将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液
用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；
将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；
将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。 二、实验过程： 1.蛋白质粗提液制备
溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液
（1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳； 磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L；
（2）250mL 2.蛋白质浓度测定 （1）溶液配制
1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中； 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。
（2）0~100ug/mL标准曲线测定：
取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL 蛋白质浓度0 20 40 60 80 100 µg/ml
1mg/mL BSA溶0 液（µl） 蒸馏水（µl） 总体积（µl）
2000 2000
40 1960 2000
80 1920 2000
120 1880 2000
160 1840 2000
200 1800 2000
测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。 以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。
（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。
3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离
（1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。
（2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。
1
（3）平衡：用10倍于柱床体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的离子环境和样品中的一致。
（4）上样：柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋白粗提液（留过20uL供电泳用）缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来
（5）收集：打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液（注意不能把凝胶冲起来）使样品继续流出，分部收集流出物，第一管收集1mL，以后每管收集200uL，共收集6管。
（6）稀释20倍，测定每个组分的蛋白浓度，可只测定一个OD595值，计算各组分的蛋白浓度。 4.SDS—PAGE 溶液配制：
100ml 30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml蒸馏水中，定容至100ml，避光保存。（该溶液有神经毒性，避免接触皮肤）； 100mL 1.5M Tris-HCl 三（羟甲基）氨基甲烷，pH8.8：18.15gTris 碱溶于60mL蒸馏水中，用HCl调pH至8.8，定容至100ml蒸馏水中；
100ml 0.5M Tris-HCl（缓冲液）,pH6.8：6gTris 碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl
调pH值至6.8，定容至100ml蒸馏水中； 10ml上样缓冲液：0.5ml ddH2O（重蒸水，经过两次蒸馏的水） + 2.5ml of 0.5M
Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油 + 4ml 10% SDS（十二烷基硫酸钠）+77.1mg DTT（二硫苏糖醇）+1ml 0.05（W/V）溴酚蓝； 600ml 5×电泳缓冲液（？）：9g Tris碱+43.2g甘氨酸+3gSDS，蒸馏水溶解定容至600ml；
1ml 10%过硫酸铵溶液（现用现配）：0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水中。 1000ml固定液：取908ml 50%的甲醇和92ml冰乙酸混匀；
500ml染色液：0.25g考马斯亮蓝R（G?）250，加500ml固定液溶解，过滤后避光保存；
1000ml脱色液：取75ml冰乙酸和50ml甲醇，加蒸馏水定容至1000ml。 凝胶制备
7.5%分离胶（20ml） 10%SDS 0.2ml ddH2O 11.87ml 10%的AP（过硫酸铵溶液） 0.1ml TEMED（.四甲基乙二胺） 10µl 30% arc/bis 5ml 1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml
4%浓缩胶（10ml） ddH2O 6ml 30% arc/bis 1.3ml 0.5MpH6.8Tris-HCl 2.5ml
2
10%SDS 0.1ml 10%的AP 0.05ml TEMED 5µl
灌胶：将电泳板组装好，先灌分离胶至2/3处，水封，分离胶凝固后，吸去水，
灌入浓缩胶至满，插入梳子，注意不要产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子。 样品准备：
分子量Marker、100µg粗提液、100µg分离组分与样品缓冲液混合（哪种，混合比例），煮沸3min，作为电泳样品上样。 电泳装置安装：安好后在正负极分别加入稀释好的电极缓冲液。 上样：将处理好的样品分别加入样品孔中，记好加样顺序。
电泳：接好电泳仪，通电，先恒压80V电泳，溴酚蓝前沿到达分离胶界面时，加大电压至120V继续电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，结束电泳。 剥胶：拆开电泳装置，取出玻璃板，看清点样方向，从玻璃板的一角撬起，凝
胶留在长板上，在右下角切角作标记，用固定液冲下凝胶。 固定：将凝胶放在大培养皿中，用固定液固定1h； 染色：倒去固定液，加入染色液，染色1h，
脱色：倒去染色液，加入脱色液进行脱色，直至看清条带。 凝胶拍照。 三、实验结果
1、 2、
各组分蛋白浓度 电泳结果
四、 分析讨论
分离效果如何？实验设计如何改进？
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