人降钙素原的原核表达及其单克隆抗体的制备

刘卿;汪慧;卢叶;吴亮;陈盛霞;姜旭淦

【摘 要】目的:原核表达人降钙素原(procalcitonin,PCT)重组蛋白,制备高纯度的PCT单克隆抗体.方法:将构建的PCT-pET22b表达载体转入大肠埃希菌BL21中诱导表达PCT蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化,用蛋白质印迹法和胶体金法对其进行鉴定.获得的PCT重组蛋白采用长程免疫法皮下多点注射Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选阳性杂交瘤细胞株并进行亚克隆4次.将细胞株注入小鼠腹腔收集腹腔积液获得单克隆抗体,经辛酸硫酸铵法和Protein G亲和层析法进行纯化.结果:SDS-PAGE电泳结果显示在相对分子质量约14 kDa处有一明显条带,与目的蛋白大小相符.蛋白质印迹法和胶体金法证明该可溶性蛋白为PCT.采用细胞融合技术成功筛选出7株阳性杂交瘤细胞,将其命名为

B3,C4,C7,E9,F8,F10,G2.选B3和C4细胞株通过体内诱生法制备单克隆抗体,经纯化后纯度可达95％ 以上.间接ELISA法检测B3、C4抗体效价均可达107,亲和常数分别为5.06×108,7.3×108.结论:获得高纯度的PCT重组蛋白及其单克隆抗体,为PCT检测试剂盒的进一步研究提供了支持. 【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》 【年(卷),期】2019(029)003 【总页数】6页(P242-247)

【关键词】降钙素原;细胞融合;单克隆抗体 【作 者】刘卿;汪慧;卢叶;吴亮;陈盛霞;姜旭淦

【作者单位】江苏大学医学院,江苏 镇江 212013;江苏大学医学院,江苏 镇江 212013;江苏大学医学院,江苏 镇江 212013;江苏大学医学院,江苏 镇江 212013;江苏大学医学院,江苏 镇江 212013;江苏大学医学院,江苏 镇江 212013 【正文语种】中 文 【中图分类】R392-33

降钙素原（procalcitonin，PCT）是降钙素的前体物质，是由116个氨基酸组成的可溶性蛋白质，相对分子质量约为14 kDa，主要在甲状腺滤泡旁C细胞内合成[1]。自1993 年法国学者Assicot等[2]首次在脓毒症患者血清中发现以来，大量研究表明PCT在严重细菌、真菌、寄生虫感染时显著升高，而在局部感染，非细菌感染（病毒感染、自身免疫性疾病、过敏及器官移植）病程中不升高或仅轻度升高[3-4]。

脂多糖为刺激PCT产生的最主要因素，当机体受到内毒素刺激后2 h即可于外周血中检出PCT，生成速度非常快，半衰期约为25～30 h。PCT在外周血中非常稳定，是理想的细菌性炎症标志物，有助于临床对感染性疾病病原学病因的早期诊断[5]。

目前临床及基础研究中关于外周血PCT的检测试剂盒均基于免疫学技术[6-7]，包括放射免疫分析、胶体金免疫技术、免疫化学发光法、ELISA法等，均需要制备特异性的抗原及相应抗体。目前PCT检测所需的原料和试剂大部分被国外企业垄断，检测成本高，价格昂贵，因此PCT未能作为临床常规筛查项目，限制了其在感染性疾病中的应用。所以研发特异性的抗原和抗体，建立PCT的快速检测方法，具有很好的应用价值。本研究通过原核表达PCT重组蛋白，并制备相应的单克隆抗体，为进一步开发PCT检测试剂盒提供帮助。

1 材料与方法 1.1 动物和细胞株

6～8周龄、雌性Balb/c小鼠购自江苏大学动物中心；骨髓瘤细胞（SP2/0）由本实验室保存；PCT-pET22b重组载体由本实验室构建并保存。 1.2 主要试剂和仪器

蛋白标准参照物（Thermo公司）；镍柱颗粒（南京金斯瑞公司）；RPMI-1640培养基（上海源培公司）；胎牛血清（Gibco 公司）；HT、HAT、聚乙二醇、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（Sigma公司）；蛋白G琼脂糖凝胶（康为公司）；C5612超声粉碎仪（宁波新芝公司）；FCQ凝胶成像仪及垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 PCT重组蛋白的表达、纯化与鉴定

本课题组前期已成功构建PCT-pET22b重组表达载体，将其转入大肠埃希菌BL21中，在25℃、150 r/min、IPTG终浓度0.5 mmol/L条件下诱导表达10 h[8]。12 000 r/min 离心10 min，弃上清液留沉淀，用PBS重悬后进行超声裂菌，破碎完全后收集上清液。将蛋白上清液与镍柱颗粒混合，4℃振荡结合2 h，依次用10、40、250 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，流速控制在1 mL/min，收集不同条件下的洗脱液，SDS-PAGE电泳分析蛋白条带，蛋白质印迹法和胶体金法对其进行鉴定。

1.4 杂交瘤细胞的制备

1.4.1 动物免疫 首次免疫：将等量PCT蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，皮下多点注射Balb/c小鼠，每只小鼠注射的蛋白量为30 μg；首次免疫后每间隔2周，用等量不完全弗氏佐剂与PCT蛋白充分乳化免疫小鼠，30 μg/只。4次免疫后取小鼠血清用ELISA法检测抗体效价。融合实验前3天，腹腔注射30 μg不含佐剂的蛋白溶液用于加强免疫。

1.4.2 制备饲养细胞 拉颈脱臼法将Balb/c小鼠致死，置于75%乙醇中浸泡5 min。在超净台内将小鼠腹部朝上固定于解剖台上，用无菌剪刀依次剪开皮肤、腹膜层，吸取5 mL 1640基础培养液至腹腔内，轻轻吹吸收集腹腔巨噬细胞，反复3次。将培养液收集到50 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。用含20%胎牛血清的完全培养液重悬细胞沉淀，调整细胞密度约为2×105/mL，用移液器混匀后加入96孔细胞板，0.1 mL/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，备用。 1.4.3 细胞融合 无菌操作取出小鼠脾脏置于筛网内，用玻璃注射器内芯轻轻研磨脾脏至灰白色，收集脾细胞用牛鲍计数板计数。将脾细胞和SP2/0细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50 mL离心管内，1 000 r/min离心8 min，弃净上清液。在37℃水浴条件下于1 min内加入1 mL PEG 1500促进细胞融合，补加30 mL不完全培养液以终止聚乙二醇反应。离心后取适量HAT培养液重悬细胞沉淀，加入铺有饲养细胞的96孔细胞板内，当细胞长到孔底1/10左右时，用间接ELISA法筛选阳性细胞孔，有限稀释法进行亚克隆4次[9-10]。 1.5 小鼠体内诱生法制备PCT单克隆抗体

预先对8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射不完全佐剂，300 μL/只。3 d后腹腔注射单克隆细胞株，500 μL/只（细胞数量约1 ×106）。7 ～10 d 后可见小鼠腹部明显肿胀，用1 mL注射器沿腹中线两侧刺入抽取小鼠腹腔积液，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，置于-20℃冰箱保存。 1.6 单克隆抗体的纯化

1.6.1 辛酸硫酸铵法粗提抗体 1份小鼠腹腔积液与2份醋酸钠溶液混合，加入正辛酸（33 μL/mL）沉淀腹腔积液中非Ig蛋白，12 000 r/min离心30 min，收集上清液。冰浴下于30 min内加入饱和硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达45%，4℃静置1 h以上，使腹腔积液中的抗体完全沉淀。离心后去上清液，用适量PBS重悬沉淀得到粗纯抗体。

1.6.2 Protein G亲和层析法纯化 将平衡液稀释后的粗提抗体上柱，流速控制在0.5 mL/min，收集洗脱液反复上样3次增加抗体与层析柱的结合。用平衡缓冲液再洗5～10倍柱体积减少杂蛋白的残留。最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，将洗脱液收集到EP管内备用。

1.7 单克隆抗体纯度、效价、亲和力分析

1.7.1 纯度 取纯化后的抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪分析抗体的纯度。

1.7.2 间接ELISA法测定单克隆抗体的效价 用包被缓冲液将PCT蛋白稀释至1 μg/mL，加入96孔酶标板内，0.1 mL/孔；将纯化后的两株抗体B3、C4分别稀释成相同的浓度，用抗体稀释液依次进行梯度稀释103，104，105……，PBS 作为空白对照，未免疫前鼠血清（稀释1 000倍）作为阴性对照，HRP-羊抗鼠（1∶5 000稀释）作为二抗依次进行孵育，加入显色液、终止液，用酶标仪测定波长450 nm处光密度（D）值。

1.7.3 间接ELISA法测定单克隆抗体的亲和力用包被缓冲液将PCT蛋白分别稀释为1，0.5，0.25，0.125 μg/mL，加入96 孔酶标板内，0.1 mL/孔。将单克隆抗体B3、C4分别稀释1 000倍，加入酶标孔内依次进行倍比稀释，0.1 mL/孔，余步骤同“1.7.2”。按下列公式计算抗体的亲和常数（K）[11]：度；n ＝Ag/Ag′。

Ab—包被高浓度抗原（Ag）时，D（450 nm）值达最大值一半时的抗体浓度；Ab′—包被低浓度抗原（Ag′）时，D（450 nm）值达最大值一半时的抗体浓 2 结果

2.1 PCT重组蛋白的表达、纯化与鉴定

重组表达菌株BL21经诱导表达后，经超声破碎仪裂菌，取上清液和沉淀分别进行15%SDSPAGE电泳。结果显示，在相对分子质量约14 kDa处有一明显的条带，

与PCT蛋白大小相符，且主要存在于上清液中，说明该目的蛋白为可溶性蛋白（图1）。将收集的上清液经Ni-NTA亲和层析法纯化，目的蛋白的纯度可达90%以上（图2），达到了动物免疫的要求。蛋白质印迹结果显示，14 kDa处的条带可与抗组氨酸标签结合，符合PCT蛋白的相对分子质量大小（图3A）；胶体金法结果阳性表明该纯化后的蛋白为PCT且标记的组氨酸标签不影响蛋白性质（图3B）。

图1 重组菌株诱导表达产物分析M：蛋白质分子量标准；1：裂菌后沉淀；2：裂菌后上清液

2.2 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆

4次免疫结束后，间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价达1∶102 400 0，满足细胞融合条件。SP2/0细胞和脾细胞融合3 d后，及时于倒置显微镜下观察细胞的生长情况，融合细胞形态较大且成簇生长，见图4。间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，选择效价高且细胞生长状态良好的孔通过有限稀释法进行细胞亚克隆4次，最终获得了7株能稳定生长、分泌抗体阳性的杂交瘤细胞（B3，C4，C7，E9，F8，F10，G2）。选B3、C4 细胞株继续培养，其余冻存于液氮罐内。 图2 Ni-NTA亲和层析法纯化结果M：蛋白质分子量标准；1：洗脱液；2：40 mmol/L洗涤缓冲液；3：10 mmol/L 洗涤缓冲液

图3 蛋白质印迹法和胶体金法鉴定A：蛋白质印迹；B：胶体金法；1：BSA；2：纯化后PCT

图4 细胞融合前后（倒置显微镜×10） 2.3 单克隆抗体性质的初步测定

2.3.1 纯度鉴定 分别将B3、C4两株细胞（约1×106）注入小鼠腹腔诱导产生单抗型腹腔积液，7～10 d后收集腹腔积液进行辛酸硫酸铵法和Protein G法纯化，15%SDS-PAGE电泳图谱发现在约25 kDa和55 kDa处各有一条明显的条带（图

5），为免疫球蛋白的轻链和重链，符合IgG的相对分子质量大小，纯度达95%以上。

图5 单克隆抗体的纯度鉴定M：蛋白质分子量标准

2.3.2 抗体效价测定 用PCT蛋白包被96孔酶标板，设置空白对照和阴性对照，将抗体依次进行梯度稀释103，104，105……，以大于阴性值2.1倍的稀释倍数作为抗体效价。如图6所示，纯化后的单克隆抗体效价均可达107，表明制备的两株单克隆抗体具有较高的生物学活性。 图6 纯化后两种单克隆抗体效价测定

2.3.3 抗体亲和力测定 间接ELISA法测定结果表明，单克隆抗体B3、C4识别PCT抗原的亲和常数分别为5.06 ×108，7.3 ×108。见图7。 3 讨论

血培养是诊断细菌性感染病因的金标准，能分离鉴定致病菌并进一步进行药敏试验，但因耗时长而不能用于疾病的早期诊断[12]。PCT的发现及临床应用不仅缩短了检测时间，而且在严重细菌、真菌、寄生虫感染等方面有较高的灵敏度和特异性。2001年国际脓毒症会议[13]已将PCT作为诊断脓毒症的有效指标之一，相比单纯的临床诊断模式正确率从0.77提高到了0.94。此外根据外周血中PCT的含量变化还可评估疾病的严重程度、预后及指导抗生素的应用等，有助于实行个体化治疗[14-15]。杨辉等[16]研究发现PCT还可用于鉴别血液革兰阳性菌（G＋）与革兰阴性菌（G-）感染，G-患者血清中的PCT水平明显高于G＋患者（P＜0.05），G-的敏感性和特异性分别为93.13%，78.73%，G＋分别为88.37%，65.92%，与之前的研究相一致[17]。所以PCT在早期感染性疾病的鉴别诊断中具有较好的应用价值。

图7 纯化后单克隆抗体亲和力测定

Ni-NTA亲和层析法利用过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸形成配位相互作用，

从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，达到分离纯化的目的。本研究前期选用pET-22b（＋）原核表达载体，其N端设计有6个组氨酸标签（His标签），因其相对分子质量小，不会影响目的蛋白的性质。本研究发现将PCT蛋白与镍柱颗粒在4℃振摇结合2 h，比直接上柱明显减少了目的蛋白的损失；用低浓度咪唑溶液稀释样本可减少非特异性蛋白质的吸附，提高目的蛋白的纯度。对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果显示在相对分子质量为14 kDa处有一明显的条带，经鉴定为PCT蛋白，纯度较高，满足动物免疫的要求。

本研究采用纯化后的PCT重组蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠，有利于得到高效价抗体，提高细胞融合成功率。在细胞融合过程中，未融合细胞在3～5 d开始大量死亡，单个或少数分散的融合细胞在不稳定的环境中难以存活，需加入一定量的饲养细胞如腹腔巨噬细胞来促进细胞增殖。该饲养细胞可释放多种非特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件，也可满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。融合过程中细胞应置于37℃水浴条件下，选择合适相对分子质量和浓度的聚乙二醇融合剂（相对分子质量1 000～2 000，浓度40% ～50%），并且要控制好聚乙二醇的滴加速度，防止时间过短细胞未充分融合或时间过长对细胞造成不可逆损伤。由于刚融合成功的细胞较脆弱，所以操作过程中要减少外在机械力对细胞的损伤。当细胞长至管底1/10左右时要及时检测并进行亚克隆，防止细胞增殖过程中染色体丢失、抗体转阴的发生。本研究对纯化后的单克隆抗体进行了生物学特性鉴定，间接ELISA法检测抗体B3、C4效价均可达107，亲和常数分别为5.06 ×108，7.3 ×108。

PCT在炎症性疾病中的应用越来越受到重视，能反映全身炎症反应的预后情况，是短期内（28 d）预测生存的独立危险因子[18]。目前PCT的检测方法均由Brahms发光免疫分析发展而来，没有统一的标准且不同介质标本的检测结果受标本类型的影响，使其参考范围存在一定差异，造成各检测方法之间不能进行有效的

比较、评估。本研究结果为发展PCT检测试剂盒提供了基础材料支持，使PCT国产化试剂的临床研究有了新的选择。 [参考文献]

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