人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性

Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 17, 2013 Vol.17, No.51

www.CRTER.org

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.014 [http://www.crter.org]

孙江维，王东，孙海钰. 人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性[J].中国组织工程研究，2013，17(51):8869-8874.

人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性★

孙江维，王 东，孙海钰(山西医科大学第二临床医学院，山西省太原市 030001)

文章亮点：

1 硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架是由医用级硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成。该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特性，同时还具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用，但其复合后在体内降解过程并不十分明确，尤其降解产物对人成骨细胞的影响国内外也研究较少，基于以上理论，实验选择医用级硫酸钙与Ⅰ型胶原蛋白结合，研究其降解产物对人成骨细胞的影响。

2 结果表明医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物既不影响人成骨细胞的增殖生长，也不影响其正常生理功能，具有较好的生物相容性。 关键词：

生物材料；材料生物相容性；组织工程骨材料；人成骨细胞；硫酸钙；胶原膜；复合型支架；细胞相容性；相容性研究；降解产物 主题词：

生物相容性材料；组织工程；胶原；组织相容性

摘要

背景：以Ⅰ型胶原蛋白改性多孔硫酸钙生物支架在体内的降解过程尚不明确，其降解产物对人成骨细胞的影响国内外也缺少相关研究。

目的：观察人成骨细胞与硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物的生物相容性。 方法：将第2代人成骨细胞分别置于硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物浸提液及含体积分数10%新生牛血清DMEM培养液中培养，培养第1，3，5，7天以MTT法检测两组细胞增殖曲线，联合会推荐法测定细胞碱性磷酸酶活性，考马氏亮蓝微板法测定总蛋白。

结果与结论：在硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物浸提液中培养人成骨细胞的增殖速度略高于在含体积分数10%新生牛血清DMEM培养液中培养的细胞，但差异无显著性意义(P > 0.05)。两组碱性磷酸酶活性、总蛋白合成及碱性磷酸酶/总蛋白都随时间递增而增加，两组不同时间点上述指标差异均无显著性意义(P > 0.05)。表明硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物既不影响人成骨细胞的增殖生长，也不影响其正常生理功能，具有较好的生物相容性。

Compatibility of human osteoblasts and composite porous bioscaffold

Sun Jiang-wei, Wang Dong, Sun Hai-yu (The Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China)

Abstract

BACKGROUND: The degradation of a collagen Ⅰ modified porous calcium sulfate scaffold in vivo is unclear, and its degradation product effects on human osteoblasts are rarely reported.

OBJECTIVE: To observe the biocompatibility of human osteoblasts with degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold.

METHODS: Passage 2 human osteoblasts were cultured in the extract of degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold and in Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% newborn calf serum. At days 1, 3, 5, 7, cell proliferative curves and total protein were determined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide method and Coomassie brilliant blue micro-plate method, respectively. And alkaline phosphatase activity was also detected.

RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation rate of human osteoblasts in the extract of degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold was slightly higher than that in the Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% newborn calf serum, but there was no significant difference (P > 0.05). Alkaline phosphatase activity, total protein synthesis and alkaline phosphatase/total protein were increased with time in the two groups, but there was no significant difference at different time (P > 0.05). These findings indicate that the degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold cannot influence proliferation and growth of human osteoblasts as well as their normal physiological functions, which have good biocompatibility.

Subject headings: biocompatible materials; tissue engineering; collagen; histocompatibility

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 孙江维★，男，1986年生，山西省临汾市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事骨愈合机制研究。

sunjiangwei273@ 163.com

中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2013)51-08869-06

修回日期：2013-09-16 (201303184/GW

〃W)

Sun Jiang-wei★, Studying for master’s degree, the Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China

sunjiangwei273@163.com

Accepted: 2013-09-16

8869

孙江维，等. 人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性 www.CRTER.org

Sun JW, Wang D, Sun HY. Compatibility of human osteoblasts and composite porous bioscaffold. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(51):8869-8874.

0 引言 Introduction

近些年来随着医学的不断发展，特别是骨组织工程技术的发展，人类已开始对现有的支架材料进行各种表面修饰以提高其生物相容性[1]

。医用级硫酸钙支架是一种目前研究较多的骨性替代材料，它具有良好的骨引导性，可作为骨愈合过程中血管和人成骨细胞的基质。而胶原蛋白是体内含量最多的一种蛋白质，是细胞外基质的主要成分，骨骼中有机物的70%-80%是胶原蛋白，骨骼生成时，首先必须合成充足的胶原蛋白纤维来组成骨骼框架，因此，有人称胶原蛋白为骨骼中的骨骼。胶原蛋白能使钙质和骨细胞结合，防止钙质流失而导致骨骼疏松，Ⅰ型胶原蛋白是其中的一种主要类型。在多孔硫酸钙生物支架表面涂以具有良好组织相容性、低免疫原性、低抗原性的Ⅰ型胶原蛋白，可改善支架的细胞黏附性，促进人成骨细胞的分化与增殖[2]

。

硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架是由医用级硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成。该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特性，同时还具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用。但其复合后在体内降解过程并不十分明确，尤其降解产物对人成骨细胞的影响国内外也研究较少，基于以上理论，实验选择医用级硫酸钙与Ⅰ型胶原蛋白结合，研究其降解产物对人成骨细胞的影响。

1 材料和方法 Materials and methods

设计：细胞观察实验。

时间及地点：于2012年2至7月在山西医科大学第二临床医学院完成。

材料：

人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物相容性实验用主要试剂：

试剂

来源 Ⅰ型胶原溶液 Gibco公司 24 孔培养板

美国Costar公司 Hank’s液、0.25%胰酶消化液、PBS、医

武汉万德利生化试剂技术

用级硫酸钙支架

有限公司

碱性磷酸酶活性检测试剂盒

上海前尘生物科技有限公司 MTT

北京欣经科生物技术有限公司 二甲基亚砜、 DMEM

Sigma公司

2%巴比妥钠、 3%β-甘油酸钠、2%氯化钙、山西医科大学生物化学教研室

2%硫酸镁、2%硝酸钴、1%硫化铵、 冷丙酮

8870

人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物相容性实验用主要仪器：

仪器

来源

IG10-3A 型高速离心机 北京医用离心机厂 扫描电子显微镜

JSM-35CF，JAPAN

倒置生物相差显微镜

BDS200-PH，重庆奥特光学仪器

有限公司

电子称量天平

MP200-1，上海第二天平仪器厂 医用眼科剪

唐山先锋医疗器械有限公司 恒温磁力搅拌器

上海精科泪磁仪器厂

100目不锈钢筛 北京清源浩生物科技有限公司 101A-3E电热鼓风干燥箱

上海实验仪器厂有限公司 细胞培养瓶、 25.4 mm×76.2 mm载玻片

武汉博士德生物工程有限公司

实验方法：

松质骨取材：由于用人松质骨制备成骨细胞效果明显

且方便快捷，患者髋、膝骨关节炎或股骨颈骨折的发病率也较高，因此实验采用的松质骨均取自患者关节置换中切除的股骨头、颈或股骨髁等，取适当大小后将其放入无菌瓶内

[3-4]

。

成骨细胞的分离培养：将术中取出的松质骨送至实验

室后放于盛Hank’s液的培养皿中，用眼科剪剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm，除去骨上的血块和软组织，至肉眼无可见的软组织和血块附着。用Hank’s液反复冲洗至骨粒呈白色，吸去Hank’s液，将骨粒移至20 mL的烧瓶，加入0.25%胰酶消化液，在37 ℃恒温磁力搅拌器上搅拌30 min，加含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液2 mL，终止消化，用100目不锈钢筛过滤，弃去滤液。用上述方法再消化骨粒3次，每次搅拌后加含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液2 mL，终止消化，滤液盛于离心管，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液，作细胞计数，按约5×107 L-1

细胞浓度接种于培养瓶，标记接种时间，瓶盖微松，以备培养瓶内外气体交流，置于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，至24 h细胞贴壁，更换含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液，以后一般每2 d更换含体积分数10%新生牛血清的DMEM培

养液1次[5]

。

成骨细胞的鉴定：

形态学鉴定：用倒置相差显微镜观察培养的成骨细胞活体形态[6]

。

苏木精-伊红染色[7]

：将预先置入培养瓶中已生长有成骨细胞的玻片取出，用PBS(pH值7.4)冲洗3次，每次1.0-2.0 min。将玻片依次浸入体积分数95%乙醇固定 15 min、体积分数80%乙醇固定3 min、体积分数70%乙醇固定3 min、体积分数50%乙醇固定3min。PBS洗2

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org

孙江维，等. 人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性 次，每次1 min。加入苏木精染色液进行分色，数秒即可(稀盐酸乙醇溶液：用体积分数75%乙醇配制1%的盐酸)。自来水浸洗5 min。伊红染色5-10 min。自来水浸洗5 min。逐级脱水：体积分数70%，80%，90%乙醇各1次，体积分数95%乙醇2次，体积分数100%乙醇3次，每次1 min。树胶封固。镜下观察。

碱性磷酸酶染色：传代后的第10天成骨细胞长满培养瓶的壁和玻片，取出玻片，PBS冲洗后用冷丙酮固定10 min，蒸馏水冲洗数次，加入含2%巴比妥钠5 mL、3%β-甘油酸钠5 mL、2%氯化钙10 mL、2%硫酸镁 1 mL、蒸馏水10 mL的孵育液，37 ℃孵育4 h，自来水冲洗数次，加入2%硝酸钴反应5 min，蒸馏水漂洗数次，加入1%硫化铵反应2 min，自来水洗2次，干燥，透明，封固。观察染色效果，胞浆中出现黑色颗粒或块状沉淀为阳性[8]

。

碱性磷酸酶的生物学测定：取第2代成骨细胞，以5× 107

L-1细胞浓度接种于24孔无菌培养板，24 h后更换含体积分数10%牛血清的DMEM培养液，以后每3 d换含体积分数10%牛血清的DMEM培养液1次，至第8天成骨细胞长满培养板底吸去培养液，每孔分别加入无血清的DMEM培养液，放入含体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，收集上清液，用生化检测仪测定碱性磷酸酶活性。

硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架的降解：硫酸钙/胶

原膜复合型多孔生物支架是由医用硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成。该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特征，同时具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用。

复合Ⅰ型胶原多孔硫酸钙生物支架的制备：Ⅰ型胶原蛋白具有良好的组织相容性、低免疫原性与低抗原性，可改善支架的细胞黏附性，促进人成骨细胞的分化及增殖。将多孔硫酸钙支架浸于10 g/LⅠ型胶原溶液中，真空抽吸，冻干，自然降解3个月。

支架降解产物浸提液的制备：将降解后的支架用去离子水清洗3次，100 ℃真空干燥12 h，按样品质量和PBS(pH值7.4)的体积比为1 g/30 mL的比例将样品浸泡液置于密闭容器中，37 ℃恒温振荡。

人成骨细胞与硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物的相容性研究：将已经培养好的第2代人成骨细胞以

1×108 L-1

的细胞浓度接种于24孔板中，每孔1 mL，将24孔板分为实验组与对照组。12孔实验组每孔加入 100 μL硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物浸提液，12孔对照组每孔加入100 μL含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液，37 ℃恒温密闭培养，分别于第1，3，5，7，9天取两组各两孔作四唑盐比色法细胞计数，绘出细胞增殖曲线。使用国际临床化学联合会推荐法测定碱性磷酸酶活力，用考马氏亮蓝微板法测定总

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

www.CRTER.org

蛋白，计算出单位总蛋白碱性磷酸酶量，将结果做Wilcoxon配对法秩和检验。

主要观察指标：两组细胞的增殖、碱性磷酸酶活性及总蛋白检测结果。

统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件包进行Wilcoxon配对法秩和检验。

2 结果 Results 2.1 成骨细胞的分离培养结果 将制作好的人成骨细

胞切片镜下观察，观察结果见图1，2，人成骨细胞传代培养后，细胞多为菱形和多边形，细胞核较大，有多个突，起并且相互交叉，随着细胞增殖，碱性磷酸酶染色出现大量黑色颗粒。

注：细胞多为菱形和多边形，细胞核较大，有多个突起，并

且相互交叉。

图1 分离培养第2代人成骨细胞玻片的苏木精-伊红染色

(×100)

Figure 1 Hematoxylin-eosin staining of passage 2 human

osteoblast slides (×100)

图2 传代后第10天人成骨细胞碱性磷酸酶染色胞浆中出

现黑色颗粒(×100)

Figure 2 Black particles appeared in alkaline phosphatase

stained cytoplasm of human osteoblasts at 10 d after passage(×100)

2.2 硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物与成骨细胞的共培养 见图3，4。

复合Ⅰ型胶原的硫酸钙生物支架材料内部微孔丰富，分布均匀，呈现疏松珊瑚状结构，有部分类似于天

8871

孙江维，等. 人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性 然骨的微结构成分与特征，见图3。

注：材料内部微孔丰富，分布均匀，呈现疏松珊瑚状结构，

有部分类似于天然骨的微结构成分与特征。

图3 电镜观察复合Ⅰ型胶原的硫酸钙生物支架(×30) Figure 3 Electron microscope observation of collagen Ⅰ

modified porous calcium sulfate scaffold (×30)

倒置显微镜观察第2代人成骨细胞在硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架表面显现出良好的黏附性和增殖活性，细胞形态无明显变化，见图4。

注：成骨细胞在支架表面显现出良好的黏附性和增殖活性，

细胞形态无明显变化。

图4 倒置显微镜观察第2代人成骨细胞在硫酸钙/胶原膜 复合型多孔生物支架上的生长(×100)

Figure 4 Growth of passage 2 human osteoblasts on the

calcium sulfate/collagen membrane composite

porous scaffold under inverted microscope (×100)

2.3 硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物对人成骨细胞体外增殖的影响 实验组人成骨细胞增殖速度与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，两组均是在第3-5天里增殖最快，此时间点前后增殖相对较慢，见图5。

2.4 硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物对人成骨细胞碱性磷酸酶活力的影响 两组碱性磷酸酶活性和总蛋白合成，以及碱性磷酸酶/总蛋白都随时间递增而增加，两组间上述指标差异均无显著性意义 (P > 0.05)，见表1。

8872

www.CRTER.org

0.6 实验组 0.5 对照组 )A 0.4 (值度 0.3 光吸 0.2 0.1 0 1 d 3 d 5 d 7 d 9 d 注： 硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物浸提液培养的 为实验组，DMEM培养液培养的为对照组。两组均在第3-5天增殖最快，增殖速度差异无显著性意义，表明硫酸钙合型多孔生物支架降解产物不影响成骨细胞的增殖。 /胶原膜复 图5 人成骨细胞在硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降 解产物浸提液或DMEM培养液中的增殖 Figure 5 Passage 2 human osteoblasts were proliferated in the extract of degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold or in Dulbecco’s modified Eagle’s medium

表 1 在硫酸钙/胶原膜复合生物支架降解产物浸提液或

DMEM培养液中不同时间点人成骨细胞的碱性磷酸酶

和总蛋白合成

Table 1 Alkaline phosphatase activity and total protein

synthesis in human osteoblasts cultured in in the extract of degradation products of calcium

sulfate/collagen membrane composite porous scaffold and in Dulbecco’s modified Eagle’s medium at different time

硫酸钙/胶原膜复合生物支架降解产物浸提液组

项目

第1天

第3天

第5天

第7天

碱性磷酸酶 (U/mL) 0.001 13 0.002 30 0.004 25 0.007 80 总蛋白(g/L)

0.012 05 0.024 10 0.041 50 0.056 70 碱性磷酸酶 /总蛋白(U/mg)

0.093 78

0.095 44 0.102 41 0.137 57

项目

DMEM培养液组

第1天

第3天

第5天

第7天

碱性磷酸酶 (U/mL) 0.001 12 0.002 40 0.004 50 0.008 90 总蛋白 (g/L)

0.014 55 0.025 50 0.043 60 0.064 55 碱性磷酸酶/总蛋白(U/mg) 0.076 98

0.094 12 0.103 21 0.137 89

注：两组间碱性磷酸酶活性和总蛋白合成，以及碱性磷酸酶 /总蛋白差异均无显著性意义 (P > 0.05)，表明硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物不影响细胞的正常功能，具有较好的生物相容性。

3 讨论 Discussion

近些年来在临床上，骨科诊断治疗中经常会出现由

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org

孙江维，等. 人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性 于肿瘤或囊肿切除、创伤、感染、先天性疾病、手术、骨折不愈合等形成的缺损区，这些缺损区的存在导致病变处生物力学环境的改变，功能失用或引起感染成为慢性骨髓炎等疾病，对患者的生活造成了非常不良影响[9]

。在治疗中需要使用一些骨组织替代物来填充已形成的缺损，恢复病变处的外形、力学强度和生理功能，消灭死腔，减少术后感染等

[10]

。

所以，对于骨组织替代物或支架的研究成为目前的热门课题。组织工程目前主要的骨替代材料有：①自体骨：效果最好，但来源非常有限，会造成新的创伤。②同种异体骨：容易发生免疫排斥反应且来源有限，可能传播疾病且受伦理学的影响。③复合人工骨：来源广泛，目前已显示出良好的研究和应用前景，但需要进一步临床检验。④组织工程化骨：是在复合人工骨的基础上的改进，组成成分包括有载体、诱导成骨因子、种子细胞，接近自然骨，从修复能力来看，组织工程化骨已可以通过基因工程技术来促进骨折修复

[11-12]

。并且人们普遍认

为理想的骨替代材料应具有以下特性：材料表面结构及性质有利于细胞吸附、增殖和分化；可按控制的速度进行降解；良好的生物相容性；容易制成三维多孔状及易加工成不规则的几何形态；具有一定的机械强度，能够支持生理压力；能保持对细胞的分化，不会使细胞产生变异

[13-14]

。而现如今还没有一种材料能满足以上所有要

求。但随着材料学、组织工程学的飞速发展，各种新型的骨组织工程领域材料支架不断出现，骨缺损修复前景将会是非常乐观的

[15]

。

目前骨组织工程多孔生物支架材料的制备方法及过程在国内已基本成熟，采用的支架材料主要有人工合成材料和天然生物衍生材料及复合材料，其中以聚乙酸、聚乳酸、磷酸三钙、羟基磷灰石等较为常用

[16]

。人

们通过深入研究发现上述几种材料在进一步的研究过程中生物降解性和成骨作用都有不足之处：聚乙酸、聚乳酸虽然具有较好的生物相容性、可降解性和可吸收性，但存在费用昂贵、可塑性差等缺点，而且降解后的酸性代谢产物会降低聚合物周围的pH值，影响细胞和组织的生长，还可引起纤维化及发生周围组织的免疫反应；羟基磷灰石存在植入后难以吸收替代，长期滞留于体内妨碍骨组织的改建和完全修复等缺点

[17]

。所以实验

选择另一种材料——医用级硫酸钙支架。

医用级硫酸钙是一种骨引导性材料，主要作为空隙的填充物，它能恢复骨的形态轮廓，阻止软组织长入，它为血管和成骨细胞的长入提供了骨引导性基质。当医用硫酸钙被吸收时，新骨塑性并恢复解剖学特点和结构特性

[18]

。医用硫酸钙支架孔径分布在150-300 μm之间，

孔洞之间互相连通，而且材料内部微孔丰富、分布均匀，呈现疏松珊瑚状结构，这种结构类似于生物活体的松质骨构架，它有利于骨组织的长入和材料自身的生物降

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

www.CRTER.org

解。经过相关测试计算，多孔支架平均孔隙率为62.59%-79.36%，抗压强度为27-53 MPa(正常人体骨组织的生物力学强度松质骨为7.09 MPa、密质骨177-221 MPa)，其最重要的优点是其自然吸收速度与新骨形成速度相当

[19]

。随着医用硫酸钙植入物的吸收，

新骨也逐渐恢复解剖性质及结构特点。医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架是由医用硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成，该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特征，同时具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用，Ⅰ型胶原蛋白涂层于支架材料的微孔表面以后，成骨细胞在其表面显现出良好的黏附性和增殖活性，所以Ⅰ型胶原蛋白可作为骨黏附分子和骨特异性生长因子的良好载体，它与基质材料复合构建的支架具有很好促进新骨组织形成的能力

[20]

。但

此种复合物在体内降解过程并不十分明确，并且其降解产物对人成骨细胞的影响研究也较少，故实验从此处入手。

现阶段，体外细胞复合培养法是一种评价支架生物相容性的重要方法。实验取材来自患者关节置换中切除的股骨头、颈和股骨髁松质骨(患者及家属同意后)，通过制备、培养及鉴定人成骨细胞

[21]

，并且对医用级硫酸

钙/胶原膜复合型多孔生物支架进行降解，将培养好的人成骨细胞分别与复合支架降解产物浸提液(实验组)和含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液(对照组)相容培养，验证该复合型多孔支架降解产物对人成骨细胞的生物相容性。结果发现，通过MTT测定人成骨细胞体外增殖过程，发现实验组增殖速度略高于对照组，两组均是在第3-5天里增殖最快，前后增殖相对较慢，这也和人成骨细胞的增殖规律相一致，但两组无统计学差别，表明医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物对人成骨细胞的增殖、形态及生长无影响

[22]

。

人成骨细胞与支架复合培养只是材料生物相容性评价的一个方面，相容后细胞是否具有正常的生理功能是反映支架生物相容性最重要的证据。而碱性磷酸酶是人成骨细胞分化成熟的重要标志之一，也是说明人成骨细胞必不可少的参数之一

[23]

。实验通过测定人成骨细胞

的碱性磷酸酶活力发现，两组碱性磷酸酶/总蛋白差异无显著性意义(P=0.465)，表明医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物没有影响人成骨细胞的正常生理功能。

所以，医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物既不影响人成骨细胞的增殖生长，也不影响其正常生理功能，具有较好的生物相容性，是骨组织工程领域里一种新型的、安全的非金属植入性支架材料，降解后的代谢产物不会降低聚合物周围的pH值，不会影响细胞和组织的生长发育

[24]

，不会引起纤维化，以及发生周

围组织的免疫反应，植入后较易吸收替代，长期滞留于

8873

孙江维，等. 人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性 体内不会妨碍骨组织的改建和完全修复等，可塑性较好且经济实用，有望作为一种新的骨科植入材料应用于临床

[25]

。

致谢：感谢王东导师，孙海钰师兄。

作者贡献：实验设计、实施及材料收集为孙江维，实验评

估、校审为王东、孙海钰，孙江维对文章负责。

利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组

织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理要求：松质骨供者及其家属对实验知情同意。 学术术语：硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架-是由医用

级硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成。该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特性，同时还具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用。

作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，

无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

4 参考文献 References

[1]

Lange R, Lüthen F, Beck U,et al. Cell-extracellular matrix interaction and physico-chemical characteristics of titanium surfaces depend on the roughness of the material. Biomol Eng.2002;19(2-6):255-261.

[2]

杨玉生,孙俊英,朱伟,等.松质骨源性人成骨细胞的分离培养和细胞密度效应[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(3): 431-434.

[3] 雷荣昌,翦新春.松质骨支架与成骨细胞生物相容性的实验研究[J].口腔医学研究,2005,21(5):531-533.

[4] 章庆国,赵士芳,郭宗科,等.纳米相陶瓷支架与人成骨细胞生物相容性的体外实验研究[J].东南大学学报,2004,34(2):219-213. [5] 余科,贾颖,刘敏,等.国产纳米级羟基磷灰石复合胶原膜降解产物的生物相容性研究[J].海南医学,2008,19(9):50-51.

[6] 史光和,黄晓斌,陈钢,等.人成骨细胞与异体脱钙松质骨成骨作用的实验研究[J].中国基层医药,2006,13(8):1254-1255.

[7]

Leong KF,Cheah CM,Chua CK.Solid freeform fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissue and organs.Biomaterials.2003;24(13):2363-2367.

8874

www.CRTER.org

[8] 傅刚,杜靖远,杨述华,等.成人成骨细胞骨保护蛋白的表达与年龄关系的研究[J].中华实验外科杂志,2001,18(6):583-584.

[9] 郑志永,杨久山,毕荣修,等.人成骨细胞的离体培养和鉴定[J].中国中医骨伤科杂志,2006,14(4):8-9.

[10] 苏欣,廖二元,罗湘杭.人成骨细胞体外培养、鉴定及护骨素表达的研究[J].中国骨质疏松杂志,2002,8(4):283-287.

[11] 郝和平,奚延斐.医疗器械监督管理和评价[M].北京:中国医药科技出版社,2000:66,289-410.

[12] 王海彬,张兴凯,石印玉,等.人松质骨成骨细胞的培养[J].中国中医骨伤科杂志,1999,7(2):1-2.

[13]

孙海钰,王东,范伟,等.Ⅰ型胶原物理涂层新型多孔硫酸钙支架对兔桡骨缺损修复的影响[J].山西医科大学学报,2008,39(9): 825-829.

[14]

田学忠,刘越,陈华,等.硫酸钙人工骨研究进展[J].山东医药,2008, 48(9):142-145.

[15] Dudas JR,Losee JE, Penascino VM, et al. Leporine-derived adipose precursor cells exhibit in vitro osteogenic potential.J Craniofac Surg. 2008;19(2):360-368.

[16] 杜明奎,毛克亚,王继芳.β-磷酸三钙与α-半水硫酸钙降解研究进展[J].国际骨科学杂志,2008,29(1):6-25.

[17]

张梅霞,靳安民,闵少雄,等.仿生型生物玻璃/胶原蛋白/磷脂酰丝氨酸/透明质酸复合支架修复兔桡骨缺损[J].中国组织工程与临床康复,2006,10(29):59-62.

[18] 陈华,陶笙,张伯勋,等.硫酸钙作为骨填充修复材料的新观点与新认识[J].中国临床康复,2005,9(18):180-181.

[19]

南景天,李鸿,吕国玉,等.多元氨基酸共聚物/含锶硫酸钙复合材料制备及体外降解性能研究[J].动态材料,2010,6(41): 1056-1061.

[20] 尹飙,苏增贵,杨国忠.组织工程学在骨缺损中的应用研究[J].国外医学:生物医学工程分册,1999,22(2):83-87.

[21] 李文浩,张敏. nHAC膜的体内埋植超徽结构变化[J].华西口腔医学杂志,2004,22(增刊):82-85.

[22] 郭昭庆,党耕町,王志国.成人成骨细胞培养[J].中华骨科杂志, 1995,15(9):627-630.

[23] 欧阳钧,王前,王国英,等.人骨膜成骨细胞培养及初步观察[J].中华骨科杂志,1995,15(11):789-790.

[24] 翦新春,成洪泉,许春姣.天然生物衍生支架材料在骨组织工程中的应用进展[J].口腔颌面外科杂志,2003,13(3):239-242.

[25]

刘刚,胡蕴玉,赵建宁,等.Ⅰ型胶原促进骨髓基质干细胞粘附的细胞机制[J].中华创伤骨科杂志,2006,8(6):549-552.

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org