基因型鉴定

1. 剪取2mm趾甲或尾端放入离心管中。

2. 裂解鼠尾

a. 鼠尾裂解法：每个样品中加入200μl 鼠尾裂解液 + 5μl 蛋白酶， 56 ℃过夜，实验

前98 ℃金属浴10 min，立即放入冰盒中冷却。（鼠尾裂解液：0.5％ SDS、0.1M NaCl、0.05M EDTA、0.01M Tris.C1(pH8.0)）

b. 强碱裂解法：向样品中加入100μl 50mM NaOH，96 ℃金属浴10 min，在金属浴中

冷却至40℃左右（增加裂解效率），然后自然冷却至室温；向裂解液中加入20μl 1M Tris (PH 8.0) 5 mM EDTA后涡旋5sec，中和强碱。

3. WT和KO鼠 PCR体系（20μl）

Mix 10 μl（使用Easy Tap PCR mix） R/FPrimer 各0.4 μl Sample 2μl ddHO27.2μl

注备：由于分样时损失，先配制2n+2管量的（Mix+ddHO2），均匀分为两份，分别加入n+1的R和F引物，在分配到8连管中（17.9μl/孔），然后加入样品。

或使用10μl反应体系，各种试剂使用量减半。

4. PCR反应程序

Syt 7（Public – SYT7）：

Sty1 （Sty1—genotyping）

变性：94 ℃ 2 min

变性：95 ℃ 3 min

变性：94 ℃ 30 sec

变性：95 ℃ 30 sec

退火：60 ℃40 sec 30循环 退火：55 ℃ 30 sec 28个循环 延伸：72 ℃35 sec

延伸：72 ℃ 35 sec

72 ℃ 10 min

延伸：72 ℃ 4min

5. 跑胶鉴定

向TBST中加入1%琼脂糖，混匀后，在微波炉中加热约2 min。（大板需要配胶60ml，小板25ml）。冷却后，加入EB（按1：10万加），混匀后倒胶，室温下冷却后，放入电泳槽中，点样，10μl/孔。打开电泳仪电源，接好电极（红对红，黑对黑），电压设置约165V，跑胶15分钟左右。在凝胶仪中照胶，鉴定基因型。