植物组织MDA含量测定

、目的要求

1掌握植物组织MDA含量测定的原理及具体测量步骤；

2•深化理解MDA与逆境和衰老的关系，理解植物组织 MDA含量测定的意义; 3•了解膜脂过氧化、氧自由基和 MDA形成的关系；

4•能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定 MDA含量； 5•学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。

二、实验原理

植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质 含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。活 性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累， 从而引发或加剧膜脂过氧化作用, 造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛

(Mai on dialdehyde，MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的 损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，

MDA含量是一个常用指标，可通过测定

MDAT解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

MDA在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸(TBA反应，产生红棕色的产物 3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮(Trimet — nine ),又名三甲川，该物质在 532nm处有最

大光吸收，在600nm处有最小光吸收。由于 TBA也可与其它物质反应，并在 532nm处 有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定 利用

600nm下的吸光度,

532nm与600nm下的吸光度的差值计算 MDA勺浓度。

即卩：A；32 — A°0=£・ C • L

式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值, 为比色杯厚度，c =155L - mmOlcm-1

O O

C是MDA浓度，L

H N

100 C°

H S

H

TB

MDA

3,5,5-

三甲基恶唑2,4-二酮

A

需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对 列公式消除由蔗糖引起的误差

MDA-TBA反应有干扰作用。可用下

C (卩 mol -1L =X(A532 — A600)— >A450

、材料与设备

1 •材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。 2•仪器：

(1)分光光度计；(2)冷冻离心机；(3)水浴锅；(4)天平；(5)研钵；(6)剪刀； ⑺5ml刻度离心

管；(9)刻度试管(10ml) ; (10)镊子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml)； (12)冰箱。

3•药品

(1) L磷酸钠缓冲液；⑵5 %三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶 解，然后定容

到100ml； (3) %的TBA溶液：称取硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解， 定容至100ml。 四、实验步骤

1. MDA勺提取：取样品(W，加入2ml预冷的L的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀 浆，转移

到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，最后

用缓冲液定容至5ml。4500rpm, 4度，离心10min,上清液即为MDAg取液，测量提取 液的体积(V)。

2. MDA含量测定：吸2ml (V2)的提取液于刻度试管中(空白为 2ml缓冲液)， 加入3ml %的TBA溶液，将试管放入沸水浴中煮沸10 min (自试管内溶液中出现小气 泡开始计时)。

到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。4500rpm, 4度，离心10min， 取上清液并量其体积(V1)。上清液于532nm 600nm波长下测定吸光度。

3. 结果计算：

MDA(nmo卜 g ) =x (A532 — ASQQ)

1

V1 V V2 W

式中，V1为反应液总量(ml) ； V；为反应液中的提取液数量(ml) ; V为提取液总量

(ml)； W为植物样品重量(g)

五、实验报告？

样品 绿叶 处理 高温处理 重复 A532 A6QQ MDA含量(nmol • g) -11 2 3

平均 标准差 室温对照 1 2 3 平均 标准差 黄叶 高温处理 1 2 3 平均 标准差 室温对照 1 2 3 平均 标准差

六、思考题

1. TBA为什么要溶解在三氯乙酸中

2•提取液与TBA的混合液为什么要加热为什么加热时间又不能过长 3•为什么要测定反应液在600nm下的吸光度

4 •如果可溶性糖含量影响 MDA含量的测定，你有什么办法消除其影响 5.正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。

七、注意事项

1可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm）,当植 物处于干

旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干 扰。

2•低浓度的铁离子能增强MDAf TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应

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补充Fe3+（最终浓度为 nmol • L）。 3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。

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