・５１８・ 中国生物制品学杂志２０１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｍａｙ ２０１５，Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．５ ● 技术方法 ● Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基的优化 段盼盼 ，杨帆。，耿兴良 ，龙云凤。，郭琦 ，龙艺 ，王明清 ，廖国阳 ，李卫东 １．中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 云南昆明６５０１１８；２．苏州大学医学部基础医学与生物科学学院，江苏苏州２１５１２３ 摘要：目的通过试验设计（ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ＤＯＥ）方法和统计学分析快速优化Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基。方法 以ＤＭＥＭ／Ｆ１２为基础培养基，通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ试验、最陡爬坡试验和Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验考察７种添加物胰岛 素、人转铁蛋白、透明质酸、牛血清白蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子和高密度脂蛋白对Ｖｅｒｏ细胞生长的影响，以 ＣＣＫ．８测定的吸光度值（Ａ ）为响应值，优化Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基。 用最优化的因子浓度配制的Ｖｅｒｏ细胞无血清 培养基培养Ｖｅｒｏ细胞，对优化结果进行验证。结果通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ试验筛选出胰岛素、牛血清白蛋白和人转 铁蛋白对Ｖｅｒｏ细胞生长影响较大；采用最陡爬坡试验和Ｂｏｘ．Ｂｅｈｎｋｅｎ试验进一步优化，Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ ８．０６软件进行 回归分析，得到胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白的最佳浓度分别为５．６２５ ｐ￣ｇ／ｍｌ、１４．０３４ ｇ／ｍｌ和３．９２ ｍｇ／ｍｌ， 在此优化条件下的 值为２．３，较基础培养基提高了３．４１倍。用最优的胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白浓度 配制的Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基培养Ｖｅｒｏ细胞的Ａ蜘值为２．１４８，为预测值的９３．４％，符合度较高。结论应用ＤＯＥ 方法快速高效地优化了Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基，为无血清培养基的研制奠定了基础。 关键词：Ｖｅｒｏ细胞；无血清培养基；优化；试验设计 中图分类号：Ｒ３９２．３３文献标识码：Ａ文章编号：１００４．５５０３（２０１５）０５．０５１８—０５ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ．ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ＤＵＡＮ Ｐａｎ—ｐａｎ‘，ＹＡＮＧ Ｆａｎ，ＧＥＮＧ Ｘｉｎｇ—ｌｉａｎｇ，ＬＯＮＧ Ｙｕｎ－ｆｅｎｇ，ＧＵＯ Ｑｉ，ＬＯＮＧ Ｙｉ， ＷＡＮＧ Ｍｉｎｇ－ｑｉｎｇ，ＬＩＡＯ Ｇｕｏ－ｙａｎｇ，ＬＩ Ｗｅｉ—ｄｏｎｇ 。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｆｏＭｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＆Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０１１８，Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏａｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＬＩ Ｗｅｉ—ｄｏｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ＬＷＤ＠ｉｍｂｃｍｓ．ｃｏｍ．ｃｎ；ＬＩＡ ０ Ｇｕｏ－ｙａｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉａｏｇｙ＠ｉｍｂｃａｍｓ．ｃｏｍ．ｃａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｒａｐｉｄｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ａ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（ＤＯＥ）ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｓｉｎｇ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ａｓ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，ｉ．ｅ．ｉｎｓｕｌｉｎ，ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｔｉｔｅ，ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬ），ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｃｋｅｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ，ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ａ ４９０ ｖａｌｕｅｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＣＣＫ一８ ａｓ ａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｌｕｅ．Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｉｆｃａｃｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆａｃｔｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｐｌａｃｋｅｔｔ－ Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｉｎｓｕｌｉｎ，ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ＢＳＡ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ．Ｆｕｒｔｈｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ—Ｅｘｐｅｒｔ ８．０６ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ５．６２５ ｔｘｇ／ｍｌ，１４．０３４ ｔｘｇ／ｍｌ ａｎｄ ３．９２ ｍｇ／ｍｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ Ａ ｖａｌｕｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ２．３，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３．４１ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ Ａ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ２．１４８，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ９３．４％ｏｆ ｔｈａｔ ｅｘｐｅｃｔｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａ ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ＤＯＥ，ｗｈｉｃｈ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｒｕｍ— ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ；Ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ；Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（ＤＯＥ） 大规模动物细胞培养广泛应用于生物制品如单 克隆抗体、重组蛋白、疫苗及激素等的生产…，不同 基金项目：８６３计划腮腺炎病毒疫苗等病毒性疫苗关键技术及产品 的细胞系由于用途不同，对营养的需求亦不同。血清 开发（２０１２ＡＡＯ２Ａ４０４）；科技部国际合作项目Ｓａｂｉｎ ＩＰＶ 是体外细胞培养用的最多、最广泛的天然培养基，具 关键技术研究（２０ｌ０ＤＦ３２８９Ｏ）． 通讯作者：李卫东，Ｅ．ｍａｉｌ：ＬＷＤ＠ｉｍｂｃｍｓ．ｃｏｒｎ．ｃｎ； 有重要作用ｌ ｚ４，但血清组分的复杂性和不确定性及 廖国阳，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉａｏｇｙ＠ｉｍｂｃａｍｓ．ｃｏｎ．ｃｎ 批次间的差异增加了疫苗等产品生产及质量控制的 中国生物制品学杂志２０１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｍａｙ ２０１５，Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．５ ・５１９・ 难度，同时血清易引起细菌、真菌、病毒及支原体的 污染，增加了疫苗生产的安全性隐患［ 引。由于使用 血清造成的细胞培养过程和细胞表达产物的安全性 问题，研发动物细胞无血清培养技术显得十分必要ｒ５］， 因此，基于细胞和产品特性的无血清培养基的研制 已成为细胞工程领域的重要课题＿７］。 无血清条件。将处于对数生长期的Ｖｅｒｏ细胞用不 含血清的基础培养基ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养，使细胞血清 饥饿４８ ｈ，饥饿后的细胞作为后续无血清试验的种 子细胞库。 １．３．２细胞在无血清培养基中培养取经血清饥 饿后的Ｖｅｒｏ细胞，胰酶消化，用含大豆胰蛋白酶抑 制剂（１ ｍｇ／ｍ１）的ＤＭＥＭ／Ｆ１２终止，调整细胞密度 Ｖｅｒｏ细胞是日本学者Ｙａｓｕｍｕｒａ等于１９６２年从 正常成年非洲绿猴肾分离获得，可连续传代Ｅ ，是世 界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细 为１×１０５个／ｍｌ，接种于９６孔细胞培养板中，每孑Ｌ 胞系［ ，已应用于多种疫苗的生产 屹］。虽然用于 １００ ｌ，分别加入含胰岛素、人转铁蛋白、透明质酸、 牛血清白蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子和高密度脂 Ｖｅｒｏ细胞培养的商品化无血清已研制成功｜】 －Ｉ６＿，但 每个细胞株对营养有其独特需求 ］，因此很难有某 个商品化无血清培养基与某个细胞株营养需求完全 匹配，且当需要对培养过程进一步优化或细胞培养、产 品生产遇到问题时，由于商品化培养基成分保密，无 法针对性地解决遇到的问题。因此，针对特定细胞株 开发具有自主知识产权的无血清培养基尤为重要。 设计Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基组成配方的原则 是筛选和确定替代血清作用的添加因子＿ｌ ，目前较 为快捷和有效的设计策略是以ＤＭＥＭ、Ｆ１２和Ｍ１９９ 等合成培养基单独使用及联合使用为基础培养基， 以反映细胞生长和代谢的主要参数为评价指标，应 用试验设计（ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ＤＯＥ）和统计学 方法筛选并确定添加的生长因子、激素、结合蛋白、 黏附因子、微量元素、脂类和脂类前体物等的种类和 浓度［ ｓ－。 本实验以商品化的ＤＭＥＭ／Ｆ１２为基础培养基， 采用响应面法（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ，ＲＳＭ）优化 Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基，现报道如下。 １材料与方法 １．１细胞系 Ｖｅｒｏ细胞来自美国ＡＴＣＣ，由中国医 学科学院昆明医学生物学研究所保存。 １．２主要试剂ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｖ／Ｖ，１：１）培养基购 自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；ＭＥＭ培养基、谷氨酰胺、双抗、 ＮａＨＣＯ 和０．１２５％胰酶均由医学生物学研究所提 供；新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；胰 岛素和大豆胰蛋白酶抑制剂购自美国Ｓｉｇｍａ公司； 人转铁蛋白、透明质酸、牛血清白蛋白、亚硒酸钠、表 皮生长因子和高密度脂蛋白均购自索莱宝科技有限 公司；ＣＣＫ．８试剂盒购自日本同仁化学研究所。 １．３细胞无血清驯化及培养 １．３．１细胞无血清驯化为避免在降低血清过程 中细胞出现变异，通过直接降低血清法使细胞适应 蛋白添加物的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养细胞，每孔１００ ｔｘｌ， 每个试验条件设８个复孑Ｌ，置（３７±０．５）℃，５％ＣＯ 培养箱中培养。共进行２次重复试验。 １．４细胞增殖的测定采用ＣＣＫ．８法测定细胞的增 殖速率［１９］。按１．３．２项方法培养细胞７２ ｈ，弃去 培养液，ＰＢＳ洗涤３次，加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２，每孑Ｌ １００ ｌ， 再加入ＣＣＫ．８，每孔１Ｏ ｌ，继续培养４ ｈ，酶标仪检测 ４９０ ｎｍ处光吸光度值，以ＤＭＥＭ／Ｆ１２空白调零。 １．５ ＤＯＥ分析 １．５．１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ试验设计选取胰岛素、人 转铁蛋白、透明质酸、牛血清白蛋白、亚硒酸钠、表皮 生长因子和高密度脂蛋白７种添加物，通过Ｄｅｓｉｇｎ— Ｅｘｐｅｒｔ ８．０６软件进行试验次数（ｎ）＝１２的Ｐｌａｃｋｅｔｔ— Ｂｕｒｍａｎ设计，以Ａ ４９０值为响应值，应用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ ８．０６对试验数据进行方差分析 ⅣＤ ），以Ｐ＜０．０５ 为衡量指标，筛选出显著影响Ｖｅｒｏ细胞生长的因素， 因素及水平见表１。 表１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ设计因素及水平 Ｔａｂ １．Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ １．５．２最陡爬坡试验设计选择通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ— Ｂｕｒｍａｎ试验筛选出的促进Ｖｅｒｏ细胞生长的较大影 响因素，以 伽值变化的梯度方向为爬坡方向，根据 各因素Ａ伽值的大小确定变化的步长，使筛选出的 因子逼近最佳值区域。 １．５．３响应面试验设计为找到最佳的试验条件 及因素间的交互作用，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计， 以 值为响应值，设计３因素３水平共１７次试验 ・５２０・ 中国生物制品学杂志２０１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｍａｙ ２０１５，Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．５ ｌ ２ 的响应面试验，继续优化筛选出的因子的添加浓度， 各因素及水平见表２。 表２中心组合试验设计的因素及水平 Ｔａｂ ２．Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ １．６优化结果的验证用最优化的因子浓度配制 的Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基培养Ｖｅｒｏ细胞，比较此条 件下的Ａ伽值与通过多元函数分析确定出的极值及 取得极值所对应的变量取值，以验证模型的可靠性， 并确定最后优化的结果。 ２结果 ２．１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｒｎａｎ试验设计结果试验结果表 明，胰岛素和牛血清白蛋白对Ｖｅｒｏ细胞生长具有显 著正效应，人转铁蛋白、亚硒酸钠和表皮生长因子对 Ｖｅｒｏ细胞生长具有促进作用，而透明质酸和高密度 脂蛋白对Ｖｅｒｏ细胞生长存在显著负效应，见表３和 表４。表明胰岛素和牛血清白蛋白可显著影响Ｖｅｒｏ 细胞的生长，由于人转铁蛋白作为Ｆｅ。 转运载体，对 细胞生长影响较大，亦对其进行优化，最终筛选出胰 岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白为促进Ｖｅｒｏ细胞 生长的较大影响因素。 表３ Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ试验设计及结果（ｎ＝１２） Ｔａｂ ３．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ ｅｘｐｅｒｉ— ｍｅｎｔ（ｎ＝ｌｚ） 试验编号ｘ１ ｘ２ ｘ３ ｘ４ ｘ５ ｘ６ ｘ７ Ａ ０．９７０ １．９７４ １．４２２ １．１２５ ０．６７５ Ｏ．７１３ １．５３０ １．０６４ ０．７３２ １．１４１ ０．７００ １．６２５ ２．２最陡爬坡试验结果胰岛素、人转铁蛋白和牛 血清白蛋白３种因子的起始点浓度分别为４．５ Ｉ．ｚｇ／ｍｌ、 １２ ｔｘｇ／ｍｌ、３ ｍｇ／ｍｌ，步长分别为０．３ ｔｘｇ／ｍｌ、０＿６ ｉｘｇ／ｍｌ、 ０．２ ｍｇ／ｍｌ。随着３种因子浓度的升高，Ａ伽值呈 先升高后下降的趋势，当３种因子浓度取值分别为 ５．４ Ｉ．Ｌｇ／ｍｌ、１３．８ Ｉ．ｚｇ／ｍｌ、３．６ ｍｇ／ｍｌ时，其Ａ４帅值 最大，因此作为Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计的中心点。 见表５。 表４ Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎ试验设计的方差分析 Ｔａｂ ４．Ａ ＮＯＶＡ ｆｏｒ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ 表５最陡爬坡试验设计及结果 Ｔａｂ ５．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ２．３响应面试验设计结果响应面图呈马鞍型，表 明有极值存在，根据响应面变化隋况，胰岛素、人转铁 蛋白和牛血清白蛋白的最佳浓度分别为５．６２５ ｔｘｇ／ｍｌ、 １４．０３４ ｔｘｇ／ｍｌ、３．９２ ｍｇ／ｍｌ，在此条件下，预ｉ贝４ ４舶 值可达２．３，较基础培养基提高了３．４１倍。见表６ 和图１。 表６中心组合试验设计及结果 Ｔａｂ ６．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ・５２２・ 中国生物制品学杂志２ｏ１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｍａｙ ２０１５，Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．５ ［３］ Ｓｕ ＸＲ，Ｙｕｅ Ｈ，Ｔａｎｇ Ｃ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｓｅｒｎｍ—ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ ｉｎ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｖｅｔ Ｍｅｄ，２０１２，３３（２）：８７．９０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 苏晓蕊，岳华，汤承．Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基研究进展［Ｊ］． 动物医学进展，２０１２，３３（２）：８７—９Ｏ． ［４］Ｔｓｕｇｅｎｏ Ｙ，Ｓａｔｏ Ｆ，Ｍｕｒａｇａｋｉ Ｙ，ｅｔ ．Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｉｎｇｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ，ＳＴＫ１ ａｎｄ ＳＴＫ２［Ｊ ３．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｐ， ２０１４．２（５）：６４４—６４８． ［５］ Ｃｈｅｎ Ｔ，Ｃｈｅｎ ＫＰ，Ｃｈｅｎ ＺＬ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｖｅｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｕｈｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ３．Ｌｅｔｔ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００９ ２０（３）：４１７－４２１．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 陈天，陈克平，陈昭烈．Ｖｅｔｏ细胞无血清培养技术的研究与 应用［Ｊ］．生物技术通讯，２００９，２０（３）：４１７．４２１． ［６］ Ｗｅｓｓｍａｎ ＳＪ，Ｌｅｖｉｎｇｓ ＲＬ．Ｂｅｎｅｉｆｔｓ ａｎｄ ｒｉｓｋｓ ｄｕｅ ｔｏ ａｎｉｍａｌ ｓｅｕｒｍ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ， １９９９，９９（１）：３－８． ［７］ Ｗａｎｇ ＹＭ，Ｃｈｅｎ ＺＬ．Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ— ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００７，２７ （１）：１１０．１１４．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 王永民，陈昭烈．动物细胞无血清培养基的研究与设计方法 ［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００７，２７（１）：１１０．１１４． ［８］Ｐｅｔｉｏｔ Ｅ，Ｇｕｅｄｏｎ Ｅ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ Ｆ，ｅｔ ０１．Ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅ． ｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａ ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１０，１０７（１）：１４３—１５３． ［９］ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｏｆｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ［Ｊ］＿ＷＨＯ Ｔｅｃｈ Ｒｅｐ Ｓｅｔ， １９８７，７４５（１）：９９．１１５． ［１０］ Ｕｒｓａｃｈｅ ＲＶ，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ ＹＥ。ｖａｎ Ｅｉｋｅｎｈｏｒｓｔ Ｇ，ｅｔ ｏ１．Ｍａｔｈｅ— ｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｄｈｅｒｅｎｔ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｏｌｉｏｖｉｕｒｓ ｐｒｏ— ｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ，２０１５，３８（３）：５４３—５５５． ［１１］Ｌｉｕ ＣＣ，Ｇｕｏ ＭＳ，Ｌｉｎ ＦＨ，ｅｔ ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａ— ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ａ ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１，６（５）：ｅ２０００５． ［１２］Ｙｕｎ ＫＷ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋａｎｇ ＪＨ，ｅｔ ０１．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｉｅｄ，Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ・ｄｅｒｉｖｅｄ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｊａｐａ・ ｎｅｓｅ ｅｎｃｅ・ｐｈａｌｉｔｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ（ＫＤ－２８７．ＥＮＣＥＶＡＣ＠）ｖｅｒｓｕｓ ａ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ：ａ ｐｈａｓｅ １ＩＩ，ｍｕｈｉｃｅｎｔｅｒ，ｄｏｕｂｌｅ—ｂｌｉｎｄｅｄ，ｒａｎｄｏ— ｍｉｚｅｄ ｔｉｒａｌ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０１５，１５（１）：７－１７． ［１３］ Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｓ．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｔｏ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｉｅｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｗｉｔｈ ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｓｅｆｌｌｍ—ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ３．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇｉ，２０１ １，１ １ １ （５）：６００．６０４． ［１４］ Ｃｈｅｎ Ａ，Ｐｏｈ ＳＬ，Ｄｉｅｔｚｓｃｈ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖｉｕｒｓ ｌａｃｋｉｎｇ ＮＳ１ ｕｓｉｎｇ Ｖｅｒｏ ｃｅｉｌｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，１１（１）：８１－９６． ［１５］ Ｒｏｕｒｏｕ Ｓ，Ｂｅｎ Ａｙｅｄ Ｙ，Ｔｒａｂｅｌｓｉ Ｋ，ｅｔ ．Ａｎ ａｎｉｍａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ［Ｊ］． Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１４，３２（２４）：２７６７—２７６９． ［１６］ Ｒｏｕｒｏｕ Ｓ，ｖａｎ ｄｅｒ Ａｒｋ Ａ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ Ｔ，ｅｔ ｏ１．Ｄｅｖｅｌｏ— ｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｎｉｍａｌ—ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｖｅｔｏ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，２００９，２５（６）：１７５２—１７６１． ［１７］ Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ．Ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ：ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，２０１３，１（４）：３１５－３１８． ［１８］ １ｗａｔａ Ｋ，Ａｓａｗａ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ Ｓ，ｅｔ ０１．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１２，３３（２）：４４４ ４５４． ［１９］ Ｄｕａｎ ＤＸ，Ｃｈａｉ ＧＳ，Ｎｉ ＺＦ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｂｙ ｄｅａｔｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ，２０１３，３７（４）： ７９５—８０８． ［２０］ Ｐａｒａｍｐａｌｌｉ Ａ，Ｅｓｋｒｉｄｇｅ Ｋ，Ｓｍｉｔｈ Ｌ，ｅｔ ｏ３．Ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅ１３３ｍ．－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ ｉｎ ＣＨＯ－－ＤＧ４４ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，５４（１）：５７—６８． ［２１］ Ｋｎｆｉｓｐｅｌ Ｆ，Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ＲＫ，Ｌｔｉｂｂｅｒｓｔｅｄｔ Ｍ，ｅｔ ｏｉ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓ，ｅｌｘｌｎｌ－ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ＤｏＥ）ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｔｅｃ— ｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，６２（６）：５５７－５７１． ［２２］ Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｈｕａｎｇ Ｒ，Ｔｉａｎ Ｈ，ｅｔ ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｆｏｒ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅ ｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｍｅｃｈ Ｍａｔｅｒ，２０１３， ４１９：３２８—３３３． ［２３］ Ｌｉｕ Ｈ，Ｃｈｅｎ Ｔ，Ｌｉ ＳＣ，ｅｔ ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｅｒｕｍ－－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｍｉｃｒｏ・－ ｃａｒｒｉｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｍｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ，２０１３，１３（３２）：６２１０—６２１４， ６２３９．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 刘红，陈天，李世崇，等．Ｖｅｒｏ细胞微载体培养的化学成分 明确无血清培养基的设计［Ｊ］＿现代生物医学进展，２０１３，１３ （３２）：６２１０．６２１４，６２３９． 收稿日期：２０１５—０１—２８ 编辑：何巍