酶切

DNA的酶切实验

采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单

酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。 一 材料、试剂和仪器： 1 材料：质粒DNA

2 试剂：限制性内切酶、ddH2O

3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序： I. .单酶切：

II. 双酶切：

注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 二. 结果与分析：

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析

M1 ： λ DNA/ HindIII M2：DL2000 1 - 6: 重组质粒HindIII XbaI

重组质粒用HindIII XbaI双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。

双酶切连接反应的经验谈： 双酶切：

1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。

4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。

5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。

6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

8、酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。

9、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。

10、连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。

11、双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。

12、第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收DNA片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用PCR产物回收试剂盒纯化酶切样保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管，将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ddH2O,离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升ddH2O在膜上，将柱子反转插入新的eppendorf管上，离心，即可将DNA片段离下来，做下一次酶切。

操作步骤

1.反应体系的建立：

⑴在一无菌1.5mlEppendorf管中加入： 无菌双蒸水7μl 10×酶切缓冲液2μl

质粒DNA(100ng/μl)10μl EcoRⅠ(5U/μl)1μl 总体积为20μl

⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。 2.37℃水浴1h。

3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。 4.12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。

5.取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100V30～60min。 6结果观察。

操作注意事项： 1.吸样量一定要准确

2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶 3.要求在冰上操作，并充分混匀，

4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。 限制性内切酶酶解中常见的问题和原因

1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。

2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。 3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。

酶切技术-技术问题

1、回收PCR产物：在进行PCR扩 增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应

用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是

同一限制酶切割DNA粘性末端的连接 柱式，优选柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯

化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。优选TAKARA的纯化柱试剂盒。

酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

摩尔比的计算，回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×650）/1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。

连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作。时间3个小时足已。

3、转化：

a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

c、加入890μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl。

Q-13: 乙醇沉淀的方法。 A-13:

1. 加入1/10体积的3 M CH3COONa(pH 5.2)，混匀。

2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。 3. 12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀。

4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min，除去上清，真空或室温干燥沉淀，注意不要干燥过度。 5. 沉淀用灭菌蒸馏水或TE溶解，进行后续反应