第３１卷第２期 热，ｌ、、 ０带作 ●Ｉ 物学报 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＲＯＰＩＣＡＬ ＣＲＯＰＳ Ｖ０ｌ＿３ｌ ＮＯ．２ ２０１０年２月 Ｆｅｂ．２０１０ 番木瓜 一Ｇａｌ基因的克隆分析与植物表达载体构建 何玮毅１，２，３ 陈晓静１，２ ．申艳红１，２ 卢秉国 １福建农林大学园艺学院．福州３５０００２ ２福建农林大学园艺植物遗传育种研究所．福州 ３５０００２ ３福建农林大学应用生态研究所．福州 ３５０００２ 摘要番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与卢一Ｇａｌ基因的表达密切相关。利用常规ＰＣＲ结合反向ＰＣＲ技术， 分离了一条４ ５０１ ｂｐ的番木瓜 Ｇｄ基因组序列。其共含有１７个内含子，外显子部分与相应的ｃＤＮＡ序列只有 １个碱基的差异。生物信息学分析结果表明，该番木瓜 一ＧＡＬ属于糖苷水解酶超级家族４２中家族３５的成员。 在进化过程中与拟南芥的亲缘关系较近，与鳄梨和北美云杉则较远。同时，它还具有一段定位于胞外的信号肽． 再次表明其可能参与了果肉细胞壁的降解和果实软化。进一步分离了 一Ｇａｌ基因启动子，初步验证了其果实表 达特异性。将该启动子替换载体ｐ２３０１ｔＴｒＲＧ上的ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子。构建出ＲＮＡｉ－－Ｂ—Ｇａｌ双’ｒ＿ＤＮＡ植物表达载 体。酶切分析和ＰＣＲ检测结果表明，载体ｐ２３０１／ＢＰＴｒＲＧ已被成功导入农杆菌，可用于后续的遗传转化研究。 关键词 番木瓜； 半乳糖苷酶；果实特异性启动子；双Ｔ—ＤＮＡ植物表达载体 ｄｏｉ １０．３９６９６．ｉｓｓｎ．１０００－２５６１．２０１０．０２．０１ １ 中图分类号￥６６７．９：Ｑ７８９ ． 番木瓜（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．）为呼吸跃变型果实【１］，采后货架期较短，不易贮藏保鲜，由果实软化所造成 的腐败变质是其中最主要的原因ｆ２１。果实的软化是由酶促所引起的细胞壁解体的表现．不同物种中对果实 软化起主要作用的水解酶类也不同［３］。番木瓜果肉中的 一半乳糖苷酶（ 一ＧＡＬ，ＥＣ ３．２．１．２３），其活性动态 变化与果实后熟软化密切相关，在果肉开始迅速软化时活性急剧上升［１＇ ．并具有降解细胞壁骨架基质的 能力ｆ７卅。最近，Ｄｅｖｉｔｔ等１９１与Ｋａｒａｋｕｒｔ等【－明进一步从分子水平证实了采后贮藏和鲜切加工（Ｆｒｅｓｈ－ｃｕｔ）的番 木瓜，在果实迅速软化阶段口一Ｇａｌ基因具有差异性表达的特点。与利用转反义ＡＣＳ和ＡＣＯ基因调控的乙 烯生物合成来抑制果实的后熟【ｌｌ】不同，抑制关键的细胞壁水解酶基因的表达，为选育生理上能正常成熟、 具有较长货架期、且适于鲜切加工的番木瓜品种提供了新思路。 在Ｏｔｈｍａｎｔ ２】所分离的口一Ｇａｌ基因ｃＤＮＡ的基础上，笔者利用常规ＰＣＲ结合反向ＰＣＲ技术分离了其基 因组序列，对该基因进行了详细的生物信息学分析，预测了 一ＧＡＬ的理化性质与生物学功能，探讨其在 番木瓜果实软化过程中所扮演的重要角色。同时，将该基因具有果实表达特异性的启动子。替换双Ｔ－ＤＮＡ 植物表达载体ｐ２３０１／ＴＩ＇ＲＧ＂３］Ｉ－＿ＲＮＡｉ］８一Ｇａｌ结构前的ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子，构建了含有特异性启动子的双 Ｔ—ＤＮＡ植物表达载体ｐ２３０１／ＢＰＴＦＲＧ。利用该载体进行番木瓜的遗传转化．将获得比传统反义技术更佳 的基因沉默效果，有效控制果实贮藏期间由于 一Ｇａｌ表达所导致的迅速软化。同时，果实表达特异性启 动子将目的基因的表达控制在靶标部位，将有助于转基因植株的生理平衡与正常生长㈣．为选育无选择标 记基因的抗软化转基因番木瓜品种奠定基础 基金项目：福建省科技厅重点项１￣（Ｎｏ．２００８Ｎ０００８），福建省自然科学基金项目（Ｎｏ．Ｂ０６１０ｏ１ｏ）资助。 第一作者简介：何玮毅，男，１９８２年生，博士，在站博士后，主要从事园艺植物遗传育种与生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｙ．ｈｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃａ。 通讯作者，陈晓静，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｊｃｈｅｎ８０４＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ。 收稿日期：２００９—１２－０２ 修回日期：２０１０－０１—０８ ２１８ 热带作物学报 ３１卷 １材料与方法 １．１ 材料 离体培养的番木瓜叶片【－ 为提取ＤＮＡ的材料，载体ｐ２３０１／ＴＦＲＧ、大肠杆菌ＤＨ５０【和农杆菌ＥＲＡ １０５， 均由福建农林大学园艺植物遗传育种研究所保存和提供 １．２方法 １＿２＿１ 番木瓜基因组ＤＮＡ的提取 采用改良３×ＣＴＡＢ小量法 提取组培番木瓜叶片ＤＮＡ １－２．２番木瓜 一Ｇａｌ基因组序列的克隆 以番木瓜基因组ＤＮＡ为模板，采用常规ＰＣＲ结合反向ＰＣＲ， 分３步克隆番木瓜 一Ｇａｌ基因组序列。具体步骤、引物序列和ＰＣＲ程序见图１和表１。根据测序结果进 行拼接，以引物对ｆＰ１和ｒＰ２进行ＰＣＲ扩增，验证所拼接的 一Ｇｏ］基因组序列准确性。 （ 一Ｇａ／基因启动子） Ｊ Ｂ删— （第１步，常规ＰＣＲ） （第２步，巢式反向ＰＣＲ） ＡＴ０ Ｊ 一ＩＰｌ２ ＩＰ２２ （第３步，常规ＰＣＲ） Ｊ — ｒＰ２ 七一Ｂ Ｉ五。ｄ｜Ｉ — ｒＰ１ —◆ １Ｐ２１ ＩＰ１ｌ ＢＰｐ１ 黑色方框为 一－Ｇ 基因启动子部分，３个斜线方框分别为３步ＰＣＲ扩增所获得的口一Ｇａｌ基因组片段 图１番木瓜卢－． Ｚ基因及其启动子克隆所用ＰＣＲ引物在基因组上的位置分布 表１ 番木瓜 一Ｇａｌ基因组序列及其启动子克隆所用ＰＣＲ引物和程序 １－２．３番木瓜口一Ｇａ／基因的生物信息学分析 运用生物信息学软件ＤＮＡＭＡＮ ６．０版进行 一Ｇａｌ基因 ｃＤＮＡ与其基因组序列的核苷酸和氨基酸序列的比对，分析内含子的位置：利用ＭＥＧＡ ４．０．２［１７］的ＭＰ法构 建 一ＧＡＬ系统发育树；利用在线生物信息学网站ＥｘＰＡＳｙ预测编码蛋白的氨基酸序列组成、分子式、相对 分子质量、等电点等理化性质；ＮＣＢＩ—ＣＤＤ［１８１预测蛋白质的保守结构域；ＳＯＰＭＡ［１９］预测蛋白质二级结 构；ＮｅｔＮＧｌｙｃ［ ｏ］预测Ｎ（天冬酰氨）一糖基化位点；Ｓｉｇｎａｌｐｔ２，］预测信号肽及其断裂位点；Ｋｙｔｅ—Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ＰＩｏｔ 预测蛋白质疏水区和跨膜区段；ＴａｒｇｅｔＰ￣２３１进行蛋白质的亚细胞定位：ＰｒｏｔＦｕｎｔ￣］预测翻 译后蛋白质的所属类型与细胞功能 １．２．４番木瓜口一Ｇｄ基因启动子的克隆和植物表达载体构建 以番木瓜基因组ＤＮＡ为模版，利用引物对 ＢＰＰ１和ＢＰＰ２扩增１．１ ｋｂ的口一Ｇａ／基因启动子（Ｎｏ．ＥＵ６５０６６４，图１），克隆至ｐＭＤ１８一Ｔ载体。提取质粒。 进行ＢａｍＨ Ｉ和５ Ｉ双酶切，回收 ～Ｇａｌ基因启动子片段（“片段ｌ”） 同时，提取质粒ｐ２３０１／ＴｒＲＧ分别进 行Ｘｂａ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ双酶切，回收小片段（“片段２”）；以及 ｎ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ双酶切，回收大片段（“片段３”）。在 同一ＰＣＲ管中加入适当比例的片段１、２和３，利用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶进行连接。转化大肠杆菌．挑取阳性 克隆，作 Ｇ 基因启动子的菌液ＰＣＲ检测。对ＰＣＲ检测为阳性的重组质粒进行ＢａｍＨ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ双酶切， 验证 基因启动子的存在；ＨｉｎｄⅢ单酶切鉴定双一 ＤＮＡ结构完整性，并将其命名为ｐ２３０１／ＢｔｒｌＴＲＧ。 参照崔武等阎的方法，导人农杆菌ＥＨＡ １０５。将菌液涂布在含有Ｓｔｒ和Ｋａｍ各１００ ｍｇ／Ｌ的ＹＥＢ固体培养 ２期 何玮毅等：番木瓜 Ｇａｌ基因的克隆分析与植物表达载体构建 ２１９ 基上筛选阳性克隆。作ＲＮＡｉ－－／３一Ｇａｌ结构和 一Ｇａ／基因启动子的菌液ＰＣＲ检测。 ２结果与分析 ２．１ 番木瓜 一Ｇａｌ基因组序列的克隆 ３步克隆分别获得了１．８ ｋｂ（图２—１）、１．１ ｋｂ（图２—３）和２．４ｋｂ（图２－４）的ＤＮＡ片段，将３条片段进行 比对和拼接，推算出该条 一Ｇａｌ基因组全长为４ ５０１ ｂｐ。以引物对ＩＰ１和ｒＰ２扩增基因组ＤＮＡ，获得了与 理论推算大小一致的片段（图２—５）。 】 Ｍ ３ ２ Ｍ ４ Ｍ ５ Ｍ１ ｋｂ ｋｂ ｋｂ ｋｂ ２．Ｏ ｋｂ ２．Ｏ １．８ ｌ １．１ １．０ １．０ Ｍ．ＴａｋａｒａＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，；Ｍ１．ＴａｋａｒａＷｉｄｅＲａｎｇｅ １２０００Ｍａｋｅｒ；，１．ｆＰｌ＋ｆＰ２；２．ＩＰ１ｌ＋ＩＰＩ２；３．ＩＰ２１＋ＩＰ２２；４．ｒＰｌ＋ｒＰ２；５．ｆＰｌ＋ｒＰ２ 图２番木瓜卢一Ｇａｌ基因组序列的克隆 ２．２番木瓜Ｊ６『一Ｇａｌ基因的生物信息学分析 ２．２．１ 番木瓜ｐ—Ｇａｌ基因核苷酸的比对及其所翻译的氨基酸特性分析 将拼接好的口一Ｇａｌ基因组全长序 列（Ｎｏ．ＥＵ６５０６６４）与其相应的ｃＤＮＡ序列（Ｎｏ．ＡＦ０６４７８６）进行比对。发现其中包含ｌ８外显子和１７内含 子，内含子两端均符合ＧＴ—ＡＧ法则，具体分布情况见图３。 ｎ Ｇ 枷ｂｐ ４１２０ｂｐ 图３番木瓜卢 基因外显子与内含子分布示意图 翻译后的氨基酸序列与ｃＤＮＡ序列翻译后的结果基本一致，仅在ＯＲＦ的第１１２个氨基酸处，基因组 序列为（ＧＧ１【）编码甘氨酸（Ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｇ），ｃＤＮＡ序列则为ＡＧＴ编码丝氨酸（Ｓｅ ｎｅ，Ｓ）。预测卢一ＧＡＬ蛋白质分 子式为Ｃ舢Ｈ铡Ｎ哪Ｏｌ∞３Ｓ３ｏ，相对分子量约为８０ ９８５．５ Ｄａ，ｐＩ为８．２４。在酵母中的半衰期＞２０ ｈ，不稳定参 数为３６．９１。属于稳定蛋白。该蛋白中各种氨基酸的 含量较为平均．排名前３位的氨基酸分别是Ｇｌｖ占６５ 个（９．０％）、Ｌｅｕ占５６个（７．８％）和Ｖａｌ占５２个（７．２％）， 带负电氨基酸总和（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）有６３个．带正电氨基酸 总和（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）有６７个。 ２＿２．２番木瓜Ｂ－ＧＡＬ与其它植物中同源物的系统进 化树构建 构建番木瓜８一ＧＡＬ与其它模式植物和果 树同源物的系统进化树（图４），发现该蛋白质最先独 立出鳄梨和北美云杉一类．属于另一大类中的番木瓜 一ＧＡＬ与其亲缘关系最远，与草本的拟南芥最为近 图４番木瓜与其它植物中 一ＧＡＩ＿ｓ的系统发育关系 热缘．与蔷薇科植物亲缘关系也较近。 带作物学报 ３１卷 ２，２．３番木瓜ＩＢ—ＧＡＬ蛋白质高级结构预测 结果表明，该蛋白质的二级结构主要由４种形式组成，即 占４４．５２％的随机卷曲、占２６．４９％的延伸链、占２０．８０％的０【一螺旋和占８．１８％的 一转角。 ２．２．４番木瓜Ｂ—ＧＡＬ蛋白质功能预测 ＮＣＢＩ—ＣＤＤ预测结果表明，该类口一Ｇ 基因所编码的蛋白质属 于糖苷水解酶超级家族４２中家族３５的成员，含有其共有基序Ｇ—Ｇ—Ｐ一［ＬＩＶＭ］（２）一ｘｆ２）一Ｑ－ｘ－Ｅ…Ｎ Ｅ ｆＦＹ１Ｉ２回 和ＬａｃＡ复合结构域．Ｎ一糖基化位点（Ａｓｎ—Ｘａａ—Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）只有１个，位于第６９５号位的氨基酸残基。 ＰｒｏｔＦｕｎ预测结果表明，该类 一ＧＡＬ蛋白质为一水解酶，并在胞外被膜区域行使功能。表明ＪＢ—ＧＡＬ 为一分泌蛋白。ＳｉｇｎａｌＰ预测出信号肽的长度为１～２ｌ号氨基酸，切割位点在２１（Ａ）和２２（ｒＩ＇）号位之间，进一 步预测 一ＧＡＬ的疏水性，发现在其信号肽部位疏水性最强。由于蛋白质的疏水性部位可与细胞膜结合， 在３－ＧＡＬ的信号肽中存在这些大量的疏水性氨基酸。可能与其跨膜密切相关．再次表明／３－ＧＡＬ具有胞外 蛋白的功能．可能是参与细胞壁降解的关键基因。 ２．３番木瓜口一Ｇａｌ基因启动子的克隆与植物表达载体构建 初步的验证结果表明，所分离的番木瓜ｆｌ－Ｇａｌ启动子具有果实表达特异性（图５）。将含有不同粘性末 端的 一Ｇａｌ启动子片段（图６—３），与ｐ２３０１／ＴＩ＇ＲＧ酶切后的２条片段同时进行连接（图６—１，２），构建重组 质粒ｐ２３０１／ＢＰＴＹＲＧ。进行ＢａｍＨ Ｉ和Ｓｏ］Ｉ双酶切，结果切出一条约１．１ ｋｂ的小片段，即口一Ｇａｌ基因启动 子片段。以及２条较大的片段（图７—５）．与理论估计一 致（图８），表明３－Ｃｄ基因启动子已存在于该载体上。由 于ｐ２３０１／ＢＰＴＩ＇ＲＧ的双Ｔ—ＤＮＡ区段含有３个ＨｉｎｄⅢ位 点（图８），因此，酶切后应形成３条片段。酶切后，获 得了与理论一致的试验结果（图７－６），表明双Ｔ’ＤＮＡ结 构完整。ＲＡＮｉ－ｔ３一Ｇａｌ结构和 一Ｇａｌ基因启动子的菌液 Ａ．含空载体的农杆菌侵染番木瓜果肉的ＧＵＳ染色： Ｂ．含卢一Ｇａｌ基因启动子 ￡ 基因载体的农杆菌侵 ＰＣＲ检测（图７—１～４）表明。部分ｐ２３０１／Ｂｍ ＲＧ已成功 染番木瓜果肉的ＧＵＳ染色１ 导入根癌农杆菌ＥＨＡ １０５ 图５番木瓜＃－ｃａｔ基因启动子果实表达特异性验证 ４ ３ ２ ｌ Ｍｌ Ｍ２ ５ ６ ｂｐ Ｉ１ ９４２ 。 ８．Ｏ ９ ８３１ 塑 ｂｐ ４１６１ １ １４３ ２ ８９２ ｂｐ ８３３ １．５ １ ９８５ １ １４３ １．Ｏ ｌ １４３ １．ｐ２３０１１ＴＦＲＧｔＸｂａＩ＋ＢａｍＨ Ｉ：２．ｐ２３０１ｔＴＩ＇ＲＧＩＸｂａＩ＋５ Ｉ： １，３．１３一Ｇａｌ基因启动子ＰＣＲ检测；２，４．ＲＮＡｉ－－ｌｆ—Ｇａｌ结构ＰＣＲ检测； ３．１３一Ｇａｌ基因启ｑａ／ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ ５．ｐ２３０１／ＢＰＴＹＲＧ／ＢｏｍＨ Ｉ＋ＳⅡｆ Ｉ：６．ｐ２３０１／ＢＰＴＹＲＧ／ＨｉｎｄｇＪ 图６构建植物表达载体的片段制备 图７植物表达载体ｐ２３０１／ＢＰＴＴＲＧ的ＰＣＲ检测和酶切鉴定 ３讨论 不同植物中的 一ＧＡＬ氨基酸序列所发生的进化分歧，可能与 一Ｇａｌ基因组序列较长且含有多个内含 子有关。从番木瓜基因组中所分离的 Ｇ 基因长达４．５ ｋｂ，明显增加了变异的机率。同时，所包含的１７ 个内含子，一旦在剪接位置处发生突变，便有可能影响甚至改变基因的功能，这些均成为了该基因进化 ２期 何玮毅等：番木瓜口＿Ｇ 基因的克隆分析与植物表达载体构建 Ⅱｉｎｄ皿 Ｋａｌｌａｎｌｙｃ．ｍ（Ｒ）Ｘ＼ｈｏｌ＼ ＩＣ ａＭＶ ３５Ｓｐｏ￣ｙＡ ～■ｃ Ｔ－Ｂｏｒｄｅｒ（Ｔ－Ｂｏｒｄｅｒ １Ｒ）＂ ＳａｌＩ／／ ＣａＭＶ ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ戗 Ｈｉｓｅｎｎ鳝ｓｄｅ－Ｈｐ － ＩＩ Ｋｐｎｌ／ ＣａＭＶ ３５ＳｐｏｌｙＡ 图８双Ｔ—ＤＮＡ植物表达载体ｐ２３０１／ＢＰＴＴＲＧ的构建示意图 的动力。同时。该ｅ－Ｇｏ／基因也将可能作为内含子多态性 分子标记开发的候选基因。 Ｔｒａｉｎｏｔｔｉ等［２８１从草莓中所分离到的 一Ｇ 基因。其蛋白质Ｃ端存在与动物同源的可结合乳糖的凝集素 结构域。他们推测这部分额外的肽段有助于使 一ＧＡＬｓ准确的锚定于一些特殊的糖基，进而提高其从细胞 壁的多聚物中释放半乳糖的能力。虽然番木瓜 一Ｇａ／基因所翻译出的氨基酸序列中并不含有该结构域， 但经不同的生物信息学软件预测均表明．该Ｂ－ＧＡＬ为一具有信号肽和分泌性质的水解酶类．并定位于胞 膜外行使功能，意味着番木瓜 一ＧＡＬ很可能在果肉细胞壁降解中起了重要作用，这一预测结果与前人的 研究结果一致 ｑｌ２１。 植物果实中的 一Ｇａ／基因多数以多基因家族的形式存在［２６２８］，ＧｅｎＢａｎｋ检索结果表明，番木瓜果肉中 的 一Ｇａ／基因同样为一基因家族。根据彼此间的同源性可将番木瓜 Ｇ 基因分为３类，它们分别负责编 码不同的 一ＧＡＬ蛋白，符合番木瓜Ｂ－ＧＡＬ具有分子量分别为６７、６７、５５ ｋＤａ的３种同工酶的报道［７－８１。同 时， —ＧＡＬＩＩ为一单亚基蛋白，而 一ＧＡＬ Ｉ和Ⅲ则同为二聚体，分别由３１和３３ ｋＤｈ的两个亚基组成啊。 本研究分离了其中一条与果实后熟软化密切相关的 一Ｇｄ基因全长基因组序列，预测其蛋白质分子量为 热带作物学报 ３１卷 ８０ ９８５．５ Ｄａ。因此推测该基因可能负责编码口一ＧＡＬＩＩ，并且可能存在翻译后的蛋白质修饰。其余两类基 因与番木瓜果肉软化的关系，以及各自所编码蛋白质的归属均有待进一步的鉴定。 将具有果实表达特异性的 一Ｇａｌ基因启动子，替换载体ｐ２３０１／ＴｒＲＧ（图８）上ＲＮＡｉ 一Ｇａｌ结构前的 ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子，构建了载体ｐ２３０１／ＢＰ＇ＩＴＲＧ（图８）。在替换ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子的过程中，涉及多个酶切 位点，无法简单的利用双酶切进行替换。因此，将载体ｐ２３０１ＨＴＲＧ酶切成多个不同片段，然后回收有用 的２个片段，与两端含有粘性末端的口一Ｇａｌ基因启动子一起，共３个片段进行连接，ＰＣＲ检测和酶切鉴 定结果表明确实达到了理论预期的效果。这一构建载体的策略避开了多次酶切、连接的步骤，一次完成。 在转基因研究的载体构建中值得借鉴 由于ｐ２３０１／Ｂｍ’ＲＧ含有受果实特异性启动子控制的ＲＮＡｉ－ｆｌ—Ｇａｌ结构，外源目的基因主要在转基因 植株果肉中表达，其中的内源 一Ｇａｌ基因将受到比传统反义ＲＮＡ技术更佳有效的双链ＲＮＡ的降解。这也 有助于克服由于组成型抑制Ｂ－Ｃｄ基因所可能造成的生理紊乱．确保转基因植株的正常生长发育 该载体 同时还是一个双Ｔ—ＤＮＡ植物表达载体０３１．即外源目的基因和选择标记基因分别被构建于两个独立的Ｔ—ＤＮＡ 区段 经农杆菌介导进行的遗传转化．便可能促使载体上外源目的基因和选择标记基因分别整合在番木 瓜基因组的不同染色体上，并在转基因植株的有性后代中发生分离，从而有希望选育出对环境友好。对 人类健康的无选择标记基因的抗软化转基因番木瓜。相关的遗传转化研究已在开展之中 参考文献 【ｌ１ Ｐａ】ｎｌｌ Ｒ Ｅ，Ｃｈｅｎ Ｎ Ｊ．Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｐａｐａｙａ（Ｃａｒ／ｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ）ｄｕｒｉｎｇ ｒｉｐｅｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １９８３，７２：３８２—３８５． 【２］Ｅｒｇｎｎ Ｍ，Ｈｕｂｅｒ Ｄ ｊ＇Ｊｅｏｎｇ Ｊ＇“ ．Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｓｈ－ｃｕｔ ｐａｐａｙａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｒｉｐｅ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ １－ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｅｎｅ［Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，１３１（１）：９７～１０３． 【３】Ｂｒｕｍｍｅｌｌ Ｄ Ａ ａｎｄ Ｈａｒｐｓｔｅｒ Ｍ Ｈ．Ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｆｒｕｉｔ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｎａｓｇｅｎｉｃ ｐｌｎａｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，４７：３１ １－３４０． 【４】Ｋａｒａｋｕｒｔ Ｙ ａｎｄ Ｈｕｂｅｒ Ｄ Ｊ． Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ—ｗａｌｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｏｌｙｕｒｏｎｉｄｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ ｆｒｅｓｈ—ｃｕｔ ｐａｐａｙａ（Ｃａｒ／ｃａ ｐａｐａｙａ）ｆｒｕｉｔｍ．Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３，２８（２）：２１９－２２９． ［５】Ｌａｚａｎ Ｈ，Ｓｅｌａｍａｔ Ｍ Ｋ，Ａｌｊ ｚ Ｍ．卢～ｇａＪａｅｔｏｓｉｄａｓｅ，ｐｅｌｙｇａｌａｅｔｕｒｏｎａｏｓ ａｎｄ ｐｅｃｔｉｎ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐａｐａｙａ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌｎａｔａｒｕｍ，１９９５，９５：１０６－１ １２． ｆ６Ｊ Ａｌｉ Ｚ Ｍ，Ｃｈｉｎ Ｌ Ｈ，Ｌａｚａｎ Ｈ．Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｗａｌｌ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｅｃｔｉｎ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｆｒｕｉｔｓ田．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，１６７：３ １７－３２７． 【７】Ａｌｉ ｚ Ｍ，Ｎｇ ｓ Ｙ，Ｏｔｈｍａｎ Ｒ，ｅｔ ｏ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｏｆ ｐａｐａｙａ口一ｇａｌａｅｔｏｓｉｄａｓｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｒｕｉｔ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｒｉｐｅｎｉｎｇ［］Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１９９８，１０４：１０５—１ １５． 【８］ｌ＿ａｚａｎ Ｈ，Ｎｇ Ｓ Ｙ，Ｇｏｂ Ｌ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｐａｐａｙａ卢一ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ／ｇａｌａｃｔｎａａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｒｉｐｅｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｃｏｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，４２：８４７－８５３． ［９】Ｄｅｖｉｔｔ Ｌ Ｃ，Ｔｉｍ ｓ，Ｔｉｍｏｔｈｙ Ａ Ｈ＇ｅｔ ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｃａｒ＆ａ ｐａｐａｙａ ｕｓｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｅｅ ｔａｇｓ［Ｊ］． Ｐ１ｎａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，１７０：３５６—３６３． 【ｌ０】Ｋａｒａｋｕｒｔ Ｙ ａｎｄ Ｈｕｂｅｒ Ｄ Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｕｎｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃＤＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆｒｅｓｈ－ｃｕｔ ａｎｄ ｉｎｔａｃｔ ｐａｐａｙａ ｆｒｕｉｔ ｄｕｒｉｎｇ ｌｏｗ—ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ［Ｊ］．Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，４４（２）：１７９—１８３． 【１ ｌ】Ｍａｎｓｈａｒｄｔ Ｒ Ｍ ａｎｄ Ｄｒｅｗ Ｒ Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐａｐａｙａ［］ｊ．Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，１９９８，４６１：６５—７３． 【１２】Ｏｔｈｍａｎ Ｒ，Ｃｈｏｏ Ｔ～Ｓ，Ａｌｉ Ｚ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａ Ｆｕｌｌ—Ｌｅｎｇｔｈ Ｂｅｔａ—ｇａｌａｅｔｏｓｉｄａｓｅ ｅＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｒｏｍ Ｒｉｐｅｎｉｎｇ Ｐａｐａｙａ（Ｃａｒｉｃａ Ｐａｐａｙａ Ｌ．Ｃｖ． Ｅｋｓｏｔｉｋａ）【Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１ ｌ８：１ １０２． ｆ１ ３】何玮毅，陈晓静，申艳红，等．番木瓜 一－Ｇｄ基因ＲＮＡｉ双Ｔ－ＤＮＡ植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究叨．热带亚热带植物学报， ２００９，１７（６）：５５６－５６１． 【１４】尹 涛，张上隆，刘敬梅，等．提高外源基因在转基因植物中表达效率的途径【Ｊ１．农业生物技术学报，２００５，１３（６）：８０８—８１４． 【１５】何玮毅，陈晓静，申艳红，等．番木瓜叶片、叶柄胚性愈伤组织的诱导及其体胚植株的发生［Ｊ】．热带作物学报，２００８，２９（６）：６９０—６９７． ［１６１何玮毅，陈晓静，申艳红，等．番木瓜组培苗叶片ＤＮＡ的微量提取【Ｊ１．福建农林大学学报（自然科学版），２００９，３８（１）：３４—３８． ２期 何玮毅等：番木瓜 Ｇ 基因的克隆分析与植物表达载体构建 【１７】Ｋｕｍａｒ Ｓ，Ｄｕｄｌｅｙ Ｊ，Ｎｅｉ Ｍ，ｃｔ ａ１．ＭＥＧＡ：Ａ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ—ｃｅｎｔｒｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ】． Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００８，９：２９９－３０６． 【１８】Ｍａｒｅｈｌｅｒ—Ｂａｕｅｒ Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ Ｂ，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ Ｍ Ｋ，ｅｔ ｏ１．ＣＤＤ：ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ａｎａｌｙｓｉｓ明． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，３５：２３７—２４０． 【１９】Ｇｅｏｕｒｊｏｎ Ｃ，Ｄｅｌ６ａｇｅ Ｇ．ＳＯＰＭＡ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｎｇｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９５，ｌ１（６）：６８１－６８４． 【２０１ Ｇｕｐｔａ Ｒ，Ｂｒｎｎａｋ Ｓ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｃｒｅ８８ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｃｏｏｍｐｕｔｉｎｇ，２００２，７：３ １０—３２２． 【２１】Ｂｃｎｄｔｅｓｎ Ｊ Ｄ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｈ，ｙｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０明．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４， ３４０：７８３－７９５． ［２２１ Ｋｙｔｅ Ｊ，Ｄｅｏｌｉｔｌｆｅ Ｒ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｍｔｅｉＩ１册．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｄａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８２，１５７：１０５—１３２． 【２３】Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ Ｏ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｈ，Ｂｒｕｎａｋ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ Ｎ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ【Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，３００：ｌ ００５—１ ０１６． ［２４１ Ｊｅｎｓｅｎ Ｌ Ｊ，Ｇｕｐｔａ Ｒ，Ｂｌｏｍ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉａｚｔｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ田． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，３１９：１ ２５７－１ ２６５． 【２５】崔 武，刘炜，吴光耀．高效、快速地将外源ＤＮＡ导入根癌土壤杆菌啪．生物工程学报，１９９５，１１（４）：３５０—３５５． 【２６】Ｓｍｉｈｔ Ｄ Ｌ，Ｇｒｏｓｓ Ｋ Ｃ．Ａ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｔ Ｌｅａｓｔ Ｓｅｖｅｎ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｇｅｎｅｓ Ｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ Ｔｏｍａｔｏ Ｆｒｕｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０００．１２３：ｌ １７３一ｌ １８３． 【２７】Ｙａｎｇ Ｌ＇Ｊｉｎ Ｇ，Ｚｈａｏ Ｘ，ｅｔ ｏ２．ＰＩＰ：ａ ｄａｔｂａａｓｅ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｒｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｅｓ，２００７，２３（１６）：２ １７４—２ １７７． ［２８】Ｔｒａｉｎｏｔｔｉ Ｌ，Ｓｐｉｎｅｌｌｏ Ｒ，Ｐｉｏｖａｎ Ａ，ｅｔ ａ１．ｆｌ－Ｇａｌａｅｔｏｓｉｄａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ［］Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌａ Ｂｏｔｎａｙ，２００ｌ，５２：ｌ ６３５一ｌ ６４５． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐａｐａｙａ 一Ｇａｌ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｈｅ ＷｅｉｙｉⅢ，Ｃｈｅｎ Ｘｉａｏｊｉｎｇ ‘Ｓｈｅｎ Ｙａｎｈｏｎｇ ‘Ｌｕ Ｂｉｎｇｇｕｏ １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５０００２； ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｌａｎｔｓ，ＦＡＦＵ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５０００２； ３ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，ＦＡＦＵ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５０００２，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｒａｐｉｄ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ ｏｆ ｐａｐａｙａ ｆｒｕｉｔ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．）ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｉｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ卢一Ｇａｌ ｇｅｎｅ．Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ，ａ ４５０１ ｂｐ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｐａｐａｙａ＃－ｃｄ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １７ ｉｎｔｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｘｏｎｓ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ｂａｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｆａｍｉｌｙ ３５ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌｙａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４２，ａｎｄ ｈａｄ ａ ｃｌｏｓｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，ｂｕｔ ｆａｒｔｈｅｒ ｗｉｔｈ Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｒｉａ ａｎｄ Ｈｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ａ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｏｃａｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ａｇａｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ｆｒｕｉｔ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ＃－ｃｄ ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ａｎｄ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ．ＣａＭＶ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐ２３０１／ＴｒＲＧ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ＃－ｃｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ卢一Ｇｄ－ＲＮＡｉ Ｔｗｏ—Ｔ—ＤＮＡ ｐｌｎａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐ２３０１／ＢＰＴＩ￣Ｇ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ２３０１／ＢＦＩＴＲＧ ｉｎｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｗａｓ ｅｏｎｆｍｎｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＰＣＲ ａｓｓａｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．； 一ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ｆｕｒｉｔ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｔｗｏ一 Ｉ．＿ＤＮＡ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ 责任编辑：沈德发