）=[∑Xij（u）]/n（j=1）

正向指标隶属函数Xij（u）=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin） 负向指标隶属函数值Xij（u）=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）

式中，Xij（u）表示第i个材料第j个指标的隶属函数值；Xij表示第i个材料第j个指标的测定值；Xjmin表示第j个指标在试验材料中的最小值；Xjmax表示第j个指标在试验材料中的最大值；Xi（u）表示第i个材料的平均隶属函数值；n表示指标数。 2 结果与分析

2. 1 供试苦瓜材料的耐冷性

由表1可知，低温处理10 d时，低温胁迫苦瓜材料MC6、MC45和MC108间的冷害指数、鲜重和干重等指标均存在极显著差异（P0.05），说明低温胁迫下耐冷性强的苦瓜材料生长速度更快，累积的干物质更多。结合多年的田间鉴定结果，MC108为耐冷材料，MC45为中间材料，MC6为冷敏材料。

2. 2 低温胁迫对苦瓜生理变化的影响

2. 2. 1 对MDA含量的影响 从图1可看出，随着低温胁迫时间的延长，MC6、MC45和MC108的MDA含量峰值分别在胁迫第2、6和8 d出现，说明MC6的细胞膜在低温胁迫第2 d即出现较严重损伤，耐低温能力较弱，而MC108的细胞膜在低温胁迫第8 d才受到损伤，耐低温能力较强。至胁迫第10 d时，所有参试材料的MDA含量均低于其胁迫0 d（对照）时的含量，说明胁迫第10 d时各参试材料的MDA指标变化达一致，此时的MDA含量可作为苦瓜苗期耐冷性评价指标。

2. 2. 2 对Pro和可溶性蛋白含量的影响 图2-A显示，各苦瓜材料的Pro含量均随着低温胁迫时间的延长而大量累积，胁迫第6 d时Pro含量有一定幅度下降后继续累积，至胁迫第10 d时累积到一个很高的量，与胁迫0 d（对照）时相比，耐冷性弱的材料MC6具有更大的增加量，即Pro含量相對值（与对照数值相减获得的值）与苦瓜的耐冷性呈负相关。从图2-B可看出，各苦瓜材料的可溶性蛋白含量均随着低温胁迫时间的延长而增加，胁迫第8 d时增加至峰值，然后下降，至胁迫第10 d时下降至低于胁迫0 d时（对照）的水平；与胁迫0 d（对照）时相比，耐冷性弱的苦瓜材料MC6具有更大的降幅，即可溶性蛋白含量相对值与苦瓜的耐冷

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性呈正相关。说明Pro和可溶性蛋白作为苦瓜细胞内的渗透调节物质，其含量随着低温胁迫时间延长而变化的趋势不一致。

2. 2. 3 对POD和SOD活性的影响 图3-A显示，低温胁迫下3个苦瓜材料的POD活性均呈先升高后降低再升高再降低的变化趋势，胁迫第6 d时出现第2个POD活性变化峰值，然后开始下降，但胁迫至第10 d时3个材料的POD活性均仍高于相应胁迫0 d（对照）时的POD活性，并维持在较高水平，尤其以MC108的POD活性更高。从图3-B可看出，低温胁迫下3个苦瓜材料的SOD活性均呈先降低后升高再降低的变化趋势，胁迫至第4 d时出现SOD活性变化峰值，然后开始下降，至胁迫第10 d时下降至低于相应胁迫0 d（对照）时的水平，尤其以MC6的SOD活性更低。说明同为膜保护系统组成部分的POD和SOD，其活性随着胁迫时间延长而变化的趋势不完全一致，其中，与耐冷性弱的材料MC6比，耐冷性强材料MC108叶片的POD活性绝对值一直维持在较高水平，SOD活性绝对值则稳定在一定范围内。 综合2.2.1、2.2.2和2.2.3的分析结果可知，耐冷性存在差异的苦瓜材料苗期对冷害胁迫的反应机制不同，用生理生化指标法对其进行耐冷性鉴定应找到生理生化指标变化的共同时间点作为测定鉴定指标的时期，才能提高鉴定和评价的可比性；除Pro含量随胁迫时间的延长而增加外，其余生理指标均随胁迫时间的延长而降低，降低的共同时间点均为胁迫处理第10 d，说明此时是所测定生理生化指标共同变化的时间点。因此，初步认为苦瓜苗期低温胁迫第10 d的生理生化指标适宜作为其耐冷性鉴定指标。 2. 3 综合隶属函数值对苦瓜耐冷性评价的检验结果

综合隶属函数值平均法能消除个别评价指标评价的片面性，使供试材料的耐冷性差异具有可比性，综合隶属函数值越大，说明材料耐冷性越强。由表2可知，低温胁迫第2、4和6 d，冷敏材料MC6和中间材料MC45可评价为耐冷材料；胁迫第8 d后，耐冷性鉴定结果才与供试材料的耐冷性一致，但在胁迫第8 d时耐冷性强材料的MDA含量（图1）才达峰值，至胁迫第10 d，各指标的变化才一致。可见，胁迫处理第10 d苦瓜叶片的生理指标宜作为苦瓜苗期耐冷性评价指标。 3 讨论

3. 1 关于低温胁迫对苦瓜生理生化变化的影响

本研究结果表明，随着低温胁迫时间的延长，耐冷性强的苦瓜材料MC108累积MDA的速率相对较小且出现急剧增加的时间相对较迟，表明MDA是膜质过氧化产物，其含量可反映膜损伤程度，耐冷性强的材料对低温胁迫有更强和更持久的耐受能力，与黄玉辉等（2008b）对苦瓜、阎世江等（2013）对黄瓜的研究结果一致。

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Pro和可溶性蛋白作为植物细胞内重要的渗透调节物质，有助于增加细胞持水能力而增强作物的耐冷性（杨德浩等，2004），前者是水合能力较强的氨基酸，后者为亲水胶体性较强的物质。在本研究中，随着低温胁迫时间的延长，3个耐冷苦瓜材料的Pro累积均增加，而冷敏材料MC6具有更大的增加量，表明冷胁迫对其伤害更明显，需增加更多的Pro累积以帮助细胞持水，即其Pro含量绝对值与苦瓜的耐冷性呈负相关。该结果与陈小凤等（2007）对干旱胁迫时甘蔗Pro增加量与作物耐旱性成负相关的研究结果一致，与董万鹏等（2015）对西番莲的研究结果相反，原因可能是不同作物对低温胁迫的反应机制不一致。

POD和SOD是植物膜保护系统的组成部分，能在逆境胁迫中清除活性氧自由基，维持体内的活性氧代谢平衡、保护膜结构，使植物能在一定程度上忍耐、减缓或抵抗逆境胁迫，其活性与植物抗寒性呈一定的相关性（李美茹等，1995）。在本研究中，随着低温胁迫时间的延长，耐冷性强材料MC108叶片的POD活性绝对值一直维持在较高水平，SOD活性绝对值则稳定在一定范围内，且绝对值的降幅也比冷敏材料MC6小，能使活性氧代谢处于一定的平衡状态，避免活性氧等各种自由基的大量积累，减轻膜脂过氧化作用，降低细胞膜的破坏程度，与苦瓜的耐冷性成正相关，与阎世江等（2013）对黄瓜的研究结果一致。

综上所述，在低温胁迫下，各耐冷苦瓜材料的生理指标变化情况与其实际耐冷性相符，这些指标均可参与进行苦瓜耐冷性综合评价，并占有一定比重。但为了更加精确地评价不同特性的苦瓜材料，还应测定更多生理指标用来参与苦瓜耐冷性评价。 3. 2 关于筛选苦瓜苗期耐冷性鉴定的适宜取材时期

本研究结果表明，耐冷性存在差异的苦瓜材料对低温胁迫有不同的反应机制，耐冷性强的材料MC108在胁迫第2、4和6 d可评价为冷敏材料或中间材料，说明在冷胁迫开始时，冷害对其细胞的损害轻，其生理指标变化不明显。在低温胁迫第2和4 d，冷敏材料MC6可评价为耐冷材料；在低温胁迫第6 d，中间材料MC45可评价为耐冷材料，说明耐冷性弱的材料在低温胁迫开始时细胞即受损伤，表现为生理指标变化明显。可见，若利用胁迫早期的生理指标进行苦瓜材料耐冷性鉴定和评价，就会降低鉴定的准确性和可靠性。

本研究仅进行苦瓜苗期低温胁迫10 d处理，胁迫处理10 d后各材料的生理指标变化情况仍有待进一步观测。 4 结论

利用综合隶属函数值对苦瓜耐冷性综合评价结果进行检验，并结合低温胁迫苦瓜苗期生理指标的变化结果判断，苦瓜材料幼苗进行10 ℃低温胁迫处理第10 d是进行苗期耐冷性评价的适宜取材时期。 参考文献：

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陈小凤，李杨瑞，叶燕萍，莫云川. 2007. 利用叶绿素荧光参数和净光合速率评价引进禾本科牧草的抗旱性[J]. 草业科学，24（5）：53-57. [Chen X F，Li Y R ，Ye Y P ，Mo Y C. 2007. Drought resistance assessment using chlorophyll fluo-rescence parameters and net photosynthesis in introduced gramineous forage[J]. Pratacultural Science，24（5）：53- 57.]

董萬鹏，罗充，龙秀琴，胡静，李燕. 2015. 低温胁迫对西番莲抗寒生理指标的影响[J]. 植物生理学报，51（5）：771-777. [Dong W P，Luo C，Long X Q，Hu J，Li Y. 2015. Effects of low temperature stress on physiological indexes of cold resistance of Passiflora edulis[J]. Plant Physiology Journal，51（5）：771-777.]

洪永聪，王玉，丁兆堂，张新富. 2009. 越冬期茶树叶片生理指数分析及抗寒种质材料的筛选[J]. 中国农学通报，25（16）：215-218. [Hong Y C，Wang Y，Ding Z T，Zhang X F. 2009. Cold resistant screening of tea germplasm resources applied by physiological index of leaves in wintering pe-riod[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，25（16）：215-218.]

黄玉辉，罗海玲，韦莉萍，周生茂，方锋学. 2008a. 苦瓜耐冷性生理指标研究[J]. 广西农业科学，39（6）：805-807. [Huang Y H，Luo H L，Wei L P，Zhou S M，Fang F X. 2008a. Phy-siological criteria for cold tolerance evaluation in balsam pear[J]. Journal of Guangxi Agricultural Sciences，39（6）：805-807.]

黄玉辉，罗海玲，张曼. 2008b. 不同苦瓜品种种子发芽和苗期耐冷性差异的研究[J]. 长江蔬菜（学术版），（20）：11-13. [Huang Y H，Luo H L，Zhang M. 2008b. Study on cold-resistance of different bitter gourd cultivars in germination and seedling stages[J]. Journal of Changjiang Vegetables，（20）：11-13.]

李美茹，刘鸿先，王以柔. 1995. 植物细胞中的抗寒物质及其与植物抗冷性的关系[J]. 植物生理学通讯，（5）：328-334. [Li M R，Lui H X，Wang Y R. 1995. Antifreexing subatrances in plant cell and relation to cold resistance[J]. Plant Physiology Communication，（5）：328-334.] 许桂芳，张朝阳，向佐湘. 2009. 利用隶属函数法对4种珍珠菜属植物的抗寒性综合评价[J]. 西北林学院学报，24（3）：24-26. [Xu G F，Zhang Z Y，Xiang Z X. 2009. Comprehensive evaluation of cold resistance on four Lysimachia plants by subordinate function values analysis[J]. Journal of Northwest Forestry University，24（3）：24-26.]

阎世江，刘洁，张继宁，司龙亭. 2013. 低温对黄瓜若干生理指标的影响[J]. 河北科技师范学院学报，27（2）：12-17. [Yan S J， Liu J， Zhang J N， Si L T. 2013. Effects of low temperature and poor light on physiological index in cucumber[J]. Journal of Hebei Normal University of Science & Technology， 27（2）：12-17.]

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杨德浩，杨敏生，王进茂，王世兰，李帅英，叶振魁，Naujoks G. 2004. 欧洲白桦苗期低温胁迫时膜系统的变化[J]. 东北林业大学学报，32（6）：13-15. [Yang D H，Yang M S，Wang J M，Wang S L，Li S Y，Ye Z K，Naujoks G. 2004. Europe Birch’s membrane system changes under low temperature menace in the period of seedling[J]. Journal Northeast Forestry University，32（6）：13-15.]

于贤昌， 刑禹贤， 马红，魏珉. 1998. 不同砧木与接穗对黄瓜嫁接苗抗冷性的影响[J]. 中国农业科学， 31（2）：41-47. [Yu X C， Xing Y X， Ma H， Wei M. 1998. Effect of di-fferent rootstocks and scions on chilling tolerance in grafted cucumber seedlings[J]. Scientia Agriculture Sinica， 31（2）：41-47.]

张红梅，金海军，丁小涛，余纪柱. 2011. 低温弱光下不同苦瓜自交系的生长和生理特性[J]. 上海农业学报，27（3）：21-25. [Zhang H M，Jin H J，Ding X T，Yu J Z. 2011. The growth and physiological characteristics of inbred lines of balsam pear under low temperature and light intemsity[J]. Acta Agriculture Shanghai，27（3）：21-25.]

张晓红，冯梁杰，杨特武，徐正华，胡立勇. 2015. 冬季低温胁迫对油菜抗寒生理特性的影响[J]. 植物生理学报，51（5）：737-746. [Zhang X H，Feng L J，Yang T W，Xu Z H，Hu L Y. 2015. Effects of chilling stress on physiological characteristics of rapeseed seedlings in winter[J]. Plant Physiology Journal，51（5）：737-746.] （責任编辑 思利华）