胃癌中RBBP4和BCL-2的表达及意义

曹嬿;范松龙;张智弘

【摘 要】Purpose To investigate the expression and significance of RBBP4 and BCL-2 in gastric carcinoma and to explore the relationship between their expression and clinicopathologic characteristics.Methods Immunohistochemistry was used to detect RBBP4 and BCL-2 proteins' expression in the 72 tumor tissues and para-cancer tissues.The association of RBBP4 expression with the clinicopathologic features and the expression correlation between RBBP4 and BCL-2 were analyzed.Real-time PCR was used to detect the expression of RBBP4 mRNA in the 20 tumor tissues and corresponding para-cancer tissues.Results Immunohistochemical results showed that 40 cases of cancer tissues exhibited RBBP4 positive expression,with a positive rate of 55.6％,and 36 cases showed BCL-2 positive expression (50％ positive rate),which were significantly higher than that in para-cancer mucosa (13.9％,16.7％).The over-expression of RBBP4 and BCL-2 was correlated with tumor differentiation,invasive depth and lymphatic metastasis in gastric carcinoma (P＜ 0.05).The expression of RBBP4 was positively correlated with BCL-2 (r =0.559,P ＜ 0.05).Real-time PCR results showed that the relative expression levels of RBBP4 mRNA in gastric carcinoma tissues and para-cancer tissues were 9.988 ± 1.948 and 1.458 ± 0.489 respectively,and the expression in gastric carcinoma was significantly up-regulated as compared with para-cancer

tissues.Conclusions The expression of RBBP4 is up-regulated in gastric

carcinoma,which may be involved in the development,invasion and metastasis of gastric carcinoma.RBBP4 might become a new diagnostic and prognostic marker for gastric carcinoma.%目的 探讨视网膜母细胞瘤结合蛋白4(retinoblastoma binding protein 4,RBBP4)和BCL-2在胃癌中的表达及其与临床病理特征的关系.方法 采用免疫组化SP法检测72例胃癌及对应癌旁组织中RBBP4、BCL-2蛋白表达,分析RBBP4与胃癌临床病理特征的关系及与BCL-2表达的相关性.实时荧光定量PCR法检测20例胃癌及癌旁组织中RBBP4 mRNA的表达.结果 RBBP4、BCL-2蛋白在癌组织中的阳性率分别为55.6％(40/72)、50％(36/72),显著高于癌旁组织13.9％、16.7％.RBBP4和BCL-2高表达均与肿瘤分化、浸润深度及淋巴结转移明显相关(P＜0.05),且RBBP4和BCL-2蛋白的表达呈正相关(r =0.559,P＜0.05).RBBP4 mRNA在胃癌组织中的相对表达水平(9.988±1.948)显著高于癌旁组织(1.458±0.489).结论 RBBP4在胃癌中的表达升高,可能和胃癌的发生、发展及侵袭转移有关,可能成为胃癌诊断和预后评估的新指标. 【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》 【年(卷),期】2017(033)010 【总页数】4页(P1070-1073)

【关键词】胃肿瘤;RBBP4;BCL-2;免疫组织化学;实时荧光定量PCR 【作 者】曹嬿;范松龙;张智弘

【作者单位】南京医科大学第一附属医院病理科,南京210029;南京中医药大学附属常州市中医医院病理科,常州213000;南京中医药大学附属常州市中医医院病理科,常州213000;南京医科大学第一附属医院病理科,南京210029

【正文语种】中 文 【中图分类】R735.2

胃癌病死率高居癌症相关病死率的第3位，严重威胁人类的健康[1]。除早期胃癌外，进展期胃癌复发率高，预后很差，5年生存率为5%～20%[2]。因此寻找新的分子标志物对实施个体化治疗和预后判断尤为重要。近年研究发现视网膜母细胞瘤结合蛋白4(retinoblastoma binding protein 4, RBBP4)与肿瘤的增殖、复发、治疗抵抗有密切关系[3-4]。有文献报道RBBP4在前列腺癌[5]、肝细胞肝癌[6]、子宫颈癌[7]中高表达，但在胃癌中报道较少且不明确。本文通过检测RBBP4在胃癌中的表达，分析其与胃癌临床病理特征的关系，同时检测肿瘤凋亡相关因子BCL-2的表达，分析两者表达的相关性及意义。

1.1 临床资料 选取常州市中医医院病理科2012年～2015年存档的胃癌手术切除标本，按WHO(2010)胃癌组织学分级及分类标准诊断。所有病例术前均未行放、化疗等抗肿瘤治疗。标本送至病理科后规范固定、取材、常规脱水并制成蜡块。选取有代表性的肿瘤组织和正常组织蜡块，免疫组化法检测RBBP4和BCL-2蛋白表达，同时以实时荧光定量PCR法检测其中20例胃癌组织和癌旁组织中RBBP4 mRNA的表达。 1.2 方法

1.2.1 试剂 免疫组化抗体：鼠抗人RBBP4单克隆抗体(稀释倍数1 ∶200)，鼠抗人BCL-2单克隆抗体(即用型)，免疫组化试剂盒购自北京西雅金桥公司。PureLink FFPE Total RNA Isolation Kit(Invitrogen公司)用于提取RNA，High-Capacity cDNA Reverse Transcriptipon Kit(ABI公司)用于逆转录，PCR试剂盒Power SYBR Green master mix(ABI公司)用于PCR扩增。

1.2.2 免疫组化 采用免疫组化SP法检测胃癌及癌旁组织中RBBP4、BCL-2蛋白表

达。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作为阳性对照。结果判定：由两位病理医师分别阅片并结果判定。RBBP4特异性染色定位于细胞核，BCL-2主要表达在细胞核膜和细胞质，染色阳性为出现黄色和棕黄色颗粒。每例镜下采集10个低倍视野，根据阳性细胞百分比和染色强度综合评分：(1)按阳性细胞百分比评分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。(2)按染色强度评分：无阳性染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分结果相乘：<2分为阴性，≥2分为阳性。

1.2.3 实时荧光定量PCR 将选取好的肿瘤组织蜡块20例分别切取白片3张，将白片放入去离子水中，用消毒的手术刀片对照HE染色切片的位置将肿瘤组织和肿瘤旁组织分别刮下，装入离心管中，根据Invitrogen公司的PureLink FFPE Total RNA Isolation Kit的步骤进行RNA提取，-80 ℃保存。通过逆转录反应合成cDNA，而后以cDNA产物为模板，设计合成PCR引物，引物序列：上游5′-TCTTTACAGGGCATACGG-3′，下游5′-TGAGTGGCTTGGTTTGGA-3′；β-actin上游5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′，下游5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。PCR反应条件：95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，共进行40个循环。设置管家基因β-actin为内参照。反应结束后由仪器自动分析结果，以2-△Ct及2-△△Ct计算mRNA的相对表达量。

1.3 统计学分析 使用统计分析软件SPSS 22.0和Graphpad 5.0进行数据分析，使用Pearson χ2检验、校正的χ2检验这两种统计检验方法和Spearman相关性分析，分析RBBP4、BCL-2表达与胃癌临床病理特征之间的相关性，显著性检验采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 胃癌组织与癌旁组织中RBBP4、BCL-2的表达 胃癌组织中RBBP4、BCL-2的表达明显高于癌旁组织(P<0.05，表1，图1、2)。

2.2 RBBP4、BCL-2表达与胃癌临床病理特征的关系 RBBP4、BCL-2表达均与胃癌组织学分级、浸润深度以及淋巴结侵犯密切相关(P<0.05)。而与患者年龄、性别、肿瘤大小和神经侵犯与否无关(P>0.05，表2)。

2.3 胃癌组织中RBBP4与BCL-2表达的相关性 Spearman相关分析结果显示，胃癌组织中RBBP4与BCL-2表达呈正相关(P<0.05，表3)。

2.4 胃癌及癌旁组织中RBBP4 mRNA的表达 实时荧光定量PCR检测结果表明，20例胃癌组织中RBBP4 mRNA的表达平均值为9.988±1.948，明显高于20例癌旁组织RBBP4 mRNA表达水平(1.458±0.489)(P<0.000 1，图3)。

RBBP4属于WD40蛋白家族，为一种Rb结合蛋白，参与染色体配置、核小体修饰、细胞周期进展及肿瘤干细胞分化等功能[8-9]，并通过一系列中间环节，影响细胞因子的转录及细胞增殖[10]，并且对肿瘤放、化疗效果有一定影响[11-12]。RBBP4在不同肿瘤中的意义并不相同。原发性肝癌中RBBP4呈高表达，是一种癌基因[13]，在子宫颈癌细胞中，沉默RBBP4基因后其转移、侵袭能力下降[7]。但既往也有研究报道RBBP4抑制子宫颈癌的发生[14]。本组实验采用免疫组化法检测胃癌和癌旁组织中RBBP4的表达，发现RBBP4在胃癌组织中的表达(55.6%)明显高于癌旁组织(13.9%)，进一步应用石蜡组织检测RBBP4 mRNA的表达水平，结果显示胃癌组织中RBBP4 mRNA的表达水平显著高于癌旁组织。这些实验结果表明胃癌组织中RBBP4蛋白和mRNA表达水平均升高，提示RBBP4可能参与胃癌发生、发展，是一种促癌基因。此外，本组实验深入分析其与胃癌临床病理特征的关系，免疫组化结果显示RBBP4表达与胃癌组织学分级、浸润深度以及淋巴结侵犯密切相关，组织分化越差、浸润能力越强、有淋巴结转移的胃癌组织中RBBP4表达显著升高，而这些因素均与肿瘤预后有关。这说明RBBP4表达水平能反映胃癌的进展情况，可以作为判断胃癌预后和早期诊断的新指标。

有研究报道RBBP4家族成员RBBP2通过上调BCL-2蛋白参与白血病的进展[15]，

因此作者也试图通过分析胃癌中RBBP4与BCL-2的相关性来了解RBBP4在胃癌中的作用机制。本组实验采用免疫组化法检测BCL-2蛋白表达及其与RBBP4表达的相关性。BCL-2蛋白是与肿瘤细胞增殖、凋亡相关的重要蛋白，具有很强的凋亡抑制功能，其过表达是肿瘤转移进展的重要原因之一[16]。许多研究显示胃癌中BCL-2蛋白高表达参与胃癌的发生、发展。本组实验结果显示，BCL-2蛋白与RBBP4蛋白一样，在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，与组织学分级、浸润深度、淋巴结转移相关，且胃癌组织中RBBP4表达与BCL-2蛋白表达呈正相关，即RBBP4可能通过促进BCL-2蛋白的表达，从而抑制胃癌细胞的凋亡，参与胃癌的发生、发展。

综上所述，本组实验证实了RBBP4与胃癌临床病理特征的关系，可作为胃癌预后判断重要指标之一，且初步揭示了RBBP4与胃癌的关系可能是通过调控BCL-2凋亡细胞通路。本实验仍处于初步阶段，缺乏对患者生存时间的相关分析，且病例数仍不足，下一步需进行更大样本量的研究并随访收集相关数据，为RBBP4成为重要的预后指标和靶向治疗提供充足的证据。

2南京中医药大学附属常州市中医医院病理科，常州 213000 张智弘，女，主任医师，博士生导师,通讯作者。E-mail: ************************ 【相关文献】

[1] Torre L A, Bray F, Siegel R L, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Shah M A. Update on metastatic gastric and esophageal cancers[J]. J Clin Oncol, 2015,33(16):1760-1769.

[3] Richly H, Aloia L, Di Croce L, et al. Roles of the Polycomb group proteins in stem cells and cancer[J]. Cell Death Dis, 2011,2(9):e204.

[4] Tsujii A, Miyamoto Y, Moriyama T, et al. Retinoblastoma-binding protein 4-regulated classical nuclear transport is involved in cellular senescence[J]. J Biol Chem, 2015,290(49):29375-29388.

[5] Chen J H, He H C, Jiang F N, et al. Analysis of the specific pathways and networks of prostate cancer for gene expression profiles in the Chinese population[J]. Med Oncol, 2012,29(3):1972-1984.

[6] Song H, Xia S L, Liao C, et al. Genes encoding Pir51, Beclin 1, RbAp48 and aldolase b are up or down-regulated in human primary hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2004,10(4):509-513.

[7] 钟晶晶, 杨旭锐, 麦梅清, 等. 下调RbAp48表达可抑制人宫颈癌MS751细胞株的迁移侵袭能力[J]. 南方医科大学学报, 2015,35(11):1564-1569.

[8] Krüger A V, Jelier R, Dzyubachyk O, et al. Comprehensive single cell-resolution analysis of the role of chromatin regulators in early C. Elegans embryogenesis[J]. Dev Biol, 2015,398(2):153-162.

[9] Satrimafitrah P, Barman H K, Ahmad A, et al. RbAp48 is essential for viability of vertebrate cells and plays a role in chromosome stability[J]. Chromosome Res, 2016,24(2):161-173.

[10] Wang X, Yao F, Liang X, et al. Cloning and expression of retinoblastoma-binding protein 4 gene in embryo diapause termination and in response to salinity stress from brine shrimp Artemia sinica[J]. Gene, 2016,591(2):351-361.

[11] Zheng L, Tang W, Wei F, et al. Radiation-inducible protein RbAp48 contributes to radiosensitivity of cervical cancer cells[J]. Gynecol Oncol, 2013,130(3):601-608. [12] Kitange G J, Mladek A C, Schroeder M A, et al. Retinoblastoma binding protein 4 modulates temozolomide sensitivity in glioblastoma by regulating DNA repair proteins[J]. Cell Rep, 2016,14(11):2587-2598.

[13] Zhu P, Wang Y, He L, et al. ZIC2-dependent OCT4 activation drives self-renewal of human liver cancer stem cells[J]. J Clin Invest, 2015,125(10):3795-3808. [14] Kong L, Yu X P, Bai X H, et al. RbAp48 is a critical mediator controlling the

transforming activity of human papillomavirus type 16 in cervical cancer[J]. J Biol Chem, 2007,282(36):26381-26391.

[15] Wang X, Zhou M, Fu Y, et al. RBP2 promotes adult acute lymphoblastic leukemia by upregulating BCL-2[J]. PLoS One, 2016,11(3):e0152142.

[16] 赵 楠, 孙保存, 赵秀兰, 等. 缺氧诱导肿瘤细胞BCL-2表达促进LPPCN样细胞核凝集的形成[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(11):1258-1262.