世界中西医结合杂志２００７年第２卷第２期 Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００７，Ｖｏ１．２，Ｎ０．２ ・８７・ 质量２（）（）～２２０ ｇ，购自湖南中医药大学实验动物 中心。 只大鼠经尾静脉一次性注射１ 的聚乙烯亚胺 （ＰＥＩ）溶液１ ｍＩ （用生理盐水配制，用ＨＣ１调节 ｐＨ至７．４），２０ ｒａｉｎ后处死动物，取肾皮质，切成 １．１．２药品与试剂 肾特灵购自湖南中医药大学 附一医院药剂科，药物组成：生地９ ｇ，山茱萸１２ ｇ， 牡丹皮９ ｇ，茯苓９ ｇ，党参２０ ｇ，黄芪３０ ｇ，补骨脂 １２ ｇ，肉苁蓉１２ ｇ，淫羊藿１５ ｇ。上药制成每１ ｍＩ 含生药０．８６ ｇ的水煎剂，加入苯甲酸钠，用玻璃瓶封 装，置冰柜中保存备用。泼尼松：浙江仙琚制药有限 公司生产，５ ｒａｇ／片，产品批号：０５１１５４，用注射用水配 制成０．４７ ｍｇ／ｍＬ浓度的溶液。阿霉素：意大利法玛 西亚普强公司生产，１０ ｒａｇ／支。 １ ｍｍ。大小。放入３ 戊二醛固定液中４℃预固定 １ ｈ，然后用０．１ ｍｏｌ／Ｉ 二甲砷酸钠缓冲液冲洗，放入 １ 四氧化锇中在４￣Ｃ固定２ ｈ，经丙酮逐级脱水、渗透， Ｅｐｏｎ８１２树脂包埋等电镜标本常规处理。所有标本于 厚切片下定位后，以肾小球为中心作５０／ａｍ超薄切片， 醋酸铀及枸橼酸钠双重染色，在透射电镜下观察，并拍 摄照片ｌ＿２ 。其余大鼠处死后，取肾皮质切成２ ｉｎｉ￣３大 小，立即放入１０ 福尔马林中固定，常规脱水，石蜡包 埋切片，Ａｌｃｉａｎ蓝（ＡＢ）染色。将切片放在图像分析仪 下进行分析，计数染色深的肾小球数和深染色率＿２］。 １．２．４统计方法 数据采用ＳＰＳＳ１１．０软件进行 处理，两组间比较用ｔ检验。 ２ 结 果 其他试剂：聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）、Ａｌｃｉａｎ蓝（ＡＢ）、 戊二醛固定液、四氧化锇、丙酮、醋酸铀、枸橼酸铅、 二甲砷酸钠。 １．１．３实验仪器１．２实验方法 透射电镜、图像分析仪。 １．２．１动物分组与给药 将大鼠随机分为正常组 （１０只）和造模组（３０只），饲养于代谢笼中。将造模 组大鼠尾静脉一次性注射阿霉素５．５ ｍｇ／ｋｇ＿１］。造 模后第１４ ｄ，造模组大鼠按尿蛋白量先分层，再随机 分为模型组、泼尼松组、肾特灵加泼尼松组，每组１０ 只。从造模后第１５ ｄ开始给药，泼尼松组第１～７ ｄ 给药１３．５ ｍＬ／ｋｇ（相当于６．３ ｍｇ／ｋｇ）；第８－－１５ ｄ， 每天减量１０ ，第１６～２４ ｄ每天给药２．７ ｍＬ／ｋｇ （相当于１．２５ ｍｇ／ｋｇ）；肾特灵加泼尼松组给予同剂 量泼尼松，再加上肾特灵１３．５ ｍＩ ／ｋｇ；模型组和正 ２．１尿蛋白量的比较 正常组在５个时间点２４ ｈ尿蛋白量比较，无统 计学意义（Ｐ＞０．０５），提示正常大鼠在不施加实验 因素的条件下２４ ｈ尿蛋白量稳定。注射阿霉素后， 造模组２４ ｈ尿蛋白量与正常组比较，第７ ｄ无统计 学意义（Ｐ＞０．０５），第１４ ｄ明显高于正常组（Ｐ＜ ０．０１），提示此时造模成功。结果见表１。给药后， 模型组２４ ｈ尿蛋白量逐渐升高，在第２４ ｄ达到高 峰；在同一时间点泼尼松组、肾特灵加泼尼松组均明 显低于模型组（Ｐ＜０．０１），提示两组药物均能减少 尿蛋白量，其中，肾特灵加泼尼松组给药后第７ ｄ、１５ ｄ、２４ ｄ的尿蛋白量与泼尼松组比较，具有统计学意 义（Ｐ＜０．０５）。结果见表２。 表１ 两组给药造模后尿蛋白量比较 （ ±Ｓ，ｍｇ／ｄ） 毒 鬟 。 ｜ 正 鞋 ０ 常组给予等量的生理盐水。各组于每天上午８时一 次给药，连续２４ ｄ。 １．２．２检测指标 １．２．２．１尿蛋白 用代谢笼收集造模后大鼠第７ ｄ、第１４ ｄ及给药后第７ ｄ、第１５ ｄ、第２４ ｄ的２４ ｈ 尿液，用双缩脲法检测尿蛋白。 １．２．２．２血清白蛋白、胆固醇、血肌酐及尿素氮 给药前及末次给药２４ ｈ后取大鼠血清检测血清白 蛋白、胆固醇、血肌酐及尿素氮。 １．２．２．３ 电荷屏障末次给药２４ ｈ后，每组各取５ ｎ磐 销７矗薯 鬣髦主Ｏ．ｉ８ ． 辖１４ ｄ曩 Ｉ￣０２￣０． ｊ 造梭鲺 蠹 ± ｎ｜ １２ １．毫 注：与正常组比较， Ｐ％０．０１ 表２各组大鼠２４ ｈ尿蛋白量比较 ｔ正 组 ≯ － －博 ０ 曩薯一 ｎ ： 。警 ｜鼍 算 ０ ≯ 。 薯ｌ ａ ± ｜ 薯露Ｉ 鼍 ａ 奢 ｉ；０４ｉ０ ｉａ ± ≤爱 ｜ 梭毽组｜ ｌ｜ 薯｜ 。 ｜｜ ２３ｉ ｏ５士 慧蕊 誊 吼± ｜誊＃ 蛆ｉ ３± 鹳 董 浚昆捻组 ｊ 薯鬈｜ 。豢 ｔ｜。 ｔ ２５±３｛ ｂ ±鐾 ６叁。▲ ．９毽±２． 鍪 孔± ８ 。 。 ＿ － －８± 氇 ２± ２ ｜ 一 瓷特灵弧泼昆松组 注：与正常组比较， Ｐ％０．Ｏ１；与模型组比较， Ｐ％０．Ｏ１；与泼尼松组比较， Ｐ＜Ｏ．０５ ２．２各组治疗前后血清白蛋白、胆固醇、血肌酐及 尿素氮比较给药前造模组大鼠血清白蛋白、胆固 醇、血肌酐及尿素氮与正常组比较，血清白蛋白低于 正常组（Ｐ＜Ｏ．０１），胆固醇高于正常组（Ｐ＜Ｏ。０５）， 血肌酐及尿素氮无统计学意义（Ｐ＞Ｏ。０５），提示此 时造模成功。末次给药后，与正常组比较，泼尼松组 血清白蛋白低于正常组（Ｐ＜Ｏ。０５），而胆固醇高于 正常组（Ｐ＜０．０５），肾特灵加泼尼松组各指标均无 维普资讯 http://www.cqvip.com
・８８・ 世界中西医结合杂志２００７年第２卷第２期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００７，Ｖｏ１．２，Ｎｏ．２ 统计学意义（Ｐ＞０．０５）；与模型组比较，泼尼松组、 肾特灵加泼尼松组与泼尼松组相比，血清白蛋白高 于泼尼松组（Ｐ＜０．０５）而胆固醇低于泼尼松组（Ｐ＜ 肾特灵加泼尼松组血清白蛋白均高于模型组（Ｐ＜ ０．０５），而胆固醇低均于模型组（Ｐ＜０．０５），提示两 ０．０５），提示肾特灵加泼尼松的作用优于单纯使用泼 尼松。结果见表３。 （ｊ＋ｓ） 组药物均有提高血清白蛋白，降低胆固醇的作用。 表３各组大鼠血清白蛋白、胆固醇、血肌酐、尿素氮比较 注：与正常组比较， Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０ｌ；与模型组比较， Ｐ＜０．０５；与泼尼松组比较， Ｐ＜０．０５ ２．３ 电荷屏障 量的蛋白质是导致肾病综合征系列变化的决定性因 素。肾小球毛细血管内皮细胞、基膜和脏层上皮细胞 表面以及系膜细胞区带负电荷的硫酸肝素类氨基酸 多糖及唾液酸蛋白，构成肾小球滤过膜的固有电荷层 电镜下可见正常组大鼠肾小球基膜上ＰＥＩ染色 颗粒致密、大小规则，以双层排列为主，在基膜转折处 ＰＥＩ染色颗粒最多，颗粒主要分布在基膜外疏松层； 模型组大鼠肾小球基膜上ＰＥＩ染色颗粒数量明显减 （电荷屏障） ，可阻止带有负电荷的溶质（如白蛋白） 通过。电荷屏障的缺陷在光学显微镜下肾小球无异 常，但采用聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）染色和Ａｌｃｉａｎ蓝（ＡＢ）染 色等特殊染色技术，能显示电荷屏障缺陷的程度＿＿２］。 少，间距显著增大并伴有颗粒丢失，部分肾小球滤过 膜显示不清晰，足突细胞溶解融合；泼尼松组大鼠肾 小球基膜上ＰＥＩ染色颗粒分布以外疏松层为主，较正 常组数量减少，但排列规则；肾特灵加泼尼松组大鼠 ＰＥＩ染色与正常组接近，无明显变化；提示阿霉素大 鼠肾小球基膜上硫酸肝素蛋白多糖减少、阴电荷丢 失、电荷屏障被破坏，而后两组的药物使硫酸肝素蛋 白多糖增多，阴电荷丢失减少，能修复电荷屏障，其中 肾特灵加泼尼松的作用优于泼尼松。模型组大鼠的 肾小球ＡＢ深染色率低于正常组（Ｐ＜０．０１），表明阿 霉素造模后大鼠肾小球基膜上唾液酸糖蛋白含量减 少、阴电荷丢失。与模型组比较，后两组肾小球ＡＢ 深染色率均高于模型组（Ｐ＜０．０１），提示两组药物均 能使唾液酸糖蛋白增加，阴电荷丢失减少。与正常组 比较，肾特灵加泼尼松组差异无统计学意义（Ｐ＞ ０．０５），泼尼松组低于正常组（Ｐ＜Ｏ．０１），提示肾特灵 阿霉素大鼠肾病模型的病理改变与人类微小病变肾 病极为相似，对糖皮质激素治疗敏感 。在本研究 中，我们模拟临床激素“三阶段使用”治疗肾病综合征 的方法，对阿霉素大鼠肾病模型用药物进行干预，结 果表明，肾特灵加泼尼松能减少尿蛋白量，升高血清 白蛋白，降低总胆固醇，还能使硫酸肝素蛋白多糖、唾 液酸糖蛋白增多，减少阴电荷丢失，修复电荷屏障，其 作用优于单纯使用泼尼松。因此，我们认为产生电荷 屏障的损伤是大量蛋白尿的主要原因之一。增加硫 酸肝素蛋白多糖、唾液酸糖蛋白，减少阴电荷丢失，修 复电荷屏障是药物减少蛋白尿的作用机制之一。如何 定量检测电荷屏障的损伤，探讨电荷屏障的损伤程度 与尿蛋白的相关性是我们下一步的工作。 ［参考文献］ ［１］徐叔云，卞如濂，陈修，等．药理实验方法学［Ｍ］．北京：人 民卫生出版社，２００３：１２３２． 加泼尼松的作用优于泼尼松。结果见表４。 表４各组大鼠ＡＢ染色结果比较 ［２］陈重义，姜新献．研究肾小球电荷屏障方法的概况［ｊ］．国 外医学泌尿系统分册，Ｉ９９０，１Ｏ（６）：２５７ ２６０． ［３］Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉ Ｄ，Ｓｈａｒｋｅｙ Ｄ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌ１．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ１．１９９４，９８：１５９６． 注：与正常组比较， Ｐ＜０．０１；与模型组比较， Ｐ＜０．０１；与 泼尼松组比较， Ｐ＜０．０１ ［４］叶任高，杨念生，郑智华，等．肾病综合征［Ｍ］．北京：人民 卫生出版社，２００５：３． ３讨论 （收稿日期：２００６—１２—２８修回日期：２００７—０１—１２） 肾病综合征的病因各不相同，但从尿液中丢失大
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