真核细胞RNA的提取

发布: 2010-03-10 来自: 易生物实验

RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象，分离制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。

真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取 的关键

真核细胞RNA的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。

二、组织RNA提取的基本步骤

1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。

2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧

化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。

3.主要步骤

（1）取组织50~100mg，加0.8ml Trizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。

氯仿，充分震荡混匀，静置0.5ml异丙醇，颠倒混匀。－1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，10min。

l DEPC溶液，充分溶解RNARNA溶解液，按一定比例稀释后，紫外分光光度计测值，计算OD260/OD280OD260＝1时，RNA浓度约为）＝OD260×稀释倍数×401%甲醛变性胶电泳观察甲醛变性凝胶板：4.5μl RNA，12000g×℃静置2h，4℃1.7~2.0，根据下述公式计算×甲醛胶电泳缓冲液，离心。弃沉淀。

×10min×5min离心。

：1之间，说明RNA浓度：3%过氧化3.5μl 37%甲

（2）加0.2ml3min，4℃15min（3）取上清，加入204℃，12000g离心。

（4）弃上清，取沉淀，加入，7500g（5）弃上清，沉淀真空干燥（6）加40μ。

4.结果鉴定

（1）紫外分光光度计检测：取定260nm、280nmOD比值，如果比值在RNA纯度可。

标准样品当40μg/mlRNA浓度（μg/ml。

（2）电泳检测：RNA质量，电泳槽及制胶板先用氢浸泡过夜；制1%，2ul 5醛，10ul甲酰胺，离心混匀，65℃变性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28S RNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品－70℃保存备用。

三、注意事项

1、所有玻璃器皿160～180℃高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理。

2、实验用水要经DEPC处理，但含Tris的试剂不能用DEPC处理。

3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。

药大0942605