2021年DNA提取及PCR扩增实验报告

刘琳 1131428 环境科学

一、 试验目

1．学习并掌握PCR扩增基础原理与试验技术。

2．对扩增后DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验, 并分析对应结果。 二、 试验原理 1. PCR扩增

多聚酶链反应（PCR）技术原理类似于DNA天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液, 加入微量模板DNA、 四种脱氧核苷酸（dNTP）、 耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物, 以后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性, 双链解链, 这是所谓变性阶段。降低溶液温度, 使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链, 这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃）, 在Tap酶作用下, 用四种dNTP为原料, 引物为复制起点, 模板DNA一条双链在解链和退火以后延伸为两条双链, 这是延伸阶段。如此反复, 在同一反应体系中可反复高温变性、 低温退火和DNA合成这一循环, 使产物DNA反复合成, 并在反复过程中, 前一循环产物DNA可作为后一循环模板DNA而参与DNA合成, 使产物DNA量按指数方法扩增。经过30～40个循环, DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳试验

DNA分子在高于其等电点溶液中带负电, 在电场中向阳极移动。在一定电场强度下, DNA分子迁移速度取决于分子筛效应, 即分子本身大小和构型是关键影响原因。DNA分子迁移速度与其相对分子量成反比。不一样构型DNA分子迁移速度不一样。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物, 利用DNA分子在泳动时电荷效应和分子筛效应, 达成分离混合物目。 三、 试验材料

仪器: PCR扩增仪、 0.2ul薄壁管、 1.5ml离心管、 移液枪、 枪头、 微波炉、 电泳仪、 水平电泳槽、 制胶版、 紫外透射仪。

试剂: TapDNA聚合酶、 dNTP、 buffer、 两种引物、 16S全长DNA样本、 无菌ddH2O、 模板DNA 、 TBE、 琼脂糖、 EB、 显色剂。 四、 试验步骤 1. PCR扩增

此次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。

1.1 依据计算, 首先取1.5ml离心管根据2.5ul 10×Buffer 、 1 ul dNTP、 0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、 0.125 ul Taq、 19.375u ddH2O百分比配置足量PCR反应体系。 1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul反应体系, 并分别添加8种不一样模版, 并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。

1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中, 根据预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达成30~40次。程序以下:

预变性: 94℃ 3min 循环: 94℃ 变性30s 55℃ 退火30s 72℃ 延伸30s

末次延伸: 72℃ 5min

1.4 PCR扩增完成后, 将样品取出并保留于15℃环境中。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳试验

2.1称取0.2g琼脂糖粉末, 放到一锥形瓶中, 加入适量0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化, 溶液透明。摇匀, 待冷却至60℃左右, 在胶液内加入适量EB。

2.2 取有机玻璃制胶板槽, 在一端插好梳子, 在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右胶液, 使之形成均匀水平胶面。

2.3 待胶凝固后, 小心拔起梳子, 使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

2.4 在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液, 至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后, 用移液枪滴加至凝胶加样孔中。

2.5 接通电泳仪和电泳槽, 并接通电源, 调整稳压输出, 电压最高不超出5V/cm, 开始电泳。点样端放阴极端。依据经验调整电压使分带清楚。

2.6 观察溴酚兰带（蓝色）移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处, 可停止电泳。

2.7 在紫外透视仪样品台上重新铺上一张保鲜膜, 赶去气泡平铺, 然后把凝胶放在上面。关上样品室外门, 打开紫外灯, 经过观察孔进行观察。 五、 试验结果与讨论

如图所表示: 从左至右, 分别是模版1-8号, 第9列为阴性对照。

前8列都有显著条带出现, 而阴性对照无显示, 说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线, 上面一条线所覆盖条带基础能够代表扩增产生片段位置, 参考图能够看出扩增片段在200bp左右。在第9个阴性对照第二条线处能够看到较为模糊条带, 并非是出现假阴性, 而是因为二聚物而产生条带。经过该条带与最右侧marker对比可知该片段出现在100bp左右, 并非因为试验操作等问题而产生污染。

试验照片显示试验结果有拖尾现象, 不过并不影响后续试验。在试验过程中因为有些试剂加到了管壁上面, 并没有完全加入, 可能会出现部分误差。另外在第1列条带中出现了其她亮带,

可能是因为在前期扩增试验中滴加试剂时因为量过少而进行摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增, 也有可能是因为胶板制作过程中梳子位置不适宜或者胶板制作时边缘处不够均匀造成产生污染。但总体而言, 试验结果较为满意。 六、 试验注意事项

1.因为PCR技术非常敏感, 可使一个DNA分子得以扩增, 装有PCR试剂离心管打开之前, 应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR扩增反应条件, 要控制好温度、 时间和循环次数。

2.最好在加完全部其它反应成份后才加模板DNA。 3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。

4.EB含有致癌作用, 配制及使用时应带一次性手套。并在专门试验室内使用。 七、 试验收获

1.经过此次试验学习并掌握了PCR反应基础原理、 试验过程及技术。 2.经过此次试验掌握了电泳试验分离DNA原理和方法。

八、 思索题

1、 假如你研究中要扩增大肠杆菌某个酶基因, 你怎样进行相关试验？

经过PCR扩增出想要片段, 然后经过凝胶电泳试验进行回收, 并与适宜载体连接, 转化进感受态细胞。经过培养提取质粒, 进行酶切或PCR验证, 测序最终验证, 保留菌种 2.一对引物序列为5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’和

5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA请计算它们Tm值及选择适宜退火温度, 假如按你算退火温度做PCR时没有得到对应产物, 你怎么处理？

5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’ Tm值=4（G+C）+2(A+T)-(5～10℃) =4（3+7）+2（6+4）-(5～10℃) =60℃-(5～10℃) =50~55℃

5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA’

Tm值=4（G+C）+2(A+T) -(5～10℃) =4(5+7)+2(6+2) -(5～10℃) =64℃-(5～10℃)=54~59℃

所以退火温度能够选择在55℃

能够经过分析多个逐步提升退火温度反应以提升特异性。开始低于估算Tm5℃, 以2℃为增量, 逐步提升退火温度。较高退火温度会降低引物二聚体和非特异性产物形成。为取得最好结果, 两个引物应含有近似Tm值。引物对Tm差异假如超出5℃, 就会令引物在循环中使用较低退火温度而表现出显著错误起始。假如两个引物Tm不一样, 将退火温度设定为比最低Tm低5℃ 或者为了提升特异性, 能够在依据较高Tm设计退火温度优异行5个循环, 然后在依据较低Tm设计退火温度进行剩下循环。这使得在较为严紧条件下能够取得目模板部分拷贝。