第３３卷第４期 ２０１１年１２月 南昌大学学报（工科版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｅｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ｖｏ１．３３ Ｎｏ．４ Ｄｅｃ．２０Ｉ１ 文章编号：１００６—０４５６（２０１１）０４—０３４８—０４ 腈水合酶耐底物突变株的筛选及产酶条件优化 黎常宏 ，张丽铃 ，王筱兰 （１．昌九农科化工有限公司，江西南昌３３００１２；２．江西师范大学生命科学学院，江西南昌３３００２２ ３．南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌３３００３１） 摘要：采用紫外诱变和梯度平板法筛选出耐底物的突变株，通过单因素实验考察发酵液起始ｐＨ值、装液量、发 酵周期、接种量对产酶的影响，确定最佳的发酵条件；采用均匀设汁实验优化发酵培养基。筛选出・株能耐受４％ 丙烯腈的腈水合酶产生菌，在最佳产酶条件下，耐底物突变株的腈水合酶酶活达到１１．５ＭＵ／ｍＬ，与优化前相比，酶 活提高了４９．３５％。腈水合酶耐底物突变株的最佳发酵条件为：初始ｐＨ ７．０、装液量１６％、发酵周期５８ ｈ、接种量 １０％。最佳发酵培养基配方为：ｐ（葡萄糖）＝２６ ｇ／Ｌ，Ｐ（酵母膏）＝２ ｇ／Ｌ，Ｐ（尿素）＝４ ｇ／Ｌ，Ｐ（谷氨酸钠）＝０．５ ｇ／Ｌ， Ｐ（Ｋ２ＨＰＯ４）＝０．２ ｇ／Ｌ，Ｐ（ＫＨ２ＰＯ４）＝０．２ ｇ／Ｌ，Ｐ（ＭｇＳＯ４）＝０．０５ ｇ／Ｌ， （ＤＸＬ）＝０．５ ｍＬ／Ｌ。 关键词：腈水合酶；筛选；优化；产酶 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标志码：Ａ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｎｉｔｒｉｌｅ Ｈｙｄｒａｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ＬＩ Ｃｈａｎｇ—ｈｏｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ—ｌｉｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｌａｎ （１．Ｃｈａｎｇｊｉｕ Ｎｏｎｇｋｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔ￣Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００１２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｅｈａｎｇ ３３００２２，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｓｉｒｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００３ １，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＵＶ—ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｂｒｅｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｓｔａｉｎＳ．Ｍｏｎｏ—ｆａ（‘一 ｔｏｒｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｆｅｒｍｅｎ— ｔａｔｉｏｎ ｐＨ，ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ，ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒ— ｍｉｎｅｄ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｂｙ ｕｎｉｆｏｒｍ ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｏｌｅｒａｔｅ ４％ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ．Ｉｎ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅ— ｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｕｔａｎｔ ｔｏ ｒｅａｃｈ １ １．５ ｍｉｌｌｉｏｎ Ｕ／ｍＬ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ４９．３５％．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｕｔａｎｔ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．０， ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ １ ６％，ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ５８ ｈ，ｉｎｏｃｕｌｕｍ １０％；Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｐ（ｇｌｕｃｏｓｅ）＝２６ ｇ／Ｌ，Ｐ（ｙｅａｓｔ ａｎｏｉｎｔｅｄ）＝２ ｇ／Ｌ，Ｐ（ｕｒｅａ）＝４ ｇ／Ｌ，Ｐ（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ）＝０．５ ｇ／ Ｌ，Ｐ（Ｋ２ＨＰＯ４）＝０．５ Ｌ，Ｐ（ＫＨ２ＰＯ４）＝０．２ ｇ／Ｌ，Ｐ（ＭｇＳＯ４）＝０．０５ ｇ／Ｌ， （ＤＸＬ）＝０．５ ｍＬ／Ｌ＿ Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 腈水合酶是一类能催化腈类化合物转化为相应 性、高选择性、反应条件温和、成本低和环境污染小 等优点 ，符合绿色化学的发展方向，成为当今的 的酰胺类化合物的同工酶，是以硫原子和半胱氨酸 二亚磺酸残基为绝对中心的一类可催化腈水解的 酶…。如今工业上广泛应用腈水合酶催化丙烯腈 生产丙烯酰胺。与化学法相比，微生物法具有高效 研究热点之一。一些学者通过分离纯化及驯化培 养，获得多株产腈水合酶的高产菌株 ，然而丙烯 腈属于高毒性化合物，菌体在催化反应过程中损伤 收稿日期：２０１１—０７—１２ 基金项目：江西省科技支撑计划基金资助项目（２００９ＪＸ００５６４） （４）：３４８—３５１． ．。 芎作者简介：黎常宏（１９７０一），男，高级工程师；通信作者：王筱兰（１９６５一），女，教授，博士，ｘ）ｗａｎ￣Ｓ ． ．：ｃｎ ， ｌ茭福式：藜常宏，张丽铃，王筱兰．腈水合酶耐底物突变株的筛选及产酶条件优化［Ｊ］．南昌大字，％字ｙａ撇ｈｏ科ｏｒｎ版：ｏｃ：１一，２０１１，３３ 第４期 黎常宏，等：腈水合酶耐底物突变株的筛选及产酶条件优化 比较大，在催化１～２批次后酶活下降很快，菌体不 适合再回收利用。筛选出能耐受丙烯腈且产腈水合 酶高的菌株成为微生物法生产丙烯酰胺的关键。 本研究旨在通过实验筛选出耐受丙烯腈的突变 株，并优化突变株的发酵条件和发酵液组分的配比， 以提高腈水合酶酶活，最终获得腈水合酶耐底物突 变株的最佳产酶条件，为菌株应用于工业化生产提 供实验依据和指导，提高生产效率。 １材料与方法 １．１菌种 诺卡氏菌Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ ＮＫ４，昌九农科化工有限 公司生产用菌。 １．２培养基 １）斜面培养基配方：Ｐ（葡萄糖）＝１０ ｇ／Ｌ， Ｐ（酵母膏）＝３ ｇ／Ｌ，Ｐ（蛋白胨）＝２ ｇ／Ｌ，Ｐ（ＮａＣ１）＝ １ ｇ／Ｌ，Ｐ（Ｋ２ＨＰＯ４）＝２ ｇ／Ｌ，Ｐ（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０）＝２ ｇ／ Ｌ，Ｐ（琼脂）＝２０ ｇ／Ｌ。 ２）种子瓶培养基配方：Ｐ（葡萄糖）＝２０ ｇ／Ｌ， Ｐ（酵母膏）＝５ ｇ／Ｌ，Ｐ（尿素）：７ ｇ／Ｌ，Ｐ（谷氨酸钠）＝ １ Ｌ，Ｐ（ＫＨ２ＰＯ４）＝０．５ Ｌ，Ｐ（Ｋ２ＨＰＯ４）＝０．５ ｇ／Ｌ， Ｐ（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０）＝０．２ ｇ／Ｌ， （ＤＸＬ）＝１ ｍＩ／Ｌ。 ３）优化前发酵培养基：Ｐ（葡萄糖）＝２０ ｇ／Ｌ， Ｐ（酵母膏）＝５ ｇ／Ｌ，Ｐ（尿素）：７ Ｌ，Ｐ（谷氨酸钠）＝ １ ｇ／Ｌ，Ｐ（ＫＨ２ＰＯ４）＝０．５ ｇ／Ｌ，Ｐ（Ｋ２ＨＰＯ４）＝０．５ Ｌ， Ｐ（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０）＝０．２ ｇ／Ｌ， （ＤＸＬ）＝１ ｍＩ／Ｌ。 １．３酶活测定 １）准确移取１ ｍＬ发酵液，１９ ｍＬ ０．０２５ ｍｏｌ／Ｌ 的磷酸缓冲液于１５０ ｍＬ具塞三角瓶中，将三角瓶放 人到恒温水浴中，开启振荡，温度恒定在２８℃，加入 １ Ｌ丙烯腈，反应５ ｍｉｎ，加入４ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１２００ ｍＬ中 止反应。反应结束后１５０ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｍｉｎ。 ２）取上清夜１ ｍＬ于小瓶内，加入１ ｍＬ乙酰胺 内标溶液，用内标法在气相色谱仪上测丙烯酰胺含 量 ］。酶活定义为：每毫升菌液每小时催化丙烯腈 生成丙烯酰胺的微克数。 １．４耐底物突变株的筛选 从菌种斜面刮取少量菌体置于装有玻璃珠和无 菌水的三角瓶中，打散摇匀成菌悬液，将菌悬液稀释 至一定浓度，取０．１ ｍＬ菌悬液分别涂布到含有 ０．５％，１％的丙烯腈平板上，置于紫外灯下（１５ ｗ， ３０ ｅｍ处）照射４０ Ｓ和８０ Ｓ。然后置于恒温培养箱 中２８℃避光培养４ ｄ，将在含１％的丙烯腈平板上 长出的单菌落分别划线到含２％丙烯腈的平板上， 以此方法直到筛选出能在含４％丙烯腈的固体培养 基上长出的突变株。 １．５发酵条件优化 将培养好的种子液接种到发酵瓶中２８ ｏＣ、２２０ ｒ／ｍｉｎ发酵培养。未优化前的发酵条件是起始ｐＨ ７．５、装液量１４％、接种量８％、发酵５０ ｈ。采用单因 素设计实验优化初始ｐＨ、装液量、接种量、发酵周期 进行优化。每个因素取６个水平，在选取其中一个 因素做变量时，其他因素保持原有水平。 １．６培养基优化 考察发酵产酶培养基的８种成分，通过均匀设 计 Ｊ，回归优化 ］、汰选变量，确定最佳发酵产酶 培养基配比。 ２结果与分析 ２．１筛选耐底物突变株 通过实验发现：紫外诱变４０ Ｓ，在含０．５％丙烯 腈的固体培养基上能长出少量的突变株，在含１％ 丙烯腈的固体培养基上则没有长出菌落。紫外诱变 ８０ ｓ，在含０．５％丙烯腈的固体培养基上能长出大量 的突变株，在含１％丙烯腈的固体培养基上长出少 量单菌落。由此可知高剂量诱变有利于筛选出耐受 丙烯腈能力强的突变株。最终筛选出一株能耐受 ４％丙烯腈的突变株，标记为ＮＫ１０。 ２．２初始ｐＨ值的优选试验 初始ｐＨ值分别取６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５， 比较不同初始ｐＨ值对发酵产酶的影响，结果见图 １。由图ｌ可知：初始ｐＨ对菌株ＮＫ１０产酶影响较 大，当初始ｐＨ值低于６．５和高于８．０时，产酶量急 剧降低，当发酵液初始ｐＨ值为７．０时，发酵液腈水 合酶酶活最高。 喜｛ 童 谧 ｐＨ 图１初始ｐＨ对腈水合酶酶活的影响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＩ－Ｉ Ｏｉｌ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ２．３摇瓶装液量的优选试验 比较装液量分别为８％，１０％，１２％，１４％， １６％，１８％对发酵产酶的影响，结果见图２。 从图２可得：装液量为１６％时，发酵液中腈水合 南昌大学学报（工科版） 喜 ２ 藿０６ ８ １０ １２ １４ １６ １８ ２０ 装液量／％ 取４２，４６，５０，５４，５８，６０ ｈ，测定不同发酵周期发酵液 的酶活，确定ＮＫ１０产腈水合酶的最优发酵周期，结 果见表２。 表２发酵周期对腈水合酶酶活的影响 Ｔａｂ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｏｎ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ａｃｔｉｉｔｙ ｖ图２装液量对腈水合酶酶活的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｌｅｖｅｌ ｏｎ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ 发酵时间／ ｈ ４２ ４６ ５０ 酶活／ ５．５３ ５．８０ ７．５８ 发酵时间／ ｈ ５４ ５８ ６０ 酶活／ ９．００ ９．９ｌ ９．３Ｏ （ＭＵ・ｍＬ ） （ＭＵ・ｍＬ ） 酶酶活最高。装液量过低不但降低设备的使用率， 而且不利于产酶，ＮＫ１０为好氧菌，装液量过大会导 致发酵液中溶解氧降低，不利于菌体生长及代谢。 ２．４接种量的优选试验 从表２可知：最佳发酵周期为５８ ｈ。发酵周期 对产酶影响较大，从４６ ｈ后产酶量急剧增加，５８ ｈ 接种量分别取６％，８％，１０％和１２％，其他发酵 条件为初始发酵条件，考察接种量对ＮＫ１０产腈水 合酶的影响，结果见表１。 表１ 接种量对腈水合酶酶活的影响 Ｔａｂ．１ Ｅ娌ｈｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ ｏｎ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ａｃｔｉｉｔｙ ｖ后发酵液酶活反而降低。发酵周期过长，营养物质 消耗殆尽，有害代谢产物积累，菌体进入衰亡期，部 分菌体开始自溶，导致腈水合酶失活。 以单因素实验确定的最佳发酵条件即初始ｐＨ ７．０、装液量１６％、发酵周期５８ ｈ、接种量１０％进行 接种量／ ％ ２ ４ ６ 酶活／ （ＭＵ・ｍＬ ） ２．ｏ０ ６．５３ ７．０４ 接种量／ ％ ８ ｌＯ １２ 酶活／ （ＭＵ・ｍＬ一。） ７．６ｏ １Ｏ．０７ ８．６０ 验证实验，结果在该发酵条件下发酵液腈水合酶酶 活可达１０．２７ ＭＵ／ｍＬ。 ２．６培养基的优选试验 表３列出了均匀设计的不同培养基，标号为１ ～１３，每行表示一组试验，按照设计的培养基进行发 接种量太小时，会延长发酵周期，造成浪费；接 种量太大时，菌体生长过剩，大量的营养物质被菌体 所消耗，也不利于产物合成。由表３可知：接 种量为１０％时，产腈水合酶能力最强，腈水合酶活可 达１０．０７ ＭＵ／ｍＬ，因此１０％为最适接种量。 ２．５发酵周期的优选试验 酵试验，每组３个平行，结果见表３。各因素的水平 值为自变量、腈水合酶酶活（１，）为响应值，采用ＳＰＳＳ 数据处理系统对表３试验数据进行二次多项式逐步 回归分析，方差分析见表４。从表４可知：显著性水 平Ｓｉｇ．＝０．０００说明回归方程变量间关系是极显著 的。剔除不显著项，得到回归方程为：Ｙ＝一５．４１１＋ ０．７０８Ａ一４．５９５Ｆ一２．４９１Ｅ，回归方程系数 可达 其他发酵条件为初始发酵条件，发酵周期分别 表３均匀设计各因子水平组合及腈水合酶酶活 Ｔａｂ．３ Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｃｈｏｓｅｎ ｆｏｒ Ｅｖｅｎ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ 第４期 黎常宏，等：腈水合酶耐底物突变株的筛选及产酶条件优化 ０．９７９，说明方程能够很好地拟合实验数据。依据求 解方程，得出的最高酶活预测值达１１．５６ ＭＵ／ｍＬ， 提高了３３．３７％。 ３）均匀设计实验结果表明：发酵培养基中葡萄 各因素的组合为Ａ＝２６，Ｂ＝２，Ｃ＝４，Ｄ＝０．５，Ｅ＝ ０．２，Ｆ＝０．２，Ｇ＝０．０５，Ｈ：０．０５。通过验证实验，腈 水合酶酶活可达１１．５０ ＭＵ／ｍＬ，与预测的相对误差 为０．５％，说明方程预测性较好，给出的各因素组合 可确定为最佳产酶培养基配比。 表４方差分析表 Ｔａｂ．４ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｔａｂｌｅ 糖对产酶影响显著，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾对产 酶也有较大影响，在一定范围内，产酶能力与发酵液 中的葡萄糖的量呈正相关性，与磷酸氢二钾和磷酸 二氢钾呈负相关。最终优化后的发酵培养基配比 为：ｐ（葡萄糖）＝２６．０ ｇ／Ｌ，Ｐ（酵母膏）＝２．０ ｇ／Ｌ， Ｐ（尿素）＝４．０ ｇ／Ｌ，Ｐ（谷氨酸钠）＝０．５ ｇ／Ｌ， Ｐ（Ｋ２ＨＰＯ４）＝０．２ ｇ／Ｌ，Ｐ（ＫＨ２ＰＯ４）＝０．２ ｇ／Ｌ， Ｐ（ＭｇＳＯ４）＝Ｏ．０５ ｇ／Ｌ， （ＤＸＬ）＝０．５ ｍＬ／Ｌ。在最 优发酵培养基配方条件下，耐底物突变株的腈水合 酶酶活达到１１．５ ＭＵ／ｍＬ。 ２・７突变株实际生产应用情况 将筛选出的耐底物突变株ＮＫ１０应用于实际生 产，与原有菌种的应用情况对比如表５所示。 表５生产指标对比情况 Ｔａｂ．５ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｓ 参考文献： １ｊ １Ｊ １Ｊ １Ｊ １ｊ ［ ］ｓＡⅥＬ Ｃ，ＯＫＡＹ ０・Ｔｈｅ ｅ ｃ 。 ｐｒｅｐａ嘣ｉ０ｎ ｅｍｐｅ蹦ｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｐｏｌｙ ｆ Ｎ一２ｉｓｏｐ ｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍ— ｉｄｅ）ｇｅｌｓ［Ｊ］．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０００，４５：１７５—１８２． ＪＯＧ Ｒ，ＳＨＲＥＥＮＡＴＨ Ｐ，ＴＥＫ Ｃ Ｂ．Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏ－ ｃｈｒｏｕｓ ＰＡ２ ３４：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｃａｔｌｙｓｔａ ｆｏｒ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｓｙｎ・ ｌ ５００ 菌种 ＮＫ４ Ｍ ｌ１．００ 水 ６ 化 ｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４１（６）：１３５９— １３６３． ＮＫ１０ １０．０ｏ ８ １ ０００ 刘铭，焦鹏，曹竹安．微生物法生产丙烯酸胺的生物催 从表５可以看出：突变株应用于实际放大生产， 即使在优化后的产酶条件下酶活要比实验室阶段 化剂一腈水合酶研究进展［Ｊ］．化工学报，２００１，５２ （１Ｏ）：８４７—８５０． ＸＵ Ｊ Ｊ，ＰＥＬＴＯＮ Ｒ．Ａ ｎｅｗ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｐｏｌｙ（Ｎ—ｉｓｏｐ ｒｏｐｙ－ 低，放大生产时的产酶条件有待进一步修正。突变 株实际生产中虽然酶活比原有的菌种酶活低但催化 反应的次数却更多，丙烯酰胺水剂的电导率明显降 低，大大缩短了水剂进一步纯化的时间，同时减少了 除杂时离子柱的损耗，并且减少了处理废液的时间， 大大提高了生产效率。 ｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ａ ｏｌｐｙｖｉｎｙｌａｍｉｎｅ ｃｏｒｏｎａ ［Ｊ］．Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄｌｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ，２００４，２７６：１１３—１１７． 国家技术监督局．ＧＢ １２００５．３—８９聚丙烯酰胺中残留 丙烯酰胺含量测定方法：溴化法［ｓ］．北京：中国标准 出版社，１９９０：９—１１． 方开泰．均匀设计与均匀设计表［Ｍ］．北京：科学出版 社，１９９４． ３ 结论 １）以底物为选择压力，筛选出一株能耐受丙烯 李夏兰，魏国栋，王昭晶，等．碱溶性包心芥菜多糖的 分离纯化研究［Ｊ］．南昌大学学报：工科版，２００６，２８ （４）：３２６—３２８． 腈４％的突变株，水合催化反应批数增加，大大提高 了生产效率。 ２）通过单因素实验优选出腈水合酶耐底物突 变株的最佳发酵条件为：初始ｐＨ ７．０、装液量１６％、 发酵周期５８ ｈ、接种量１０％。在此条件下进行发 酵，腈水合酶酶活可达１０．２７ ＭＵ／ｍＬ，比初始酶活 楮以文．微生物培养基优化方法及其ＯＰＴＩ优化软件 ［Ｊ］．国外医药：抗生素分册，１９９９（２）：５８—６０． 唐启义，冯明光．实用统计分析及其ＤＰＳ数据处理系 统［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．