“中华人民共和国计量法”是1985.9.6由中华人民共和国第二十八号主席令公布的，自1986.7.1起施行。
计量法中有关的条文有：第五条：国务院计量行政部门负责建立各种计量基准器具，作为统一全国量值的最高依据。
第八条：企业、事业单位根据需要，可以建立本单位使用的计量标准器具，其各项最高计量标准器具经有关人民政府计量行政部门主持考核合格后使用。 第二十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门对其计量检定、测试的能力和可靠性考核合格。 计量法实施细则：1987年国家计量局发布的“中华人民共和国计量法实施细则”其中：
第三十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门计量认证。 计量认证：本规范经国家技术监督局于1990年7月20日批准，并自1990年11月1日起施行。
卫生部于1981年发布的《卫生标准管理办法》第一条规定：卫生标准是国家的一项重要的技术法规，是进行预防性和经常性卫生监督的重要依据。 卫生标准可分为：强制性标准和推荐性标准；又分为国家标准、行业标准、地方标准和企业标准。
国家标准以“GB”表示，国家推荐性标准以“GB/T”表示；卫生部发布的卫生行业标准以“WS”表示，推荐性标准表示为“WS /T”。 卫生标准制定状况：建国后最早颁发的卫生标准是在1953年；正式列入国家标准编号的第一个卫生标准是1956年颁发的“工业企业设计暂行” 卫生
标准；到1996年底，我国已有卫生国家标准1200项，到2004年止，与劳动卫生标准配套的标准方法已有249多个；与环境卫生标准配套的居民区大气标准方法已有20多个；与食品卫生标准配套的标准方法，其中理化检验方法已有70多个，微生物学检验方法已有30多项。
我国的卫生标准由“全国卫生标准技术委员会”及其专业委员会负责制定和评审，又国家质量技术监督局和卫生部审批。 中华人民共和国传染病防治法：1989年2月21日第七届全国人民代表大会常务委员会第六次会议通过。
2004年8月28日第十届全国人民代表大会常务委员会第十一次会议修订。 中华人民共和国传染病防治法：共79条 本法自2004年12月1日起施行。
传染性非典性肺炎：（简称为非典性肺炎，AP）是指2002年11月起，我国局部地区发生的、主要以近距离空气飞沫和密切接触传播为主的呼吸道传染
病，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。
世界卫生组织于2003年4月16日，在13个WHO网络会议上宣布一种新的冠状病毒是DNASARS的病毒，从而为SARS防止提供了依据。
第三章
（一）、病毒的概念：
医学分子生物学
病毒是一类体积微小、结构简单、具有严格的寄生于活细胞的微小生物，它们具有下列几种基本特征：
1、病毒的基本结构是由核酸（基因组）与蛋白质组成，由DNA或RNA组成核心，外有一蛋白外壳（核壳），有些病毒在核壳外
面另有一层脂蛋白组成的包膜包围着。
2、病毒只在活细胞中增殖，因为病毒缺乏完整细胞器等必要装置，所以必须依赖宿主细胞提供高分子合成装置和能量。 3、病毒非常微小，无细胞结构，绝大多数不能用光学显微镜检查，而必须用电子显微镜才能察见。
第一节核酸基本知识：一、核酸化学：DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。RNA与DNA差别在核糖2，位带有一个羟基。
DNA ①DNA起储存遗传信息作用，并以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。②由4种核苷酸组成DNA分子，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。
③在动植物、细菌、真菌中都含有DNA，但在病毒中（非细胞型微生物）不一定含DNA。④DNA为长丝状分子互相纠缠（jiuchan）， 其溶液十分粘稠。⑤它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电核，DNA变性后OD值会升高。⑥因DNA 不溶于乙醇，常用二倍量沉淀DNA ⑦在变性温度时，它的粘性突然降低。 ⑧ 淬火是为了保持DNA单链状态。DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动恢复双螺旋结构。
说法错误的：（1）DNA和RNA的化学结构碱基G与C通过2对氢键配对构成DNA分子说法错误的。
（2）与DNA分子相比，RNA分子难水解的看法也不对。（3）许多质粒可在宿主之间进行转移的说法是不对的。（注意）
形状： （1）tRNA二级结构呈三叶草形。（2）在细胞内RNA分子中rRNA占比例最大。（3）DNA二级结构中呈左手双螺旋的是Z构象。 DNA结构、性质：在真菌中网崎片段一般为100～200核苷酸。噬菌体核酸最常见的是双链线状DNA。
反式作用因子具有的DNA识别或DNA结合域，主要有 螺旋/转折/螺旋（T/H/T）,锌指结构，碱性-亮氨酸拉链（bZIP）， 碱性-螺旋/环/螺旋（bH/L/H）。真核生物中的端粒酶是由RNA和蛋白质构成的。一般真核生物染色体上有5种主要的组蛋白， 其中亲和力最强的两种是H3 H4 。
二、DNA的复制和修复：（1）细胞每分裂一次，染色体DNA就合成一次，新DNA是按原DNA分子合成。
（2）DNA分子拆（ca）开成两条链，依每一条单链合成一条新单链，成为半保留复制。 （3）在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。
（4）DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。 （5）在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3，末端的羟基上。 （6）在合成发生错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 （7）在人工合成DNA时，只加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么合成就会停止在缺失的核苷酸位置上。
在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ。DNA三个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。
在大肠菌中DNA复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅲ。该酶的核心聚合酶中，具有3， - 5，外切酶活性的亚基是ε亚基。 在体内染色DNA复制时必须有RNA引物。在哺乳动物细胞中负责合成线粒体DNA是DNA聚合酶r。 RNA酶Tl可特异地作用于嘌呤核苷酸3，端磷酸并切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键。 体内DNA复制与体外PCR不同的是引发酶参与。与体内DNA复制不相关酶是反转录酶。 在细胞内DNA合成正常进行是RecA蛋白，而RecA蛋白不具有蛋白酶活性。 在大肠菌DNA聚合酶Ⅰ klenow片段没有5， - 3，外切酶活性。 DNA修复过程中尿嘧啶 糖基酶系统不包括Sl核酸酶。
在逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。在逆转录酶的最终产物双链DNA的长度较正链RNA稍长。
三、转录：在生物体内，RNA合成过程称为转录。它（RNA）是按照储存在DNA上遗传信息合成。合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 去掉RNA分子5末端的磷酸，不起合成酶功能的作用。在刺激点突变，改变某些基因功能与DNA向RNA转移无直接关系（？）
（1） 大肠菌的RNA聚合酶由5个亚基，其σ亚基有启动子作用。 （2） 利福平作用该酶（聚合酶）β亚基上。
（3） RNA聚合酶Ⅰ主要是转录rRNA（构成核糖体骨架的是rRNA）。 Prt-mRNA内含子的5，- 末端一般是GU。 （4） RNA聚合酶Ⅱ主要是转录hnRNA。在真核基因启动子近侧序列元件中，对转录起点定位起关键作用的是TATA盒。 （5） 放线菌素D能抑制DNA转录。编码核糖体RNA的基因是一种中度重复序列的DNA序列。
，
四、翻译：在合成各种不同RNA中：
（1） tRNA具有搬运氨基酸功能。构成核糖体骨架的是rRNA。 mRNA直接决定蛋白质的结构。
（2） 合成蛋白质需4种核苷酸，排列组成遗传信息，然后转换成20种氨基酸，组成遗传信息称为翻译。 （3） 3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种。 （4） 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。
（5） 在核糖体上，有两个位置上暴露出mRNA（直接决定蛋白质的结构）分子相邻的两个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何一种
氨基酸tRNA（具有搬运功能）与其对应，这说明合成蛋白质结束，并已开始同一种蛋白质分子的合成。
（6） 合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就能自动折叠卷曲成一定的空间形状。
（7） 在原核生物核糖体是由16 SrRNA、23 SrRNA、5 SrRNA 组成，在真核生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。
五、基因表达调空：（1）氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。
（2）在基因5，上游基因内或其3，下游序列中存在，能提高同一条DNA链上靶基因转录速率的遗传控制元件是增强子。 （3）乳糖操纵子中结构基因是LacA、LacY、LacZ。
六、遗传重组：转座子的功能有（1）促进染色体重排，（2）促进基因重复，（3）促进基因扩增，（4）造成缺失突变。
在大肠遗传重组中，同源重组需RecA蛋白质。
第二节实验技术：一、核酸提取、纯化、浓缩
1用煮沸法从表达内切酶A的大肠菌小量制备质粒时不能省略酚-氯仿抽提。2用煮沸法制备质粒所用溶菌酶液是用TrisCL配制的。 ○○
3用乙醇沉淀溶于SDS中RNA时，要避免用乙酸钾。○4小量制备DNA时不被限制酶切开，应用酚-氯仿抽提。 ○
5用异丙醇沉淀核酸与用乙醇相比，最明显优点是可减少溶液体积。 ○
1、质粒DNA提取：在用碱裂解法少量提取质粒DNA时，在缓冲液（Ⅰ液）中不含SDS。多数质粒在自然状态下是环状链DNA。
质粒DNA纯化方法有：○1离子交换层析；○2聚乙二醇分级沉淀；○3二凝胶过滤层析；○4氯化铯（se）- 溴化乙锭梯度平衡离心。 质粒具备有复制起点、抗生素抗性基因、有多种限制酶的单一切点、有较高的拷贝数。
2、NA凝胶电泳：要使大于2Kb的DNA片段在凝胶电泳中分辨率达最大，其电压不应超过5V/cm。
在电泳中不同构象DNA泳动率通常是：超螺旋＞线性＞切口环状。
二、PCR扩增技术：PCR反应中变性、延伸温度通常是：95℃、72℃。引物的Tm值估算每个A或T加2℃。
在PCR反应中每一种dNTP的浓度通常是200umol/L，在PCR反应中经n次循环后理论上，DNA链的扩增数目是2n倍。 在PCR反应中引物只与靶序列的相应部分结合的说法是错误的。
再此（PCR扩增技术）反应中矿物油不是必需的，用于扩增未知序列的PCR是反向PCR。
不对称PCR法专用于制备单链DNA的扩增。
在PCR反应DNA碱基错配率较高，原因是TaqDNA聚合酶缺乏3， - 5，外切酶活性。 PCR反应中的引物是DNA。反应体系中Taq酶过多及引物过多都可引起非靶序列扩增。 三、寡核苷酸探针合成、放射标记、杂交
标记合成寡核苷酸时dNTP的浓度不应低于1umol/L。 探针是一段带标记的单链DNA，双链DNA，cDNA，单链RNA。 杂交液的成分与杂交温度间的关系正确的是甲酰胺42℃，水68℃。 标记探针的最有效简单方法是体外转录法。
标记双链DNA的3，端时，常用T4噬菌体DNA聚合酶，而不是大肠菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段，主要是因为3，- 5，外切酶活性高。 Western blotting所用探针一般是Ab。Southen blotting一般是用于DNA分子的杂交技术。 在核酸分子杂交技术基础之上又发展了一系列检测DNA和RNA的技术， 如Southen blotting、Western blotting、Dot blotting和菌落杂交。
大肠菌的DNA聚合酶Ⅰ用在切口平移法标记DNA。在20℃～25℃下探针与靶序列退火速率最大，比解链温度低情况下进行杂交。 将外源性质粒导入细菌中称为转化。外源性重组质粒与感受态细菌混在一起，一般在42℃作短暂的热刺激。cDNA基因克隆以mRNA为模板。
四、基因克隆载体：柯(ke)斯质粒载体具有噬菌体特性，能通过溶菌周期，形成子代噬菌体颗粒的说法是不对的。 五、DNA序列测定：与Sanger双脱氧链终止DNA测序法相比，Maxam-Gilbert法所测序列为原DNA分子，这是其特点。 六、克隆子DNA定点诱变：Mu噬菌体DNA转座成分不含末端反向重复序列。
改变蛋白质密码序列的个别密码子最好采用寡核苷酸介导诱变。
七、研究DNA与蛋白质的方法：（1）凝胶阻滞试验（2）DhAsel足迹试验、（3）甲基化干扰试验、（4）体内足迹试验都是研究DNA与蛋白质作用的方法。
第四章 免疫血清学知识
第一节：血清学：一、基础知识：
1、Ag-Ab反应结合力： 有4种力致使Ag-Ab结合，其中一以静电引力为最重要。
2、Ag-Ab反应特点（1）特异性、（2）阶段性（两个阶段）、（3）可逆性、（5）比例性（Ag与Ab结合比例以3：2为最佳）（Ag=3，Ab=2）。 3、影响Ag-Ab反应的因素：（1）温度（多数情况下反应适宜温度为37℃）、（2）PH值（一般反应适宜PH值6～8）、 （3）电解质（多用0.85%盐水）。
当温度升高反应加快，电解质浓度加大时反应敏感性升高，无电解质时Ag与Ab基本上不反应。 参加反应的Ag也有影响，Ag浓度超出适宜量使反应的敏感性下降，过量的Ab会使反应出现前滞现象。 （4）血清交叉反应：出现血清交叉反应是说明有共同抗原存在。
二、血清检验技术：
1、血清凝集反应：采用颗粒状Ag（死菌或活菌，多用死菌）进行的血清反应。
①玻片凝集是其中一种，有许多优点，最重要的优点是报告结果快，多用于快速诊断。
②试管凝集是最多用的一种方法，从温箱中放24小时后取出反应管在室温放2个少时再判定为宜，判定凝集滴度以凝集程度为（+ + ）而定。
③协同凝集用SPA（葡萄球菌A蛋白）与IgG的Fc结合后进行的凝集反应。SPA与IgG结合具有种属性，（容）易与兔血清中的IgG结合。用此试验主要查Ag。
2、抗球蛋白试验：是用检查不完全Ab（半Ab），在试验中所用第二Ab是双价抗体。基本方法是以试管凝集试验为基础。
3、沉淀反应：其中包括①环状反应、②絮状反应、③琼脂扩散反应等。沉淀反应是用可溶性Ag。Ag-Ab沉淀反应用的电泳是琼脂电泳和对流电泳。
环状沉淀反应的沉淀环是在Ag与Ab两液面交界处形成，判定时间是3～7分钟（环状沉淀反应）。
用琼脂扩散反应做Ag分析时，其反应温度在4℃～6℃下进行为宜，一般是72小时后判定结果。（琼脂扩散反应） 用其进行诊断时多在18℃～22℃下进行，琼脂浓度多在1%～2%。
4、电泳： 用电泳做诊断多为琼脂电泳和对流电泳。这类电泳反应本质属于Ag-Ab沉淀反应。
5、CFT（补体）： 参与CFT有两个反应系统 5种成分参加 。其中补体（CFT用的补体是豚tun鼠血清中补体）是此反应的纽带。
它（CFT）与两个系统的结合是非特异性的。在CFT中用豚鼠血清中补体，常用灭活温度是56℃ 30分钟，不同动物的血清补体灭活温度是不同的。
CFT又分为①温CFT、②冷CFT。
温CFT：是指反应温度37℃ 30分钟，主要是查IgG类Ab。反应管出现不溶血现象是阳性反应。补体是多为1：15-1：20稀释度。 冷CFT：是在4℃～6℃（琼脂扩散反应做Ag分析时温度也是4℃～6℃）进行此反应多用于查Ag。 此外，补体（CFT）还参与溶血反应和溶菌反应。
第二节免疫学基础：
一、 抗原（Ag）：Ag是指能够刺激机体产生免疫应答（产生Ab、细胞免疫等）物质。
完全Ag是指既有免疫原性又有反应原性的物质，而只有反应原性无免疫原性的物质称为半抗原。
决定Ag特异性的最小化学亚单位称为决定基（蔟cu），又称为表位。依其与胸腺的关系又分Ti抗原和TD抗原。 Ti抗原刺激机体产生IgM抗体，TD抗原产生需有T细胞辅助。
蛋白质是抗原性最强的物质，其次是多糖、核酸、类脂是抗原性最弱物质。
人类血型抗原有A和B抗原，它们（A抗原和B抗原）刺激机体产生抗A和抗B抗体。
人类血型抗原是同种异型抗原（同一种属不同个体间的遗传标记不同）。器官移植所产生的排异反应。也是因同种异型抗原所致。 佐剂在免疫中常常采用，它主要的机制是增强机体对Ag的免疫应答。
二、 抗体（Ab）：Ag物质刺激机体产生Ab，Ab本质是Ig（免疫球蛋白）。Ig（免疫球蛋白）分为五大类：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。 Ig（免疫球蛋白）的基本结构是：四条肽链（2条轻链-L链，2条重链-H链），由二硫键连接。
L链（轻链）：可分为 可变部分（V）和恒定部分（C），即 V（可变部分）L（轻链）+ C（恒定部分）L（轻链）即VL + CL。 H链（重链）：也分可变部分（V）和恒定部分（C），即VH + CH，但CH（恒定部分、重链）部分又分为CH1、CH2、CH3。
IgM和IgE还有CH4部分。CH1与CH2区 之间为绞链区。
如果用木瓜酶水解后，将IgG水解2Fab和Fc。Fab是Ig与Ag结合部位，Fc是可结晶部分。 用胃蛋白酶水解IgG，可分为F(ab,)2和Fc部分，F(ab,)2是2个Fab连在一起的部分。
Ig（免疫球蛋白）的分类是根据H链（重链）结构特点，主要依Fc部分（CH）。Ig同种型是指H链所具有的特性。
Ig（免疫球蛋白）分型是依据L链（轻链）结构特点，可分为κ和λ型。Ig的Fc段部分可与某些细胞的Fc受体结合，如巨噬细胞。 F(ab,)2部分是与Ag结合部 ，VH （重链）+ VL（V可变部分L轻链）是F(ab,)2中的高变区，直接与Ag能结合的部位。 人类5种Ig（免疫球蛋白）各具特色：IgG-血清中含量最高；IgM-分子量最大；
IgG：①在血清中含量最高；②它还是唯一能通过人类胎盘的；③IgG是抗感染的主要Ig(IgG抗病毒抗体)；○4结合补体；
5起到条理作用；○6结合SPA（葡萄球菌A蛋白）；○7起到沉淀反应；○8中和反应；○9溶解细菌。 ○
10H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体；○11肥达试验IgG类H抗体出现较晚；○12IgG是人血清中的主要抗体○13 IgG是固定补体 ○
IgM、①分子量最大；②早期多为IgM（IgM早期诊断）；③IgM是种属发育过程中最原始的Ig（早期出现抗体的是IgM）；
④IgM有很高的结合价和凝集能力。⑤IgM是动物机体在受到初次抗原刺激后最早产生的一种抗体球蛋白。
6Ti抗原刺激机体产生IgM类抗体。○8肥达试验IgM类抗体出现较早。○9 IgM是感染早期出现的抗体 ○
IgA、①有分泌型存在；②局部Ab；③IgA抗蛋白酶的水解作用。④IgA对大肠杆菌有一定抑制作用；⑤其含量仅次于IgG。
⑥呼吸系统的非特异性防御机制机械物理性防御富含IgA
IgE、①与肥大细胞膜上Fc受体结合（结合肥大细胞）；②是血清中含量最少的一类Ig； IgD。①在血清中含量很少；②因其性质很不稳定、半衰期很短，所以对其了解尚少。
三、 补体（C）：补体是存在于人和动物血清中，即可参加特异免疫又可参与非特异免疫 作用的大分子物质。它有9种成分，11种蛋白组成。 9种成分是：C1（q.r.s）、C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9。它们对温度很敏感，易破坏。 补体系统包括补体及D、P、B等因子组成，约有20种成分。
补体的激活有两个途径：（1）传统途径（第一途径）和旁路（第二途径）。
（1） 传统途径（第一途径）：可被Ag-Ab免疫复合物（IC）活化。活化顺序是：C1、C4、C2、C3、C5 C6 C7 C8 C9。
四、 免疫系统：1、免疫组织器官：（1）中枢：骨髓、胸腺、法氏囊（禽类）； （2）周围器官：脾脏、淋巴结、皮肤免疫系统、黏膜免疫系统。 2、免疫细胞：干细胞系、淋巴细胞系（TH、TC、TS、TDH、BC、浆细胞等）、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞等。
单核细胞及巨噬细胞产生IL-l。3、免疫分子：TCR、BCR、CD、MHC、Ig、补体、细胞因子（IL-l、IL-2）
五、各免疫细胞特点：1、T细胞：是由一群细胞组成。T细胞定位于淋巴结副皮质区。 可分几群，其中TH细胞是很重要的免疫细胞，
CD+4可被PHA、ConA、PWM、花生凝集素刺激活化进行有丝分裂，帮助产生Ab，司管细胞免疫。 TS细胞是抑制细胞，CD+8参加免疫调节。TC是细胞毒细胞。TH是成熟需要胸腺加工处理。
2、B细胞：B淋巴细胞主管体液免疫细胞。表面有抗原抗体受体（SmIg）。B细胞成熟骨髓中（相当于禽类法氏囊）。 未成熟的B细胞最初可查到Ig的u链，活化B细胞可衍（yan）变成浆细胞，浆细胞能产生Ab和分泌Ab。 PWM是可以刺激B细胞有丝分裂。人类外周血中T细胞和B细胞之比为2：1。 3、单核类细胞：无Ag受体，但能处理Ag，加工Ag，并向T细胞递呈Ag。
六、过敏反应（变态反应）：国际公认的过敏反应（变态反应）是四个型：
Ⅰ型（速发型）、Ⅱ型（溶细胞型）、Ⅲ型（免疫复合物或血管炎型）Ⅳ型（迟发型）。
Ⅰ型（速发型）：是由IgE抗体所致，IgE与肥大细胞的IgE的Fc受体结合产生一系列变化，出现Ⅰ型过敏。
如青霉素过敏（皮内注射过敏原），患有慢性寄生虫感染患者。IgE抗体升高显著。
Ⅱ型（溶细胞型）、Ⅲ型（免疫复合物或血管炎型）：过敏系由IgM、IgG抗体及补体等参与介导。
Ⅳ型（迟发型）：过敏反应是由T细胞中TDTH细胞释放淋巴因子所致。如结核菌素过敏试验（皮内注射过敏原）
七、毒素变成类毒素：使毒素的毒力减弱，病理作用减弱，但免疫原性仍保留。
第五章 病毒及立克次体检验
第一节：病毒检验： 一、病毒学总论：
（一）、病毒的特点：病毒属于微生物界，其不同于其他微生物的特性如下：
1、病毒一般只含有一种核酸DNA或RNA，而其它微生物，包括细菌、支原体、衣原体、立克次体，则都同时含有两种核酸。
2、病毒通过基因组复制和表达产生子代病毒的核酸和蛋白质，随后装配完整的病毒粒子。
3、病毒缺乏完整的酶系统，不具备其他生物“产能”所需的遗传信息，因此必须利用宿主细胞的酶类和产能机构，并借助宿主细
胞的生物合成机构复制其核酸以及合成由其核酸编码的蛋白质，乃至直接利用细胞成分。
4、某些RNA病毒的RNA经反转录合成互补DNA（cDNA），与细胞基因组整合，并随细胞DNA复制而增殖，即所谓的DNA前病毒。 5、病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动，因此对于干扰微生物的这些代谢过程而影响微生物结构和功能的抗
生素，具有明显的抵抗力。
一个简单的病毒粒子，实质上只是一团遗传物质（DNA或RNA）和它外围的一层蛋白外壳。这层蛋白外壳就是衣壳， 衣壳和核酸一起总称为核衣壳。病毒不含氨基酸，这是病毒与其他微生物，包括细菌、衣原体、立克次体等又一明显区别。 （二）、病毒的分类和命名：病毒的分类系统采用 目、科、亚科、属和种的等级制度。
属名应是一个以“virus”结尾的单词；亚科“virinae”； 科“viridae”；目“virales” 结尾的单词。 动物病毒“种”的名称大多引用其所引起疾病的名称，后加“病毒”，
兽医学上则常再加上宿主（动物的名称）种类，也有的在病名前再加最初发现该病毒的地名。 毒珠名称至少应能反映该毒珠的分离地点和时间以及该毒珠的类别。 根据其病毒核酸组成还可以将病毒分成DNA病毒和RNA病毒。 RNA病毒可分为（1）正链RNA病毒；（2）负链RNA病毒，
正链RNA病毒可以直接呈现mRNA的作用，同时又是合成互补链的模板； 一般情况下，正链RNA病毒的基因组RNA具有感染性。
负链RNA病毒不能直接呈现mRNA的作用，即不能直接指导合成互补链。
（三）、病毒的增殖：病毒缺乏自身增殖所需的完整酶系统，增殖时必须依靠宿主细胞合成核酸和蛋白质，甚至直接利用宿主细胞的某些成分，这就决
定了病毒在细胞内专性寄生的特性。
病毒的增殖过程大致可以分为：（1）吸附与侵入、（2）脱壳、（3）病毒成分的合成及装配、（4）释放等4个主要阶段。
二、病毒学技术：
（一）病毒的培养：（1）实验动物、（2）鸡胚、（3）体外培养的器官、（4）细胞，这4种都可以作为人工增殖病毒的基本工具。
而大量病毒的，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。
1、组织培养：病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象
以及通过“指示病毒”的干扰等方法加以识别。组织培养用的玻璃器皿要用（硫酸、重铬酸钾）清洗。
常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助生长因子等。 常用的人工综合营养液为：MEM和RPM1640。
1适量血清和谷氨酰胺溶液，○2还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染， 用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入○
3加入碳酸氢钠溶液修正PH，○4根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的PH缓冲能力。 ○
能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，
EDTA使用液又可称之为Versen溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。 动物血清中具有细胞生长所必须的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，且有很强的酸碱缓冲能力。 细胞培养液在细胞培养过程中可分为（1）细胞生长液（2）细胞维持液两种。
细胞生长液：是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；
细胞维持液：用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。 细胞生长适宜的PH范围是 PH 7.2～7.6。细胞培养技术全过程的关键是防止污染。
2、 细胞株的保存是组织培养中一个十分重要的工作，二甲基亚砜是细胞低温保存的良好的保护剂，
含10%二甲基亚砜的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞。
3、 病毒学上常用的细胞类型可分为（1）原代细胞、（2）二倍体细胞、（3）传代细胞，三大类，
原代细胞培养和传代细胞培养的根本区别在于细胞是否能在体外无限传代。
4、细胞的纯化：细胞的纯化可以用细胞克隆技术。
克隆是指用无性繁殖方法产生的一组遗传上相同的细胞和生物群体的过程。
（二）、病毒病的常规实验室诊断：
1、病毒的分离和鉴定：（P219）病毒对细胞的感染性具有严格的选择性和特异性，因此用组织培养细胞接种病毒必须首先选择敏感细胞。 （1）病毒增殖的判定：（略）（2）细胞病变（CPE）：大部分病毒在敏感细胞系均可出现CPE（细胞病变），CPE（细胞病变）可以表现为严重的细胞破坏、细胞肿大、颗粒增多、细胞融合成合胞体或无明显的细胞变化等。CPE（细胞病变）经常具有病毒“种”的特性，因此常常作为病毒坚定依据。
（3）病毒蚀(shi)斑技术（又称空斑）：病毒蚀(shi)斑是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶，
主要用于病毒的纯化或病毒悬液中感染病毒含量的测定。（用病毒蚀斑技术测定含量-病毒纯化或病毒悬液中感染的病毒）
（4）病毒感染力的滴定：有两种，一种方法是用实验动物测定LD50(半数致死量)；另一种方法是在组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量。 （5）病毒的保存：分离或鉴定后的病毒经过冷冻干燥后可以长期保存。
2、免疫-血清学实验：免疫-血清学实验是利用抗原和抗体的特异性结合的原理进行的，主要用于两个目的：
① 从病料获得病毒株后，应用已知的抗病毒血清或单克隆抗体进行免疫-血清学试验，鉴定病毒的种类乃至型别；
②由发病动物采集血清标本，应用全病毒或特异性病毒抗原，测定发病动物体液中的特异性抗体，或进一步比较发病
动物的急性发病期和恢复期血清中的抗体效价，了解病毒性抗体是否有明显的增长，从而判定病毒感染的存在。
（1）中和试验：动物在受到病毒感染后，在体内产生抗体，如果该抗体能与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染力，这种抗体就成为
中和抗体。
应用已知的病毒或病毒抗原，可以测知患者体内中和抗体的存在及其效价；
用已知的抗病毒血清或中和性单克隆抗体，也可以进行病毒的鉴定，因此中和试验也常用于新分离病毒株的鉴定。
（2）血凝和血凝抑制试验：许多病毒能够凝集某些种类动物的红细胞，病毒凝集的红细胞种类随病毒种类的不同而不同。 血凝反应可被特异性抗体所抑制，因此血凝抑制试验可以应用于：
①应用于标准病毒悬液测定血清中的相应抗体；②应用于特异性抗体鉴定新分离的病毒。 用枸橼酸钠配置的阿氏液具有抗红细胞凝集作用， 用于血凝和血凝抑制试验中配置红细胞悬掖。
同一患者急性发病期和恢复期双份血清（相距2～3周）的抗体效价增高4倍以上者，说明本次发病是由所测抗体相应病毒引起的。 （3）补体结合试验：一个抗体分子与抗原结合后，可以导致数百个补体分子的激活，呈现一定程度的放大作用，所以补体结合试验是一个比较敏
感的方法，一般用于人及动物血清中特异性抗体的定量检测（补体结合试验），也常用于新分离病毒的鉴定。
（4）免疫荧光技术：将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原-抗体反应，出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了抗原或抗体的存在。 免疫荧光技术具有抗原-抗体反应的特异性和染色技术的快速性，并可在细胞水平上进行抗原定位，故在病毒学研究和病毒病
的诊断中都是一种应用很广的方法。荧光抗体染色技术包括（1）直接法、（2）间接法、（3）补体法、（4）SPA (葡萄球菌A蛋白)免疫荧光法。
（5）酶免疫技术：以酶作为标记物，通过化学方法将其与抗原或抗体共价结合，形成酶标记物，可与被检的抗原或抗体起反应，形成酶标记免疫
复合物。制备酶结合物的方法很多，目前应用最广泛的有过碘酸盐法和戊二醛法。
酶免疫测定试验包括：①间接法（测抗体）、②双抗体夹心法（测抗原）、③IgM捕获ELISA（酶链免疫吸附实验）、④竞争法。IgM是动物机体
在受到初次抗原刺激后最早产生的一种抗体球蛋白，因此IgM捕获ELISA常应用于多种病毒病的早期诊断。抗u链抗体特异性结合IgM，可以应用于IgM捕获ELISA。
IgG是主要的抗病毒抗体，在第二次抗原刺激时，由于免疫回忆，发生迅速的加强反应IgG量显著增高（分子量大）。在病毒病的诊断中，也常将这一原理用于判断病毒病的感染状况，但常常需要采集恢复期和急性期双份血清进行抗体效价的比较如IgG水平4倍或4倍以上增加具有血清学诊断意义。 （6）胶体金免疫检测技术：胶体金免疫检测技术是以胶体金为载体吸附抗体和抗原，完成检测特异性抗原或抗体的。胶体金免疫检测技术优于ELISA（酶链免疫吸附实验）法和免疫荧光法的最主要一点是肉眼直接判定结果。（总结：胶体金免疫检测技术就是直接用肉眼可以观察结果）。 3、病毒病的分子生物学诊断：分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性，病毒病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸和蛋白质的测定。
PCR（全称是聚合酶链反应），是在引物、摸板DNA和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
由于引物是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿着相反链延伸。 因此，PCR（聚合酶链反应）的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定的。PCR（聚合酶链反应）可以在数小时内对仅有的几个拷贝的基因放大数百万倍，使PCR（聚合酶链反应）扩增结果在琼脂糖凝胶电泳后形成明显可见的DNA带。
溴化乙锭（EB）可以插入核酸分子之间并在紫外线下放射荧光，因此可以作为核酸分子电泳的指示剂。（核酸分子电泳的指示剂用溴化乙锭- EB）。 （1）RT-PCR(聚合酶链反应)技术：由于DNA聚合酶不能以RNA为摸板合成cDNA，所以不能对RNA病毒核酸进行直接PCR（聚合酶链反应）。 首先必须提取病毒RNA。提取病毒RNA时，要注意避免RNA酶对病毒RNA的降解作用。为此，所用的试剂和用品均需要进行无Rnase处理，（Rnas
必须使用无热原质水制备）如加入RNA酶抑制剂或高压灭菌。加入反转录酶经过逆转录反应合成与病毒RNA互补的DNA(cDNA)，然后才能进行PCR（聚合酶链反应），这就是所谓的RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）。目前常用的逆转录酶（RT-PCR）包括MMV和AMV。RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）反应的特异性取决于模板和引物，引物序列必须是被检病毒特异的，原则上要求引物3，端碱基与模板一定要配对，对引物5，末端的碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5，末端碱基可以不与模板DNA匹配而呈游离状态，因此对引物5，末端可以进行自由修饰。PCR（聚合酶链反应）反应中，引物1又称Watson引物，是与模板正链互补的寡核苷酸链。
（2）核酸杂交检测技术：杂交的基本原理是带互补序列的单链核苷酸相遇时，会退火形成双链。
“用于诊断目的”杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸，如果是阳性结果说明病毒感染的存在。在核酸分子杂交技术基础之上又发展了一系列检测DNA和RNA的技术，如Southrn blotting、Western blotting、Dit blotting和菌落杂交。 聚丙烯酰胺凝胶电泳也可简称为PAGE（PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳-测杂交） DNA限制性内切酶可以识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列。
利用不同的内切酶切割病毒DNA，依据切割后的片段在凝胶电泳中泳动速率不同所形成的电泳带型做出诊断。
（3）病毒病的免疫预防：决定疫苗免疫效果的关键因素是疫苗本身的质量。
目前普遍应用的病毒疫苗主要分为弱毒（活）疫苗和灭活疫苗两类。 弱毒（活）疫苗分解成（弱毒疫苗、弱活疫苗）。
近年来随着分子病毒学研究的不断深入，相继研究出了（1）亚单位疫苗、（2）基因工程疫苗、（3）活载体疫苗、（4）分子疫苗。
三、病毒学各论： （一）、虫媒病毒：
虫媒病毒是由媒介昆虫作为病毒的传递者的一类病毒，由虫媒病毒引起的疾病即为虫媒病毒，如乙型脑炎、新疆出血热、登革热、黑热病等。 （二）、亚病毒：（类病毒和阮病毒等总称）
类病毒没有外壳蛋白，对各种有机溶剂有抵抗力，说明也没有脂质外膜，只是一个裸luo露的RNA分子，类病毒只出现于植物。
在人和动物中存在着一类被称为亚急性海绵样脑病的中枢神经系统疾病，如疯牛病。疯牛病能够通过食物链传染给人。研究证明，这种奇特疾病的病原，即不是病毒，也不是类病毒，大体上是由蛋白质组成，目前称之为阮病毒。（总结：病毒-亚急性海绵样脑病的中枢神经系统疾病，如疯牛病）
（三）、流行性乙型脑炎病毒：（属于虫媒病毒）
1、病原学：流行性乙型脑炎病毒属于黄病毒科。黄病毒科能够致人疾病的病毒有登革热病毒、丙型肝炎病毒和乙型脑炎病毒。由于1924年乙型脑炎病毒首先证实于日本，故也称其为日本乙型脑炎。C6/36细胞适合于乙型脑炎病毒的分离和培养。
2、流行病学：（1）宿主动物与传染原：由蚊为媒介而传播，引起人畜感染的主要媒介可能是三带啄库蚊，其他库蚊也有可能。
（2）传染途径：流行性乙型脑炎是一种自然疫源性疾病，猪是传播乙型脑炎病毒（乙脑病毒）的主要动物宿主。
乙型脑炎病毒通过蚊-猪-蚊的循环维持自身的存在。
（3）人群易感性：除人、马和猪外，通常不呈现临床症状。
3、临床表现：流行性乙型脑炎是一种中枢神经系统的急性传染病，以高热和狂暴或沉郁等神经症状为特征。 4、预防：疫苗预防注射。
（四）、登革热和登革出血热病毒：（登革热—DH、登革出血热病毒—DHF）DH/DHF（属于虫媒病毒）
1、病原学：登革病毒属于黄病毒科黄病毒属含单股正链RNA。登革热（DH）和登革出血热（DHF）是由4个血清型病毒引起的两种不同临床类型的急性传染病。C6/36细胞可用于登革病毒分离和培养。
2、流行病学：（1）宿主动物与传染原：中国DH/DHF的传播媒介主要为埃及伊蚊和白纹伊蚊，这些蚊种主要生活在家庭储水容器中。
（2）传染途径：登革热存在城市型（人-蚊-人循环）、丛林型（猴-蚊-猴循环）两种疫源地。中国主要为人-蚊-人循环。 （3）人群易感性：DH/DHF主要发生于热带和亚热带地区。中国从婴儿到老人均可发病，以儿童和青壮年患病率较高。
3、临床表现：潜伏期：一般为5～8天。
登革热主要以高热、头痛、肌肉和关节痛为主，登革出血热与登革热的主要区别是有无严重出血。
DSS（登革休克综合征）是DH/DHF的严重形式，其含义是登革休克综合征。主要诊断依据为出血、休克、口唇发绀和血压低或测不到。（这些症状是登革休克综合征临床表现）世界卫生组织(WHO)对DHF/ DSS的诊断限定了严格的标准。
有四种主要的临床表现：高热、出血、肝肿大和循环衰竭。WHO根据疾病的严重程度把DHF/ DSS（登革出血热/登革休克综合征） 分为四个等级：Ⅰ级和Ⅱ级表现为DHF（登革出血热）轻型，Ⅲ级和Ⅳ级表现为更严重的形式—DSS的（登革休克综合征）
4、预防：防蚊灭蚊。传染源的管理。
（五）、流行性出血热病毒：（属于虫媒病毒）
1、病原学：流行性出血热病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，基因为负链分节段RNA。中国目前发现的流行性出血热主要有2种类型： HTNV型（野鼠型）和SEOV型（家鼠型）。Vero-E6细胞适合于流行性出血热病毒的分离和培养。
2、流行病学：（1）宿主动物与传染原：在我国流行性出血热主要传染源和病毒宿主为啮nie齿动物（黑线姬鼠和褐家鼠）。啮nie-咬如虫咬啮。
（2）传染途径：接触带病毒的宿主动物及其排泄物可以造成感染。 （3）人群易感性：普遍易感。
3、临床表现：潜伏期：一般为7～14天。
典型的临床表现有三大特征：发热、出血和肾损害。流行性出血热主要以肾脏损害为特征，故又称之为肾综合征出血热。
4、预防：（1）防鼠灭鼠。（2）接种疫苗：目前我国所使用的流行性出血热的疫苗是细胞培养灭活疫苗，可以分为3种类型（家鼠型、野鼠型、家鼠、野鼠双价混合苗）经过近几年的应用已证明在预防流行性出血热方面有效。（3）讲究卫生。
5、诊断：流行性出血热对于明确疫源地类型、选择所用疫苗的种类、指导防治策略等都非常重要。目前流行性出血热的分型诊断方法有多种，包括（1）免疫荧光法、（2）单抗分型、（3）RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）、（4）ELISA（酶链免疫吸附实验）法。鼠带毒率调查是常用的监测手段之一，用于流行性出血热鼠带毒率调查标本制备的主要方法为鼠肺冰冻切片，鼠带毒率调查的常用方法为免疫荧光法。
（六）、克里米亚—刚果出血热：（故又称为新疆出血热）
1、病原学：克里米亚—刚果出血热是布尼亚病毒科、内罗病毒属的病毒，故又称为新疆出血热。病毒基因组为负链分节段RNA。
2、流行病学：（1）宿主动物与传染原：30多种蜱，特别璃眼蜱属既是该病毒的储存宿主又是传播媒介；多种不同的脊椎动物既是蜱的宿主，也 可能是病毒的储存宿主。
（2）传染途径：人的感染是因为蜱的叮咬或密切接触感染动物或患者。（3）人群易感性：普遍易感。
3、临床表现：潜伏期：蜱叮咬至疾病发作之间的时间为潜伏期，一般为3～6天。
临床表现：克里米亚—刚果出血热是一种神经系统的疾病，神经系统的症状出现于血管异常造成的显著的出血综合征之前。 常常为突发和急性，发热（39℃～41℃）、寒战、头痛、风湿痛、腰痛和上腹部痛等。随后迅速发展到短暂的、最严重的
出血期，一般4天后在疾病高峰期导致死亡。
4、预防：目前尚无特异性疫苗进行接触前的主动预防。有效的预防首先应避免与传染源及媒介的接触。
（七）、肝炎病毒：
1、甲型肝炎病毒：甲型肝炎病毒（HAV）可以引起甲型肝炎。在病毒分类上甲肝病毒属于小RNA病毒科。
甲型肝炎实验室诊断方法主要依赖于检测患者血清中的抗HAV（甲型肝炎病毒）的IgM。
2、乙型肝炎病毒：（HBV）
（1）、病原学：乙型肝炎病毒（HBV）属于嗜肝DNA病毒科、正嗜肝DNA病毒属，是传染性肝炎的一个重要病因。
（2）流行病学：HBV（乙型肝炎病毒）的唯一宿主是人。嗜肝DNA病毒可以存活于那些与感染者粘膜或皮肤创口接触的物品表面。 （3）诊断：HBV（乙型肝炎病毒）侵入机体后进入血液循环，主要在白细胞中进行繁殖。HBV（乙型肝炎病毒）主要有3种抗原， 分别为HBsAg（乙型肝炎表面抗原）、HBcAg（乙型肝炎核心抗原）、HBeAg（乙肝e抗原）。
HBsAg（乙型肝炎表面抗原）：（1）HBsAg可诱导机体产生乙型肝炎表面抗体（抗—HBs）,具有抗HBV（乙型肝炎病毒）感染的
作用、（2）HBsAg与病毒的中和性作用有关。
HBcAg（乙型肝炎核心抗原）：为病毒核心的主要抗原，是急性乙型肝炎病毒感染的重要诊断指标之一，是检测到抗HbcAgM。 HBeAg（乙肝e抗原）：在乙型肝炎潜伏期的后期出现并且HBeAg的存在表示HBV（乙型肝炎病毒）的存在。HBeAg是在病毒复
制活跃时的宿主血清中检测到的一种可溶性抗原，HBeAg成分的消失和出现相应的抗体，预示着乙型肝炎病毒的繁殖减弱和疾病有可能向好的方面转化。血清中HBV（乙型肝炎病毒）DNA聚合酶的存在，表明HBV的感染处于病毒活动复制期。
（4）预防：疫苗接种：
目前用于预防接种的乙型肝炎疫苗主要有基因工程乙肝疫苗和乙型肝炎表面抗原佐剂疫苗。防止血源性污染和传播。
3、丙型肝炎病毒：（HCV）——非甲非乙型肝炎病毒
（1） 病原学：丙型肝炎病毒（HCV）属于黄病毒科、类丙型肝炎病毒属。病毒粒子含有一单股正链RNA。丙型肝炎又可称为非甲非乙型
肝炎，根据其流行病学特征、临床表现和传播方式，可以将其分为（1）肠道传播的非甲非乙型肝炎、（2）输血后非甲非乙型肝炎。 （2） 流行病学：①宿主动物与传染源：人是丙型肝炎的自然宿主和贮存者。尚未确认别的自然宿主和非脊椎动物传播媒介。 ②传染途径：约60%的丙型肝炎病例都是由血液接触引起的，而非肠道感染。③人群易感性：普遍易感。
4、丁型肝炎病毒（HDV）：丁型肝炎病毒（HDV）为缺陷型RNA病毒，必须借助乙型肝炎表面抗原（HBsAg）包裹才能成为感染性病毒颗粒，
常与HBV（乙型肝炎）同时或重叠感染。HDV（丁型肝炎病毒）主要通过非肠道传播途径传播。 HDV感染的指标是血液和体液中可测得HDV抗原。抗HDV抗体检测可以反映HDV感染状况。 慢性HDV感染与多种肝脏疾病密切相关，包括重症肝炎、肝硬化、丁型肝炎和慢性活动性肝炎。
（八）流感病毒——流行性感冒病毒（属于呼吸道病毒）
1、病原学：流感病毒属于正粘病毒科。按流感病毒核蛋白与基质蛋白抗原性的不同，流感病毒又可分为甲、乙、丙3型。
流感病毒基因组为单股RNA，由8个阶段组成。流感病毒基因组片段具有共同的特点：所有的RNA阶段具有相同的5，端。 1980年WHO公布的流感病毒命名方法，一株流感病毒名称中包括下面几项内容：型别/宿主/分离地点/毒株序号/分离年代（亚型）。 流感病毒血凝素变异性很强是造成流感病毒易发生抗原变异的主要原因。 2、流行病学：（1）宿主动物与传染源：
人的绝大多数甲型流感病毒能自然感染家禽、家畜，并进一步支持人甲型流感病毒新亚型可能来源于动物的观点。 乙型流感病毒能引起人的呼吸道感染，丙型流感病毒也是感染人的病毒。
（2）传播途径：流感病毒的主要传播途径是空气飞沫。
（3）人群易感性：3个型流感病毒没有共同抗原，都能感染人；但甲型流感病毒的感染范围很广，容易引起大规模流行。
3、免疫预防：由于流感病毒变异频繁，因此疫苗注射必须有针对性，即必须针对当前的流行株，才能取得良好的免疫效果。 4、诊断：用于流感病毒分离与鉴定的标本应取自患者鼻咽分必物。流感病毒的快速诊断主要依赖于检查抗病毒血凝素抗体。 （九）埃博拉病毒：
1、病原学：丝状病毒科、丝状病毒属包括两种病毒，即①埃博拉病毒和②马尔堡病毒。
研究丝状病毒的重要意义在于：（1）这两种病毒均具极高的传染性，对人类的危害极大；（2）室温下非常稳定；（3）埃博拉病毒
60℃1小时仍不能被完全灭活，由于特有的生物学性质和致病力，WHO将其列为潜在的生物战剂之一。 （4）埃博拉病毒最初流行于扎伊尔北部的埃博拉河流域而命名为埃博拉病毒。
2、流行病学：埃博拉病毒的自然宿主尚末确定。自然条件下，人和猴都能发生严重感染并死亡。
埃博拉病毒感染后可以引起出血的临床表现，因此常将其归为出血热病毒。根据埃博拉病毒的抗原性的差异，又可将埃博拉病毒分为3个血清型，不同血清型的埃博拉病毒其致病型有很大的差异。目前认为，埃博拉病毒的疫源地主要在非洲大陆，但1989年自菲律宾运往美国的猕猴发生了感染，泰国也有埃博拉病毒感染的血清学证据，提示东南亚地区也可能是疫源地之一。
马尔堡病毒也可引起人的严重出血热，在人-人或猴-人之间传播。 （十八）鼻病毒：鼻病毒属于小核糖核酸病毒科、鼻病毒属，是与人类普遍感冒有关的病毒。 （十九）腮腺炎病毒：（属于呼吸道病毒）
流行性腮腺炎是由副粘病毒科、副粘病毒属的腮腺炎病毒引起。流行性腮腺炎最具有流行病学意义的传染源是亚临床型者。
（二十）天花病毒：（属于痘类病毒）
天花是痘病毒科、正痘病毒属的天花病毒引起的一种传播迅速的烈性传染病。由于使用痘苗病毒疫苗预防，1977年天花在全世界流行终止。 （十）狂犬病毒：
1、病原学：狂犬病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属。因其特有的临床表现，狂犬病又可称为“恐水病”。
从感染动物或患者中发现的狂犬病毒又可称之为野毒株或街毒；狂犬病毒街毒经过系列传代适应特定宿主后即为固定毒。
根据对不同毒株的血清反应和单克隆抗体分析，将狂犬病毒分成5个血清型：血清1型、血清2型、血清3型、血清4型、血清5型。 血清2、3、4、5型又称为狂犬病相关病毒，野外分布的主要为血清2、3、4型。
在血清分型的基础上，利用分子生物学技术对狂犬病毒也进行了遗传学分型，即将狂犬病毒属分为6种基因型：
基因型1（血清1型）、基因型2（血清2型）、基因型3（血清3型）、基因型4（血清4型）、基因型5和基因型6（血清5型）相对应 。
2、流行病学：（1）宿主动物与传染源：狂犬病毒几乎可以感染所有温血动物，但造成人类感染的主要传染源是带病毒犬。 （2）传播途径：因感染狂犬病毒的动物咬伤，感染性唾液污染伤口发生感染。 （3）人群易感性：人及所有温血动物皆能感染。
3、预防：狂犬病的预防主要包括两个方面：（1）即控制传染源（2）暴露后应用免疫制剂。控制传染源主要是家养犬的免疫。
狂犬病免疫制剂包括被动免疫与主动免疫两种。狂犬病的被动免疫制剂有动物源抗狂犬病病毒的精制血清和人源狂犬病免疫球蛋白。
主动免疫即注射狂犬疫苗。我国于1981年开始用地鼠肾细胞疫苗，近几年又开始应用Vero（非洲绿猴肾）细胞狂犬病疫苗。
4、诊断：狂犬病病毒或病毒抗原可以在患者身体多个部位，如角膜压片、脑脊髓液、唾液和咬伤处皮肤组织检测到。
实验室诊断狂犬病最具特性的诊断依据是—感染神经原内的Negri小体（内基氏小体），最常见于海马及小脑普尔金耶组织的神经细胞内，
是狂犬病病毒的集落。WHO推荐快速荧光灶抑制试验取代了传统的小鼠中和实验检测狂犬疫苗免疫后中和抗体水平。
（十一）轮状病毒：（属于肠道病毒）
1、病原学：轮状病毒属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，是各种幼龄动物非细胞性腹泻的主要病原之一。病毒由11个节段的双链RNA组成。根据
轮状病毒RNA11个节段的聚丙烯酰胺电泳图形不同，可以将轮状病毒进行分型和鉴定。绝大多数哺乳动物轮状病毒，具有一种相同的群抗原，这些轮状病毒被命名为A群轮状病毒，是研究的主要对象。
2、流行病学：轮状病毒宿主范围甚广，已知的有人及多种动物。据初步统计，全世界幼儿发生的肠炎至少有50%是由轮状病毒引起的。（肠道病毒）。 3、预防：人用口服轮状病毒活疫苗可使儿童获得保护。
4、诊断：轮状病毒感染的可靠的实验室诊断依赖于检出轮状病毒或抗原，进行该项诊断应收集粪便。 培养轮状病毒使用最普遍的是MA-104传代细胞系。
轮状病毒复制方式不同于其他呼肠孤病毒，它不是通过吞饮作用进入细胞，而是通过胞浆膜直接进入胞浆，胰蛋白酶对病毒进行处理可以
使病毒变为有感染性。因此为了在细胞培养中复制轮状病毒和连续传代通常需要用胰蛋白酶对病毒进行处理，从而促进轮状病毒的感染性。
（十二）疱疹病毒：
疱疹病毒是一群较大的有囊膜的双链DNA病毒。根据进行该项诊断疱疹病毒的感染性质，又可将疱疹病毒分为A群和B群两个亚群。
A群：凡在体外培养时，容易从细胞内释放到营养液中的病毒为A群；B群：病毒同细胞紧密结合很难释放到营养液中为B群，又名细胞结合性病毒。 疱疹病毒基因组结构由末端重复序列和内部重复序列所组成，重复序列的数量和长度在不同的疱疹病毒有较大的差异。 疱疹病毒的基因可以整合于细胞的基因组内，成为细胞DNA的一部分，长远地复制下去，形成长期潜伏感染状态。 疱疹病毒与肿瘤发生关系的机制目前已经证明与疱疹病毒隐性感染有关。
人疱疹病毒共有5型，疱疹病毒4型，即EB病毒（EBV），EBV除引起人类皮肤和黏膜的疱疹样病变外，还与人类鼻咽癌有密切关系。 （十三）逆转录病毒：——前病毒——RNA肿瘤病毒——白血病病毒
逆转录病毒科最基本的特征是在其生命活动过程中有RNA到DNA的复制过程。
逆转录病毒病毒的基因组是单股、正链、线性RNA的二聚体，病毒粒子中的RNA不具备感染性。逆转录病毒RNA反转录成为DNA后，
病毒DNA可以整合在宿主染色体中，这是逆转录病毒生命存在的一种形式，这种形式称之为前病毒。 能够引起肿瘤的逆转录病毒在文献中被称之为RNA肿瘤病毒。
致瘤性逆转录病毒中可以引起恶性疾患，潜伏期长，并且不引起靶细胞培养物产生明显的变化的病毒为白血病病毒。 逆转录病毒独特的基因组结构和生命周期使逆转录病毒在分子生物学研究和基因治疗中其到了基因转移载体的重要作用。
（十四）艾滋病（AIDS）病毒：人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-1）和人Ⅱ型免疫缺陷病毒（HIV-2）引起人的获得性免疫缺陷综合征。（AIDS） 1、、病原学：人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-1）和人Ⅱ型免疫缺陷病毒（HIV-2）引起人的获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病（AIDS） 。
艾滋病病毒属于逆转录病毒科、慢病毒属。
2、致病机制：HIV对CD+4细胞有选择性的亲嗜性。病毒侵入细胞后，借助反转录酶合成DNA，与细胞DNA整合，并利用宿主细胞的酶系
统进行生物合成，产生病毒产物，致使宿主细胞死亡，释放出大量新病毒，攻击新的靶细胞，从而使T4淋巴细胞数量不断减少；
正常的T4细胞，通过CD+4细胞结合病毒与病毒表面蛋白，而被细胞毒作用T细胞（T8）识别，进而被杀伤。
1单核-巨噬细胞、○2细胞毒性T细胞、○3NK细胞、○4B细胞等均有密切关系， T4淋巴细胞在免疫应答过程中起调节作用，与○
所以T4细胞耗竭、功能下降，必将使免疫系统的多种功能发生缺陷。
3、传播途径：性接触为最主要的传播途径；经注射途径、孕妇胎盘以及破损皮肤等均可造成感染。 4、诊断：测定HIV感染的最简便方法是测定HIV抗体。
5、预防：切断各种传播途径。
（十五）脊髓灰质炎病毒：（属于肠道病毒）
脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科，肠道病毒属的病毒，主要经过粪-口途径传播。脊髓灰质炎病毒进入机体后，
主要侵犯脊髓前角运动神经元。目前脊髓灰质炎在世界上许多国家，包括中国，已经消失。
（十六）口蹄疫病毒：
口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科、口蹄疫病毒属，是一种主要感染偶蹄动物的烈性传染病，人和非偶蹄动物也可感染，但症状相对较轻。 口蹄疫一旦发生则呈暴发性流行，可以跳跃式传播，在适合的气候条件下还可通过风媒的途径传播。 人感染口蹄疫病毒后只在口腔黏膜、手、足处皮肤出现水疱，可自愈，个别严重病例见于儿童。
动物患口蹄疫后其生产性能急剧下降；对疫区要进行封锁，封锁期间疫区内正常的畜产品交易和生产活动都不能进行；对确诊为口蹄疫的动物要立即捕杀、销毁。所以口蹄疫暴发后对畜、牧、业生产乃至整个国民经济都会造成巨大的损失。
（十七）呼吸道合胞病毒：
呼吸道合胞病毒属于副粘病毒科、肺病毒属。因在组织培养繁殖时能引起细胞融合而定为现在的名称。 呼吸道合胞病毒可以引起婴幼儿产生严重的下呼吸道感染。
感染性肺炎病因分类
分 类 举 例
细菌性肺炎 （1）需氧革兰染色阳性球菌：如肺炎链球菌（肺炎球菌）、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌等
（2）需氧革兰染色阴性球菌：如肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、肠杆菌属、大肠埃希菌、变形杆菌等 厌氧杆菌：如棒状杆菌、梭状杆菌等
病毒性肺炎 腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、禽流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、 汉坦病毒肺综合征、Hendra and Nipah病毒、冠状病毒、Metapeumovius 支原体肺炎 肺炎支原体引起的肺炎
衣原体肺炎 肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体
真菌性肺炎 白色念珠菌、曲菌、放线菌等
其他病原体所致肺炎 立克次体（如Q热立克次体）、弓形虫（如鼠弓形虫）、原虫（如卡氏肺孢子虫）、
寄生虫（如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫）、军团菌等。
立克次体族的分类
DNA 生 物 学 特 性 补体结合反应
生 G+C(基因组) 细胞内 鸡胚培养 空斑大小 动物 低 可溶性抗原 颗粒性 外斐fei氏 属 物 种 mol 位置 滴度高峰 （形成天数） 易感 抗 （乙醚提取） 抗原 反应
型 % （温度） 性 力
立 斑 普氏立克次体 胞浆 0.75mm 豚tun 不强 群特 种特 OX（加拿 克 疹 莫氏立克次体 29～30 （仅加拿大立 濒bin死 （7～10） (小猪)鼠 异性 异性 大立克次 次 伤 斑疹伤寒立克次体 立克次体可 （35℃） 易感 体不明） 体 寒 加拿大立克次体 可在核内） 群
斑 立氏立克次体 OX（小蛛立
点 西伯利亚立克次体 胞浆 死后 2～3 mm 豚鼠 不强 群特 种特 克次体阴性、派 热 康氏立克次体 32～33 及 24～72 5～8天 易感 异性 异性 氏立克次体不明） 群 澳大利亚立克次体 核 小时
小蛛立克次体 （32℃） 派氏立克次体
恙虫 恙虫病立克次体 ？ 胞浆 濒bin死 1 mm 小鼠 脆弱 株特 种及型 OX
病群 （35℃） 8～10天 易感 异性 特异性
柯克 Q Q热立克次体或 43～45 胞浆 濒bin死 1 mm 豚鼠 强 无 种特异性 阴性 斯体 热 贝氏立克次体 空泡 （35℃） 8～10天 易感 呈两相
罗沙 战 战壕热立克次体或 38～39 胞外 生长很差 细胞 不能 较强 种特 种特 阴性
利 壕 五日热罗沙利马体 培养 感染 异性 异性 马体 热
第二章
第一节：医学微生物学总论
医学微生物知识
1． 非细胞型微生物（病毒）：（1）是最小的一类微生物，能通过除菌滤器。
（2）没有典型的细胞结构，无产生能量的酶系统，只能在活细胞内生长增殖。（病毒属之）
2． 原核细胞型微生物（细菌、支原体、立克次氏体衣原体、螺旋体、放线菌）：
（1）仅有原始核质，系呈裸(luo)露(lou)的环状DNA团块(kuai)无核膜或核仁。（2）细胞器不很完善，只有核蛋白体。细菌的
基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体等；细菌的特殊结构包括：菌毛、鞭毛、荚膜等；细菌可分为自养菌和异养菌； 细菌按形态不同可分为：球菌、杆菌、螺形菌（螺菌和弧菌）。在细菌的组成中，水为主要成分，而蛋白质类在固体成分中的比例最高。 3． 核细胞型微生物（真菌）：（1）细胞核分化程度高，有核膜和核仁；（2）细胞质内细胞器完整。（真菌属之）（3） 不能在活细胞内生长增殖。
机体的屏障作用包括：皮肤与粘膜、血脑屏障和胎盘屏障。毒力主要由侵袭力和毒素所决定。
毒素包括：外毒素（如金黄色葡萄球菌肠毒素、产毒性大肠杆菌肠毒素、白喉毒素、痉挛毒素、肉毒毒素、表皮剥脱毒素、霍乱肠毒素）和内毒素
外毒素包括：神经毒素、细胞毒素、和肠毒素；
细菌的内毒素为脂多糖成分，均由革兰阴性菌产生、160℃，2-4小时才被破坏，其毒害效应不具有组织器官选择性。（毒性作用包括DIC、Shwartzman现象、发热反应、白细胞反应、内毒素血症与内毒素休克）虽毒性作用较弱，但不能像外毒素那样经甲醛脱毒而成为类毒素 鲎（hou）试验可以用对细菌内毒素的测定。致病性螺形菌有弧菌如霍乱弧菌，和螺菌如鼠咬热螺菌。幼龄细菌菌体较长，老龄细菌往往呈多形态性。
第二节：细菌的形态和结构
细菌的结构：有些细菌在一定条件下可以发生转化而进入休眠状态，称为芽孢。其结构和性状与其繁殖状态有明显不同；还有的细菌在环境因素的用
下，还可以形成L型。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，又称为粘肽、胞壁质。肽聚糖原核型生物细胞的特有成分。肽聚糖（1）是细胞壁抗胞内高渗透压、（2）保护细胞结构和功能完整的主体成分、（3）凡能破坏肽聚糖分子结构或抑制其合成的物质，都有抑菌或杀菌作用。
革兰氏阳性细菌的细胞壁：由肽聚糖及穿插于其内磷壁酸组成。其中（1）肽聚糖不仅层数多、含量高，占细胞壁干重50%-80%；（2）而且质地致密，
是具有高机械强度的三维空间结构。磷壁酸分为壁磷壁酸和膜磷壁酸两种。磷壁酸有很强的抗原性，是G+细菌的重要表面抗原，可用以对细菌进行血清学分型。
革兰氏阴性细菌的细胞壁：依次包括肽聚糖、脂蛋白、外膜、类脂A、多糖等成分。还有胞质周围间隙。 肽聚糖：阴性细菌的肽聚糖仅1-2层，占细胞壁干重的10%左右。是疏松薄弱的二维网状结构。
脂蛋白：由蛋白和脂质组成，连接于外膜与肽聚糖之间。脂蛋白是阴性细菌含量最高的蛋白质，其功能是稳定外膜并将之固定于肽聚糖层。 外膜：外膜是阴性细菌的细胞壁特有成分，约占细胞壁干重80%。外膜由平行排列的脂质双层构成，其内镶嵌以具有不同功能的多种特异性蛋白；外
膜还有性菌毛、噬菌体的受体。
脂多糖（LPS）:（称为内毒素）：是细胞壁外膜伸出于细胞表面的特殊结构，由类脂A、核心多糖和特异性多糖组成。LPS对动物具有强烈毒性作用。LPS牢固地结合在细菌细胞表面，只在菌体溶解时才释放，故称为细菌内毒素。
类脂A：类脂A耐热，是内毒素的主要成分和毒性部位类脂A无种属特异性，各种细菌的类脂A都相同，故不同细菌产生的内毒素的毒性作用均相似。 核心多糖：位于类脂A的外层，具有属特异性，同一属的细菌其核心多糖的组成是相同的。 特异性多糖：具有抗原性，G细菌的菌体抗原（O抗原）
细胞膜：细胞膜由平行排列的脂质双层组成，其内镶嵌以多种蛋白和少量多糖；
细胞膜的主要功能：（1）物质纳泄：细胞膜具有选择性通透作用，可选择性地摄取营养物质，排出代谢产物。物质纳泄是细胞膜的主动运转过程，其
中载体蛋白和酶类物质起重要作用。（2）生物合成：细胞膜上有多种合成酶，是细菌细胞生物合成重要场所。肽聚糖、磷壁酸、磷脂、脂多糖、荚膜、鞭毛等多种菌体成分，都是在细胞膜上合成的。
（3）呼吸作用：细胞膜上有多种呼吸酶，包括细胞色素和一些脱氢酶，可以运转电子完成氧化磷酸化，参与细胞呼吸过程，与能
量的产生、贮（zhu）存和利用有密切关系。
（4）形成中介体：中介体是细菌细胞内陷、折叠、卷曲形成的囊状结构。多见于G+细菌。
细胞质：是由细胞膜包裹着的溶胶性物质，其基本成分是水、蛋白质、核酸、脂类、少量糖和无机盐等。用光镜和电镜观察细胞质，大小不等的颗粒。
（1） 核糖体：核糖体是游离于细胞质中的微小颗粒，当mRNA连成多聚核糖体时，就成为蛋白质的合成场所。
（2） 核质：细菌的遗传物质是由裸露的双股DNA回旋、盘绕、卷曲而成的松散网状结构，无组蛋白包饶、无核膜、无核仁，故称为核质或拟
核。核质具有细胞核功能，决定细菌性状和遗传特征。
（3） 质粒：质粒是核质之外的双股环状DNA，携有遗传信息，控制非细菌存活所必须的某些特定性质，细菌的质粒具有自我复制、传给子代、
可几个质粒共存于一个菌体、可自然丢失，以及可通过结合或转化转移至受体菌等特性。医学上重要的质粒有决定细菌性菌毛的F因子，
决定细菌耐药性的R因子，决定大肠杆菌产生大肠菌素的col因子等。
（4） 胞质颗粒：细胞质中的颗粒多为暂时贮存的营养物质。较为常见的是异染颗粒多见于白喉杆菌、鼠疫杆菌、结核杆菌等 白喉杆菌的异染颗粒多在菌体的一端或两端，故称为极体，有助于鉴别细菌。
特殊结构：荚膜（粘稠性物质）：细菌的荚膜有多种功能，（1）其中最重要的是抗吞噬作用。荚膜抗吞噬作用是构成细菌毒力的因素之一。
（2）荚膜还有抗溶菌酶，抗补体、抗干燥作用（3）在营养缺乏时荚膜还可作为营养物质而被吸收。荚膜具有抗原性，可以鉴别细菌和进行细菌分型。 鞭毛是由细胞质伸出的蛋白性丝状物。一般认为鞭毛是细菌的运动器官，有鞭毛的细菌能活泼运动；鞭毛具有抗原性，称“H” 抗原。 菌毛许多G-细菌个别的G+细菌，细胞表面有极其纤细的蛋白性丝状物，称为菌毛。菌毛与细菌的运动无关，，须用电镜进行观察。 细菌的芽孢：某些细菌在一定条件下变成为圆形或卵圆形的小体，称为。由于芽孢在细菌细胞内形成。故常称为内芽孢。
（1）芽孢携有成套的核质、酶及合成菌体成分的各种机构，保存有细菌的全部生命活性；（2）在适宜条件下可以发芽而形成新的繁殖体。
因此，芽孢是细菌适应环境变化的特殊存活形式，亦即细菌的休眠状态。
芽孢本身并不直接引起疾病，担当其发芽转化成繁殖后，则可迅速大量繁殖，引起疾病。在人类，有四种常见的严重疾病是由能形成芽孢的细菌引起。
（1） 炭疽(ju)杆菌引起炭疽(ju)菌病（2）肉毒杆菌引起肉毒毒素食物中毒（3）气性坏疽病原菌引起气性坏疽（4）破伤风杆菌引起破伤风（常见）。 细菌L型：细胞壁有维持细菌形态和保护菌体内部的重要作用。在某些因素影响下细菌可以失去细胞壁，形成细菌的细胞壁缺陷型，亦即细菌L型。
细菌L型需要高渗透压培养基培养。细菌L型兼有多种繁殖方式，能以（1）二分裂方式、（2）出芽方式、（3）巨形体释放颗粒方式进行增殖。 L型菌落有三种类型：（1）L型，呈油煎蛋样，中心致密，透光性差，周边透明呈颗粒状；（2）G型，颗粒状，整个菌落由透明颗粒组成，无核心
部分；（3）F型，呈丝状，菌落似L型，但周边为透明性丝状。L型以引起慢性和反复发作性感染为其致病特点，主要致病物质是毒素。
第三节：细菌的增殖与代谢
细菌的营养物质（无机盐）：各类无机盐的作用为：（1）构成菌体成分；（2）调节菌体内外渗透压；（3）促进酶的活性或作为某些辅酶组分；
（4）某些元素与细菌的生长繁殖及致病作用密切相关。
生长因子：很多细菌在其生长过程中还必需一些自身不能合成的有机物质，成为生长因子。生长因子必须从外界得以补充，其中包括维
生素、某些氨基酸、脂类、嘌呤、嘧啶等。
根据细菌在代谢过程中对营养物质的需要，可将细菌分为自养菌和异养菌两种营养类型。
自养菌：该类菌能以简单的无机物为原料合成复杂的菌体成分。根据能量的来源，自养菌又分为（1）光能营养菌（2）化能营养菌。
异养菌：该类菌必须以多种有机物为原料，合成菌体原生质及获得能量。异养菌又分为（1）腐生菌（2）寄生菌。
腐生菌：以死亡生物或腐败食物等有机物作为营养物质；寄生菌：在活体的生物体内寄生，从宿主的有机物中取得营养。大部分病原菌是寄生菌。 （1） 营养物质进入菌体的方式有：（1）易化扩散（2）主动运转（3）基团移位。
细菌生长繁殖的条件：（1）充足的营养（2）适宜的温度：细菌生长的温度极限为-7℃～90℃。各类细菌对温度的要求不同，可分为嗜冷菌，最适生长温度为（10℃～20℃）；嗜温菌（20℃～40℃）；嗜热菌（56℃～60℃）生长最好。病原菌均为嗜温菌，最适温度为人的温度，即37℃，故实验室一般采用37℃培养细菌。（3）合适的酸碱度：多数病原菌最适pH为中性或弱碱性（pH7.2～7.6）（4）必须的气体环境：根据细菌对氧的需要情况，可将其分为三类：①专性需氧菌，该类细菌仅能在有氧条件下生长；②专性厌氧菌，只能在无氧环境下生长；③兼性厌氧菌，大多数病原菌在有氧及无氧的条件下均能生长，称之兼性厌氧菌。一般细菌代谢中都需要CO2，但多数细菌自身代谢所产生的CO2即可满足需要。有些细菌，如脑膜炎双球菌、布鲁氏菌，在初次分离时需要较高浓度的CO2（5%～10%）。
细菌以简单的二分裂方式无性繁殖，其突出的特点为繁殖速度快。细菌分裂倍增的必须时间，成为代时，细菌代时决定于细菌种类又受环境条件影响，细菌代时一般为20′（分）～30′（分）。
细菌的生化反应：吲哚（I）、甲基红（M）、VP(V)、枸橼酸盐（C）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为IMViC。
大肠杆菌呈“++--”，产气杆菌为“--++”。细菌通过新陈代谢能合成很多在医学上具有重要意义的代谢产物。
1热原质：热原质即菌体中的脂多糖，大多是G-菌产生的。注入人或动物体内能引起发热反应，故名热原质。热原质耐高热，高压蒸汽灭菌121℃20′。 不能使其破坏，除去热原质最好的方法是蒸馏。生物制品或注射液制成后除去热原质比较困难，所以，必须使用无热原质水制备。 2毒素与酶：细菌可产生内、外毒素及侵袭性酶，与细菌的致病性密切相关。
内毒素即G-菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为脂质A。菌体死亡崩解后释放出来。
外毒素是有G菌及少数G菌在生长代谢过程中释放至菌体外的蛋白质。具有抗原性强、毒性强、作用特异性强的突出特点。 某些细菌可产生具有侵袭性的酶，能损伤机体组织，促使细菌的侵袭、扩散，是细菌重要的致病因素，如链球菌的透明质酸酶。等
3色素：有些细菌能产生色素，对细菌的鉴别有一定意义。细菌色素有两类：
① 水溶性色素，能弥（mi）散至培养基或周围组织。如绿脓杆菌产生的绿脓色素使培养基或脓汁（zhi）呈绿色。 ② 脂溶性色素，不溶于水，仅保持在菌落内使之呈色而培养基颜色不变，如金黄色葡萄球菌色素。
4抗生素：某些微生物代谢过程中可产生一种能抑制或杀死某些其他微生物或癌细胞的物质，称抗生素。抗生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少
+
-
数几种，如多粘菌素、杆菌肽等。
5细菌素：某些细菌能产生一种仅作用于有近缘关系的细菌的抗菌物质，称细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗菌范围很窄。 实验室中细菌的常规培养应掌握以下几点（细菌的人工培养）： （1）选用适当的培养基；
（2） 必需的气体环境，一般需氧及兼性厌氧置空气中即可，专性厌氧则必须在严格无氧条件中培养。另外少数细菌在初次分离培养时，必须额外补充
适量比例的CO2，如脑膜炎双球菌、布鲁氏菌等CO2的浓度在（5%～10%）时才生长； （3） 温度一般为37℃；
（4） 培养时间多数为18～24小时，但根据菌种及培养目的应酌情处理，如培养细菌进行药敏试验时，最好选取其对数生长期，即6～12小时培养较
适宜。结核菌生长缓慢，需延长培养时间数天至数周；
（5） 为获取大量细菌或其代谢产物，可采用连续培养法。培养过程中不断通入适当气体、更换培养液并校正pH值以维持细菌较长的对数生长状态。 第四节：噬菌体
噬菌体：噬菌体是侵袭细菌或其他特殊微生物的病毒，它具有病毒的共同特性，噬菌体多数呈蝌蚪状，由头部和尾部组成，在电子显微镜下可见。 噬菌体中心为核酸，有尾噬菌体的核酸为双股线状DNA，蛋白质组成包绕核酸的头部外壳和尾部。
噬菌体通过吸附、穿入易感细胞，毒性噬菌体在细胞内经生物合成、装配，最后裂解宿主细胞，放出大量成熟子代噬菌体，浑浊菌液可变清， 固体培养物上出现空斑。
温和噬菌体感染敏感菌后并不增殖，其基因整合于宿主菌基因组中，这种带有噬菌体基因组的细菌即溶原性细菌。噬菌体基因可随细菌分裂
而传到子代细菌，在一定条件下，带噬菌体的溶原状态可自发停止，细菌被裂解。
噬菌体的种类多，分布广，几乎凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体存在。噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主内，故可用于未知细菌的鉴定和分型。
第五节细菌的突变：细菌的突变：生物体表型突然发生可遗传的变化，成为突变。突变包括两类：
（1） 基因突变：亦称点突变，是基因内部结构发生微细变化，如DNA分子上排列的碱基对的变化。有碱基置换和错码两种类型。 （2） 染色体畸(ji)变：是指染色体的一大段发生了变化，有易位、倒位、重复或缺失等数种。
在细菌中，这些变化常是致死性的，以基因突变较常见。按其发生原因，分自发突变和诱发突变两类。
自发突变和诱发突变可能不存有质的差别，仅是量的不同。
第六章 细菌性疾病检验
第一节：肠道菌疾病检验
一、 肠杆菌科概述（肠道菌疾病检验—肠道科）
1、肠杆菌科的共同生物学特性为直杆状，革兰染色阴性，大多数有菌毛，
多数有鞭毛，以周鞭毛运动，或无鞭毛不能运动(塔特姆菌属以极毛或侧毛运动)。少数有荚膜或包膜。
2、肠杆菌的共同抗原为氨基糖聚合物，其菌体抗原(O抗原)为细胞壁的脂多糖层，鞭毛抗原(H抗原)存在于鞭毛蛋白，H抗原的特异性决定于氨基酸的
排列顺序和空间结构，不耐热，60℃ 30分钟被破坏，细菌失去鞭毛后，运动随之消失，菌体抗原外露，发生H—O变异。
1呼吸型(氧化型)和○2发酵型代谢。不需特殊营养，普通培养基上均能生长。 3、肠杆菌科细菌兼性厌氧，有机营养型，兼具○
大多数种在37℃生长良好，某些种于25℃~30℃生长较好并更具活力。在营养琼脂平板上形成大而湿润灰白或黄色的粘液状菌落，液体培养基中均匀浑浊，有菌膜。分解葡萄糖和其他糖类产酸，许多种同时产气。
1痢疾志贺菌1型和○2发光致病杆菌以外的其他致病杆菌4、氧化酶阴性（痢疾志贺菌1型和发光致病杆菌氧化酶阳性其它的肠杆菌科氧化酶阴性）。除○
1欧文菌、○2大多数致病杆菌及○3肺炎克雷伯菌臭鼻亚种、○4多源杆菌属和○5耶尔森菌属的某些株外， 外，触酶阳性。除许多○
能还原硝酸盐（除这5种菌以外肠杆菌科能还原硝酸盐）。 5、肠杆菌科的关键特征是：
①氧化酶阴性和触酶阳性(个别除外)； ②硝酸盐还原(个别除外)和葡萄糖发酵；
③有动力者为周身鞭毛，而弧菌属(除麦氏弧菌和产气弧菌外)、气单胞菌属和邻单胞菌属均为氧化酶阳性和端极单鞭毛或丛毛。 6、鉴定肠杆菌科的基本条件是：
发酵葡萄糖、氧化酶阴性、还原硝酸盐。
分离肠道致病菌常用麦康凯琼脂，其他还可用中国蓝琼脂、伊红—美蓝琼脂、HE琼脂。 二、 弧菌属（菌疾病检验—肠道属） (一)霍乱弧菌（肠道菌疾病检验—肠道属）
1．概述 ：（1） 霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，以剧烈的无痛性水样腹泻为特点，偶有呕吐，未经治疗的病例很快出现脱水、酸中毒、
循环衰竭和肾衰。仅有轻刮腹泻的病例较多见。
（2）霍乱主要由O1群的古典型和El Tor型以及O139群菌株引起。
（3）O1群的霍乱弧菌又称为凝集弧菌，非O1群的霍乱弧菌又称为不凝集弧菌，一般不引起腹泻。O1群霍乱弧菌依菌体中主要抗原成
分A、B、C组分的不同分为不同亚群。各称为小川型(含A、B抗原)、稻叶型（含A、C抗原）和彦岛型(含A、B、C抗原)。
（4）()139群霍乱弧菌是第一个引起大范围霍乱暴发流行的非Ol群霍乱弧菌，其暴发最早出现于1992年在东南亚暴发和流行，并波及东
南亚其他国家。O139群的一般生物学特征与O1群El Tor型是比较相似的，有鞭毛，有与O1群相同的霍乱毒素基因， 两者O抗原不同（①O139群和O1群El ToO抗原不同、②有相同的霍乱毒素基因），对O抗原的免疫血清两者无交叉凝集， O139群霍乱弧菌的一个独特特点是：有荚膜多糖，而O1群菌株没有。目前应用的O139群霍乱弧菌的国际标准株为M045。
霍乱通过受到感染者粪便或呕吐物污染的食物或水传播，感染霍乱后的潜伏期一般为l～2天，短至数小时，长可达5天。
在高盐、高糖食品中，霍乱弧菌存活时间短，在碱性条件下要比其他肠道菌更容易存活，
对酸类极为敏感，水中的弧菌l00℃煮沸一般短至l～2分钟后即可被杀死。霍乱弧菌可在河水及底泥中越冬。
霍乱弧菌不侵入上皮细胞，其在人的小肠内定居、增殖，并释放霍乱毒素，从而引起霍乱病症。霍乱毒素为A、B两种亚基组成，每个毒素分
子的A：B亚基数量之比为1：5，其中A亚单位又分为A1和A2两部分，霍乱毒素的毒素酶活性部分在A1亚单位。 近年研究发现霍乱毒素基因位于溶原噬菌体基因组上，可在产毒与非产毒菌株之间转移，而不像以前认为的稳定于染色体上。 霍乱毒素通过其B亚单位与人小肠上皮细胞上的GMl受体结合，
因此用GMl—ELISA（酶联免疫吸附实验）的方法可检测霍乱毒素的存在。 兔小肠段结扎试验也可用来检测霍乱弧菌是否产生霍乱毒素。 霍乱弧菌引起的肠道局部黏膜免疫是霍乱保护性免疫的基础。
针对菌体产生的抗菌免疫以及针对霍乱毒素的抗毒免疫是对霍乱免疫的因素。 2．分离培养与鉴定
自患者新分离出的霍乱弧菌，在显微镜下观察呈逗点状或弧形，而经人工培养传代后，显微镜下观察呈类似大肠杆菌的杆状。
对霍乱弧菌有选择性培养基可应用自标本中进行霍乱弧菌的选择培养。庆大霉素琼脂、4号琼脂等培养基可用于霍乱弧菌的选择性培养， 为强选择性的培养基，碱性琼脂、碱性胆盐琼脂等为弱选择性培养基。
霍乱弧菌在庆大霉素琼脂选择培养基平皿上的菌落形态为带灰色、半透明、圆形扁平稍隆起、菌落边缘湿润。 在处理标本时可先进行增菌处理，增菌培养基一般用碱性蛋白胨水。
对于可疑霍乱感染者，取粪便进行碱胨水增菌时，在37~C培养至少培养6一8小时。
自河水、池塘水等外环境水中采水样进行霍乱弧菌分离时，一般采集33．3cm以内的表层水，采集的水样分离霍乱弧菌前，先用lmol/L 的NaOH将水样pH值调整到8.4—9.2。在用碱性蛋白胨水增菌6—8小时后，霍乱弧菌主要在培养液的上层增殖最多。 碱性蛋白胨水可用作霍乱弧菌的运输保存培养基。
霍乱弧菌检验中的V—P试验和第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验可作为区分O1群古典型与El Tor型菌株的参考指标。 对O139群霍乱弧菌，则可用特异的诊断血清。
3．霍乱弧菌的①流行株与②非流行株 （噬菌体型为1～6且生物型为a至f的为流行株） 在中国利用噬菌体—生物分型方案，可将O1群E1 Tor型霍乱弧菌区分为流行株与非流行株。
噬菌体分型方案中共有5个分型噬菌体，命名为VPl、VP2、VP3、VP4和VP5。噬菌体型共有32个型，属于流行株范畴的噬菌体型为l～6型。分型方案中的生物分型包括：溶原性测定、对溶原性噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验，根据不同反应结果将生物型分成从a至l 共12个型，其中a至f属于流行株的范畴。由此，噬菌体型为1～6且生物型为a至f的为流行株。对于霍乱弧菌两类菌株(流行株与非流行株)的噬菌体—生物分型试验，最少可用两平皿两试管来完成。区分流行株与非流行株的溶血试验中所用的红细胞为绵羊红细胞。 溶原性测定试验中用双层琼脂法，其中上层半固体琼脂的浓度为0.7％。
进行山梨醇发酵实验时，待检霍乱弧菌接种pH8．0的山梨醇发酵管后37℃培养3小时观察结果。霍乱弧菌流行株对山梨醇为慢发酵。
4、生化反应：两个生物型（流行株与非流行株）的霍乱弧菌均能分解 葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、产酸不产气。迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖。
氧化酶、明胶酶试验和ONA酶试验均阳性。
能产生靛基质，霍乱红反应（即亚硝基靛基质试验）阳性。
(二)其他弧菌（肠道菌疾病检验—肠道属）
1．
副溶血弧菌检验 （肠道菌疾病检验—肠道属）
副溶血弧菌是一种嗜盐性弧菌 。常存在于近海岸海水、海产品及盐渍（zi）食品中。它是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。
副溶血弧菌是一种肠道传染病，主要症状有腹痛，腹泻、脱水、畏寒、呕吐、发热和头痛，粪便多呈水样或湖状，少数为粘液血便。病程持续1～7天，一般恢复较快。病后免疫力不强，可重复感染。
副溶血弧菌已确定有12种不同的O抗原和约60种不同的K抗原。
副溶血弧菌所致细菌性食物中毒的主要污染食品来自于海产晶。副溶血弧菌为一种噬盐菌，可在含8％NaCl胨水中生长。 副溶血性弧菌食物中毒是由于食入未煮熟的海产品或污染本菌的盐腌食物而引起。潜伏期1~26小时，一般6~10小时。 大部分致病菌能产生一种特征性的溶血反应(称为神奈川现象)。
致病菌株能产生的耐热直接溶血素和不耐热溶血素是副溶血弧菌的主要致病物质。 检验方法：（1）标本采集：主要是患者的粪便、可疑食物。
（2）分离培养：首先称取样品25g，加225ml 3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐菌选择性琼脂
平板各1个，同时取10ml，加入100 ml增菌液中（40g/LNaCl），放37℃8～16小时培养后，进行平板分离，于37 ℃18—24小时培养后取出观察。
（3）挑取上述可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24小时观察结果。
（4）涂片镜检：将三糖铁培养基反应可疑者(底层变黄，葡萄糖产酸不产气，斜面不变，乳糖蔗糖不分解，有动力，不产生硫化氢)
进行涂片革兰染色镜检形态。
革兰染色镜检形态。
①形态染色：革兰阴性杆菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态。两极浓染。 菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽孢、无荚膜。
②培养特性：营养要求不高，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长。NaCl最适浓度为35g/LNaCl，在无盐培养基中不生长。
生长所需 PH 7.0～9.5，最适 PH 7.7。需氧，在液体培养基表面形成菌膜。在厌氧环境下生长较慢。 ①在35g/LNaCl琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明； ②在副溶血弧菌专用选择培养基上形成1~2.5mm，稍隆起、浑浊、无粘性、绿色菌落；
③在SS平板上不生长或长出1~2mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状。
④在羊血琼脂平板上，形成2~3mm、圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株可形成β溶血或α溶血 ⑤在TCBS琼脂（副溶血弧菌专用选择培养基）上不发酵蔗糖，菌落绿色。
③生化反应：所有用于该菌的生化反应（副溶血弧菌）培养基需加入30g/LNaCl。
本菌（副溶血弧菌）在70g/LNaCl培养基生长，在无盐或10%NaCl以上培养基不生长。 能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖；靛基质，
甲基红试验阳，V-P、H2S、尿素酶试验阴性；
神奈川试验是致病菌株能使人或兔红细胞发生溶血，对马红细胞不溶血，称神奈川试验阳性。
（5）、嗜盐性试验 将上述可疑培养物分别接种于不同浓度的盐胨水中，37℃ 24小时培养后观察生长情况，在无盐和l0％以上盐的胨水中
不生长，在7％盐的胨水中生长良好者进行下列有关试验。
（6）生化试验（总结）：分别接种各类生化培养基，
放37℃，除V-P、靛基质、甲基红试验培养48小时后加试剂观察外，其他均可在24小时观察。
动物试验
将上述各类反应的副溶血性弧菌接种3.5％氯化钠胨水，经37℃16～18小时培养后， 小鼠腹腔注射0.3ml，观察2～3天，将死亡小鼠进行解剖并做分离培养。 预防原则
预防与其他细菌性食物中毒相似。如对水产品及盐渍品等应煮熟后食用。可用复方新若明、庆大霉素、氟哌酸等抗菌药物治疗。 2、拟态弧菌 （肠道菌疾病检验—肠道属）“拟态弧菌与霍乱弧菌相似——形态学、培养特性、抗原结构”
是引起胃肠炎和某些肠外感染的病原菌。该菌形态学和培养特性及抗原结构与霍乱弧菌相似，但对O1群霍乱弧菌标准诊断血清不凝集， 可与霍乱弧菌相鉴别。另外拟态弧菌与霍乱弧菌生化特性上最重要的区别在于拟态弧菌不发酵蔗糖（霍乱弧菌发酵蔗糖）。 V-P试验、酒石酸盐及对多粘菌素B的耐药性等也可作为区别这两种弧菌（拟态弧菌和霍乱弧菌）的参考试验。 3．其他（肠道菌疾病检验—肠道属）
①河弧菌、②霍利斯弧菌、③弗尼斯弧菌等可引起急性胃肠炎， ④创伤弧菌可引起重症创伤性感染和原发性败血症， ⑤海鱼弧菌可引起创伤性及耳部感染，
有迹象表明⑥溶藻弧菌与胃肠炎有关系，但还需进一步确定。 三、肠致泻性大肠埃希菌（肠道菌疾病检验—肠道属）
大肠杆菌是人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。
本菌为革兰阴性的短杆菌，其抗原结构有3种，即菌体抗原(O抗原)、包膜抗原(K抗原)和鞭毛抗原(H抗原)。
（1）O抗原是血清分型的基础，目前已发现有170多种，其中一些特殊的血清型具有病原性，能引起人类腹泻，故称为致腹泻性大肠杆菌，
而由其引起之肠炎称致腹泻性大肠杆菌肠炎。世界各地广泛存在本菌感染，婴儿腹泻中检出率较高，在成人中亦可呈散在或暴发流行。 临床表现为：旅游者腹泻或食物中毒。新生儿病房及托幼机构可引起交叉感染而发生流行。
根据发病机制、临床表现、流行病学特征、O抗原血清型及细菌的毒力测定可将致腹泻性大肠杆菌分为5类：
①致病性大肠杆菌(EPEC)、②肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)、③侵袭性大肠杆菌(EIEC)、④出血性大肠杆菌(EHEC)和⑤肠集聚粘附性大肠杆菌(EAggEC)。现将各种大肠杆菌引起之肠炎分述如下： (一)病原学
①肠致病性大肠杆菌(EPEC)的主要毒力因子有菌毛、志贺样毒素(SLTs)和LEE毒力岛。
②肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子为热不稳定毒素、热稳定毒素及与致病性相关的定居因子。 ③肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)在毒力因子和致病机制上与志贺菌基本一致。
④肠出血性大肠杆菌(EHEC)的主要毒力因子有志贺样毒素(SLTs)、溶血素、LEE毒力岛及其他未知的毒力因素。 ⑤肠集聚性粘附大肠杆菌(EAggEC)是一类新发现的致泻性大肠杆菌，目前已知的毒力因子有菌毛和热稳定肠毒素。 (二)临床表现
ETEC（肠产毒性大肠杆菌）感染的主要临床症状是水样腹泻、腹痛、恶心和低热； 日腹泻可达8一12次，可持续4～5天。
EPEC（肠致病性大肠杆菌）的主要临床症状是 发热、不适、呕吐、腹泻，粪便中含有大量粘液而无血，症状可持续2周以上，多引起社区的小型暴发。 EIEC（肠侵袭性大肠杆菌）引起的腹泻在临床症状上与细菌性痢疾不可区分，主要是发热、腹部剧烈疼痛与不适、毒血症、水样腹泻，粪便中有少量
粘液和血。
EHEC（肠出血性大肠杆菌）感染的主要临床症状为突发腹部痉挛性疼痛、不适、初期水样便，进而转为鲜血样粪便、不发热或低热，可伴有上呼吸道
症状，白细胞计数稍高或正常。
EAggEC（肠集聚性粘附大肠杆菌）感染主要与小儿顽固性腹泻有关，症状可持续2周或2周以上。 (三)诊断标准
1、流行病学资料
致泻性大肠杆菌（肠致泻性大肠埃希菌）引起的腹泻一年四季均可发病，夏秋季多发，有不洁饮食(水)和(或)与腹泻患者、腹泻动物、带菌者接触史。如为食物源性则常为集体发病及有共进可疑食物史。 2、临床表现
腹泻：大便每日≥3次，粪便的性状异常，可为稀便、水样便、粘液便、脓血便，可伴有恶心、呕吐、食欲不振、发热、腹痛及全身不适等。病情严重者会引起脱水、电解质紊乱甚至休克。（已除外霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒）。 3、实验室检查
(1)粪便常规检查：粪便可为稀便、水样便、粘液便、血便或脓血便，镜检可见多量红白细胞，亦可有少量或无细胞。 (2)病原学检查：粪便中可检出肠致泻性大肠杆菌（EPEC）或检出特异性抗原、核酸或从血清中检出特异性抗体。
临床诊断：ETEC（肠产毒性大肠杆菌）感染的主要临床症状是水样腹泻、腹痛、恶心和低热； 日腹泻可达8一12次，可持续4～5天。
致泻性大肠杆菌（肠致泻性大肠埃希菌）引起的腹泻一年四季均可发病，夏秋季多发，有不洁饮食(水)和(或)与腹泻患者、腹泻动物、带菌者接触史。如为食物源性则常为集体发病及有共进可疑食物史。
病原诊断：临床诊断腹泻：大便每日≥3次，粪便的性状异常，可为稀便、水样便、粘液便、脓血便，可伴有恶心、呕吐、食欲不振、发热、
腹痛及全身不适等。病情严重者会引起脱水、电解质紊乱甚至休克。（已除外霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒）。
4．鉴别诊断
由肠致病性大肠杆菌（EPEC）引起的肠炎需要与下列疾病进行鉴别诊断： ①痢疾、②沙门菌肠炎、③空肠弯曲菌肠炎、④病毒性肠炎、⑤幼儿急疹等。 由肠产毒性大肠杆菌引（ETEC）起的肠炎需要与下列疾病进行鉴别诊断 主要与①霍乱鉴别，其次需要与②病毒性肠炎以及③沙门菌肠炎鉴别。 由肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）引起的肠炎需要与下列疾病进行鉴别诊断
与细菌性痢疾非常相似（肠侵袭性大肠杆菌与细菌性痢疾非常相似），很难鉴别，确定诊断需要有EIEC（肠侵袭性大肠杆菌）血清凝集试验阳性，
同时大便培养所得的大肠杆菌作豚鼠角膜试验阳性。（总结：EIEC血清凝集试验阳性与大便培养所得的大肠杆菌作豚鼠角膜试验阳性才能诊断） (四)、治疗
1．肠致病性大肠杆菌（EPEC）引起的肠炎的治疗采取抗菌消炎、控制腹泻、纠正脱水酸中毒等综合措施。
(1)饮食疗法：基本同轮状病毒肠炎。目前对腹泻病儿多主张继续喂养，在脱水较重时，可暂不喂养。用静脉输液或口服补液疗法(ORS)纠正
脱水及电解质紊乱。待脱水基本纠正，病儿有食欲时即可开始母乳喂养，母乳中IgA对大肠杆菌有一定抑制作用。 人工喂养患儿可用l／2牛奶，或脱脂奶与米汤混合，定时定量喂养，2个月以上婴儿，每4小时喂1次，夜间可免喂1次。 逐步提高牛奶浓度及增加总量，经5天左右恢复至病前饮食。
病情越重、年龄越小者，肠道功能恢复越慢，计划饮食时间需要适当延长。
(2)液体疗法：按患儿脱水程度，脱水性质(多为等渗，少数为低渗，高渗罕见)及代谢性酸中毒轻重，制定输液计划，初6～8小时补充累计损
失量，可分批静脉滴人，等渗脱水的补液，总张力为1／2～2／3张，低渗脱水为2／3张至等张。 有尿后，注意钾的补充。有佝偻病时可适当补钙。轻、中度脱水，也可采用()RS（口服补液疗法）补液。 脱水纠正，继之以l／3～1／4张的液体补充生理需要。
(3)抗菌药物：成人轻型病例可不用抗生素。通过调整肠道正常菌群而自愈。婴幼儿一般均需用敏感抗生素。既往用新霉素口服治疗，疗效极
佳，现多已产生耐药。口服庆大霉素或多粘菌素E有一定效果，但远不如当初的新霉素。
目前临床上试用①诺氟沙星、②环丙沙星或③盐酸黄连素，另加④甲氧苄啶(TMP)等治疗；疗效有待进一步证实。
(4)对症治疗及支持疗法：有人报道用山莨菪碱足三卫八位封闭可减少便次。胃蛋白酶、胰酶、鞣酸蛋白、中药肥儿散等，可促进大便性状好
转并加强消化功能，但尚需临床实践证实。对于重症及营养不良患儿，可少量多次输血或白蛋白，以改善伞身状况。
(5) 护理：保持肛周皮肤清洁于燥，防止臀红及肛周脓肿。臀红外线局部烤干，肛周花粉、鞣酸软膏等。 2．肠产毒性大肠杆菌（ETEC）引起的肠炎的治疗。
ETEC为有自限性倾向的疾病，轻者可不用抗生素治疗，重者使用抗生素可缩短病程及排菌时间。
主要选用①环丙沙星或②诺氟沙星，合并用思密达或盐酸黄连素。剂量同EPEC（肠致病性大肠杆菌）肠炎的治疗。 本病治疗重点是纠上脱水、酸中毒和低血钾症。 轻症可用ORS液（口服补液疗法），
重者需要静脉补液．首选“5：4：1”液，即每1000ml液体加氯化钠5g、碳酸氢钠4g、氯化钾1 g。
3、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）引起的肠炎的治疗，同细菌性痢疾的治疗，重症者应用抗生素。
4、肠出血性大肠杆菌（EHEC）引起的肠炎的治疗，是否应该使用抗菌药，学术上尚无定论。有学者提出，抗菌药对本病不能缩短病程，不能减少
并发症的发生，甚至有可能促进释放Vero毒素，导致合并溶血性尿毒症综合征(HUS)的发生，因此提出要避免使用抗牛素。但也有学者提出，原则上可按其他感染性腹泻来处理。重症应使用抗生素，如①环丙沙星、②盐酸黄连素等； 轻症，可采用肠黏膜保护剂①思密达或②微生态凋节剂。同时，注意，纠正脱水，加强支持疗法。 合并溶血性尿毒症综合征(HUS)者，按HUS（溶血性尿毒症综合征）抢救。
HUS的治疗：
(1)治疗肾衰：按急性肾衰处理，保证足够热量，严格限制人量，每日液体总量为前一天的丢失量加300—500mi，
儿童加400ml／m2体表面积。必要时血液透析。无尿24小时以内者。透析效果好。
(2)输血：血红蛋白50g/L以下者静脉输新鲜红细胞，以次2.5～5ml/kg每6～12小时1次，维持血红蛋白在7()～80g/L。必要时输血小板。 (3)其他：肝素与激素的应用，学术上有不同看法，应慎用。
5．肠集聚粘附性大肠杆菌（EaggEC）引起的肠炎的治疗，同肠致病性大肠杆菌（EPEC）引起的肠炎的治疗。
(五)监测：感染性腹泻属于中国丙类传染病，在各省没有监测点，负责对包括肠致泻性大肠杆菌性腹泻在内的感染性腹泻的监测工作。
肠致泻性大肠杆菌（EPEC）的监测工作主要是对腹泻患者、重点人群、食品、粪便、苍蝇等进行监测。在监测点内对改水、粪管等措施的落
实情况及其他防疫措施作出科学评价。 (六)控制措施 1．预防措施
(1)健康教育：利用多种形式深入开展健康教育，宣传讲究卫生，减少疾病发生。(2)预防接种：目前尚没有成熟的、可供大范围使用的疫苗。 (3)预防原则：应以改善公共卫生条件、切断传播途径为主，同时加强对传染源的管理，采取综合性预防措施，对重点人群、集体单位应特别注
意预防暴发和流行。
2．患者、接触者及其直接接触环境的管理，发现患者及时报告；立即隔离及治疗患者；采样做病原学或血清学检查，尽快查明病原；对患者的
呕吐物、排泄物随时消毒；对患者直接接触的环境进行消毒；对接触者进行管理，必要时给予预防服药。
3、流行期措施：流行期应采取紧急措施，加大宣传教育的力度和范围。医疗机构做到早诊断，早报告。对患者做好隔离、消毒知识的宣传，落实各项消毒措施，防止交叉感染。加强卫生监督，管好食品和集市贸易，进行饮水消毒。对暴发疫情应立即作出疫情报告，卫生防疫部门应尽快查
明暴发原因，采取果断措施切断传播途径，防止疫情蔓延。
致泻大肠埃希菌检验
一、增 菌
样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。
以无菌手续称取检样25g，加在225ml营养肉汤中，以均质器打碎1分钟或用乳钵加灭菌砂磨碎。
取出适量，接种乳糖胆盐培养基（测大肠菌群的培养基），以测定大肠菌群MPN，其余的移入500ml广口瓶内，于36℃土1℃培养6小时。 挑取l环，接种于1管30ml肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18小时。 二、分 离
将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯
或伊红美蓝平板，于36℃±1℃培养18～24小时，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
三、生化试验
1、自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。
同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7．2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。 2．TSI（三糖铁琼脂）斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希菌。
TSI（三糖铁琼脂）底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任意一项为阳性的培养物，均非大肠埃希菌。必要时做氧化酶试验和革兰染色。
四、血清学试验
1、假定试验 挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的琼脂培养物，
1致病性大肠埃希菌、◇2侵袭性大肠埃希菌和◇3产肠毒素大肠埃希菌多价O血清和◇4出血性大肠埃希菌O157血清做玻片凝集试验。 用◇
当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清作试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。 2、证实试验 制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。
原效价为1：160～1：320的O血清，用0.5％盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，作单管凝集试验。
混匀后放于50℃水浴箱内，经16小时后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。 四、沙门菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
(一)病原学：
沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道中，生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌。目前至少有67种O抗原和2000个以上的血清型，但
对人致病的仅少数，如引起①肠热症的伤寒、②副伤寒甲和③乙沙门菌，以这类菌的感染最多见（①肠热症的伤寒、②副伤寒甲和③乙沙门菌） 其他对动物致病，有些菌种偶儿可传染给人，引起食物中毒或败血症，如①鼠伤寒沙门菌（最常见）、②肠炎沙门菌、③鸭沙门菌、④猪沙门菌等，其中以鼠伤寒沙门菌最常见。
沙门菌属除鸡沙门菌和雏chu沙门菌，都有周身鞭毛。一般无荚膜。营养要求不高，在普通平板上形成中等大小、五色半透明的S型菌落。
沙门菌属不发酵乳糖或蔗糖。大多产生硫化氢。对葡萄糖、麦芽糖和甘露醇发酵，除伤寒沙门菌产酸不产气外，其他沙门菌均产酸产气。
1伤寒沙门菌(一十一一)、○2甲型副伤寒沙门菌(一十一一)、○3乙型副伤寒沙门菌(一十一V)和○4鼠伤寒沙门菌(一十一V)的IMViC(吲哚形成、○
甲基红反应、VP反应和枸橼酸盐利用试验) 的结果分别为一十一一、一十一一、一十一V、一+一V。沙门菌的生化检验主要用于菌属鉴别。 伤寒沙门菌与大肠埃希菌在糖发酵方面的主要差别之一在于伤寒沙门菌不分解乳糖。(大肠埃希菌分解乳糖) 对沙门菌的选择分离培养可用SS琼脂，在SS琼脂上其菌落呈现微黄色或无色。
在发病早期(一般l周内)可从血液中分离到该菌，且此时从血液中的分离率最高；l周后可从粪便或尿中分离到，发病第3周时采取粪便标本进行病原分离率最高；骨髓培养是细菌学确诊的最好方法，在发病第1周时也较高，检出率可达到90％以上。胆汁标本也可以进行分离。
1即O抗原、○2H抗原和○3K抗原， 沙门菌属抗原非常复杂，其分类也很复杂。完整的血清学分类仅包括具有分类诊断意义的3类抗原：○
1Vi抗原和○2M抗原（○1Vi抗原和○2M抗原属于K抗原）另外K抗原又有两种，即○。
O抗原系耐热性菌体抗原，由多糖—磷脂复合物组成； H抗原系不耐热抗原，存在于鞭毛中，由鞭毛素组成；
K抗原存在于荚膜或被膜中，其中Vi抗原是覆盖在细菌细胞壁LPS（脂多糖）外的荚膜多糖抗原。 伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌具有Vi抗原。
O抗原由多个成分组成，引起人类疾病的沙门菌大多数属A—E组，O抗原刺激机体产生IgM类抗体。
H抗原分第1相和第2相，第l相特异性高，第2相特异性低，每组内根据H抗原不同可再分为种或型，H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体。
伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌等少数菌新从患者标本中分离时有Vi抗原，存在于菌表面，可阻止O抗原与相应抗体的凝集反应，抗原性弱，刺激机体产生的抗体效价低，当体内有菌存在时有一定量抗体，细菌清除后，抗体随之消失，故测定（Vi抗原属于K抗原分类）有助于检出伤寒带菌者。 同一种或同一血清型的沙门菌，有时可用噬菌体进一步分为若干噬菌体型，在流行病学上可用于追踪传染源和调查传播途径。
1H—O、○2S-R、○3V-W变异和位相变异。 沙门菌的抗原有时发生变异，这对菌型诊断及在制备菌苗上有重要意义，变异的类型包括○
肥达试验为用已知的伤寒沙门菌O、H和甲、乙型副伤寒沙门菌H抗原与不同稀释度的待检血清作定量凝集试验，根据抗体的含量和动态变化 以辅助临床诊断伤寒病原菌的一种血清学试验。在病起的第2周，血清中抗体就可有较明显增多，恢复期达到高峰。
一般O凝集价≥l：80，H凝集价≥l：160时才有诊断价值，有时单次效价增高不能定论，病程中应逐周复查，若效价依次递增或恢复期效价增加≥4才有意义。IgM类O抗体出现较早，持续约半年，消失后不易受伤寒等病原菌的非特异性抗原刺激而重新出现。IgG类H抗体出现较晚，维持时间长达数年，消失后易受非特异性抗原刺激而能短暂重现。因此若O、H凝集效价均超过正常值，则伤寒或副伤寒感染的可能性大；如两者均低，则患伤寒的可能性甚小；若O不高H高，有可能是预防接种或是非特异性回忆反应；如O高H不高，则可能是感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌(如肠炎沙门菌)。少数病例，在整个病程中，肥达试验始终在正常范围内，可能是早期使用大量抗生素，或患者免疫功能低下等因素。 (二)流行病学
人是伤寒副伤寒的贮主，少数情况下，家畜家禽也可能是副伤寒的贮主。该病潜伏期一般为1—3周，由患者、带菌者的粪便或尿污染食物和水而传播。传播因素还包括生活用品、苍蝇等，还可经接触动物传播。
未感染过或未接种过菌苗的人或动物均易感，伤寒沙门菌为胞内寄生菌，病愈后有较牢固免疫力。 (三)临床表现
1、伤寒和副伤寒沙门菌：由伤寒沙门菌，副伤寒甲、乙、丙沙门菌引起。前驱期症状有 发热、不适、全身疼痛等。
主要临床表现为持续高热，出现相对缓脉，肝脾肿大，全身中毒症状显著，皮肤出现玫瑰疹，外周血白细胞明显下降。严重的有出血或肠穿孔并发症。肾中的细菌可随尿排出。以上病变在疾病的第2～3周出现。若无并发症，自第2周以后病情开始好转。
2、炎型(食物中毒)沙门菌：是最常见的沙门菌感染，由摄人大量鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌等污染的食物引起。
潜伏期6—24小时。主要症状为发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，一般在3～5天内较快恢复。 偶尔低热持续，腹泻不停，可长达10一14天。病后很少有慢性带菌者。常为集体性食物中毒。
3、败血症沙门菌：多见于儿童或免疫力低下的成人。病菌以猪霍乱沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等常见。
症状严重，有高热、寒战、厌食和贫血等。肠道中的病菌人血，转移至多个组织、器官导致感染， 例如脑膜炎、骨髓炎、胆囊炎、心内膜炎等，但胃肠炎很少见。
(四)预防
应切实采取以切断传播途径为主导的综合性措施，开展群众性健康教育，认真开展以“三管一灭’’(管水、管食物、管粪便和消灭苍蝇)为中心的群众性卫生活动，防止水源和食品污染。对伤寒的预防，疫苗的接种也是措施之一。目前我国普遍使用的（伤寒疫苗的接种）伤寒疫苗为Vi疫苗。 （五）实验室：沙门菌检验 1、前增菌和增菌
冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。 2、分离
取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或LS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36℃±1分别培养18～24小时(DHL、HE、WS、SS)或40—48小时(BS)，观察各个平板上生长的菌落特征。 3、生化试验
（1）．自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果不同。
1在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除， ○其他的反应结果均有沙门菌的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。
（2）、在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照
培养基各1管，于361℃±1培养18～24小时，必要时可延长至48小时，按表7—3判定结果。（看结果在后面） 4、血清学分型鉴定 （1）抗原的准备
一般采用1.5％琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如2.5％～3％)培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时， 可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
H抗原发育不良时，将菌株种在0.7％～8％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；
或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管l一2次，自远端取菌培养后再检查。
（2）O抗原的鉴定
用A—F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
被A—F多价O血清凝集者，依次是O4；O3、10；O7；O8；O9；O2 和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。
被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、()15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括
的O群血清逐一检查，以确定()群。 （3）H抗原的鉴定
属于A～F各O群的常见菌型，依次用H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
不常见的菌型，先用163种沙门菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各
种H因子血清逐一检查，以确定第l相和第2相的H抗原。
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。
检出第1相H抗原而末检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只
检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必作位相变异检查。 位相变异试验方法如下：
(1)小玻管法：将半固体管(每管约1～2m1)在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05～0.1ml，加入溶化的半固体内，混匀后，用
毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而于缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清l：200～1：800的量加入。
(2)小倒管法：将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口，不要平齐)放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。
临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀；
俟（si等待的意思）凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半
固体表面取菌检查，或转种1％软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。
简易平板法：将0.7％～0.8％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清l环，滴在半因体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清
部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
(4)、Vi抗原的鉴定：用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：①伤寒沙门菌，②丙型副伤寒沙门菌，③都柏林沙门菌。
5、菌型的判定和结果报告：综合上述生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照常用沙门菌抗原表或有关沙门菌属抗原表判定菌型，并报告结果。
表7-3 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表
反应 序号 A1 A2 A3 A4 硫化氢 ( H2S ) 十 十 十 十 靛基质 一 十 一 十 PH7.2尿素 一 一 十 十 氰化钾 （ KCN） 一 一 十 十 赖氨酸 脱羧酶 十 十 一 一 判 定 菌 属 沙门菌属 沙门菌属（少见）缓慢（爱德菌） 弗劳地柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌 普通变形杆菌 沙门菌属、大肠埃希菌、甲型副伤寒B1 一 一 一 一 十 沙门菌、大肠埃希菌、志贺菌属 同上 补做ONPG。ONPG+为大肠埃希菌，ONPG-为沙门菌。同时，沙门菌应为赖氨酸+，但甲型副伤寒沙门菌为赖氨酸一。 备注 是典型反应判定为沙门菌属 补做甘露醇和山梨醇试验。 B2 B3 一 一 一 一 一 一 十 一 一 一 一 一 十/一 十 一 一 一 十 十 一 十 一 十 一 大肠埃希菌、大肠埃希菌、志贺菌属 大肠埃希菌、大肠埃希菌、志贺菌属 克雷伯菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌 克雷伯菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌 B4 一 十 十/一 十 一 摩根摩根菌、普罗菲登斯菌属 注：①三糖铁琼脂底层均产酸；不产酸者可排除，斜面产酸与产气与否均不限。②KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。 ③+表示阳性；一表示阴性；+／--表示多数阳性，少数阴性。
五、志贺菌属（肠道菌疾病检验—肠道属） (一)病原学
志贺菌为肠杆菌科志贺菌属，革兰阴性，需氧，无鞭毛、不能运动，引起细菌性痢疾。
根据抗原结构的不同，分为A、B、C、D四群，其中A群为痢疾志贺菌，B群为福氏志贺菌，C群为鲍氏志贺菌，D群为宋内志贺菌。
1其表面结构脂多糖、○2细菌侵袭性以及○3分泌的志贺毒素。 志贺菌的主要毒力因素包括：○
志贺毒素由A和B亚单位组成，A亚单位是毒素的活性部位，能抑制蛋白合成。
1神经毒、○2细胞毒和○3肠毒性。目前已知各群志贺菌的侵袭相关基因都位于质粒上。 志贺菌A群Ⅰ型产生的志贺毒素具有○
志贺菌在普通琼脂平板上生长形成中等大小、半透明的光滑型菌落(D群的宋内志贺菌：培养中常出现扁平的粗糙型菌落)。
其O抗原为群特异性抗原，K抗原为型特异型抗原，分解葡萄糖，产酸不产气，不分解乳糖。
（总结 志贺菌：革兰阴性，需氧，无鞭毛、不能运动、分解葡萄糖，产酸不产气，不分解乳糖，在普通琼脂平板上生长形成中等大小、半透明
的光滑型菌落，D群的宋内志贺菌：培养中常出现扁平的粗糙型菌落）
(二)流行病学
志贺菌菌型较多，菌群分布随国家、地区、年份的不同而有不同，基本上发展中国家以A、B、C群多见，而发达国家以D群感染为主。 目前在我国以B群福氏志贺菌为多，其次是D群。患者和带菌者是传染源，病菌随患者或带菌者粪便排出，通过污染食物、水、生活接触或借苍蝇传播等，使易感的接触者发病。人对志贺菌较易感，10～200个细菌就可使10％～50％志愿者致病。志贺菌痢疾（A群为痢疾志贺菌）在中国全年均有发生，以夏秋两季多见。
志贺菌感染的一些特点包括：（A群）痢疾志贺菌感染患者病情较重，（D群的）宋内志贺菌多引起轻型感染，（B群）福氏志贺菌感染易转变为慢性；急性中毒性菌痢以小儿多见；感染后免疫期短。
(三)病原分离
取新鲜粪便粘液或脓血部分接种于SS琼脂选择培养基上，并按常规鉴定菌群与菌型。注意在三糖铁培养基上，痢疾志贺菌与伤寒沙门菌的表
现相似。需要增菌时，如自可疑食品中进行分离，可先用GN增菌液增菌，提高检出率。
(四)诊断标准
细菌性痢疾的（志贺菌）诊断原则为依据流行病学史、症状、体征及实验室检查进行综合诊断，确诊则需依赖于病原学检查。
1急性非典型菌痢、○2急性典型菌痢、○3急性中毒型菌痢和○4慢性菌痢。 志贺菌根据症状体征可诊断为○
志贺菌感染病程在2个月以上属慢性。
(五)防治原则
1．预防：应以切断传播途径为主，同时加强对传染源管理的综合性防治措施。对重点人群、集体单位应特别注意预防暴发或流行。
2．治疗：一般对症治疗中注意进易消化饮食，注意水电解质平衡，可给口服补液盐(ORS)，必要时ORS（口服补液盐）和静脉输液同时应用。
病原治疗中，细菌性痢疾可以是自限性的，一般情况下可以不使用抗生素。对症状比较严重的患者，抗生素治疗可缩短病程、减轻病情和缩短排菌期。对休克型菌痢进行抗感染、抗休克处理。对脑型菌痢需抗感染、防治脑水肿和呼吸衰竭。
（六）实验室志贺菌检验
1、增菌
称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500ml广口瓶内，固体食品用均质器以8000～10000转／分打碎1分钟，或用乳钵加灭菌砂磨碎，
粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8小时。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 2、分离和初步生化试验
（1）、取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取l环划线接种子麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个，
于36℃培养18～24小时，志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
（总结：志贺菌在HE琼脂平板或SS琼脂平板：麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板（志贺菌）在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落）。 （2）、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24小时，分别观察结果。 （3）、下述培养物可以弃去。
○1在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物。
○2在18～24小时内发酵乳糖、蔗糖的培养物。（因为志贺菌不发酵乳糖、蔗糖的培养物）
○3不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物。（因为志贺菌分解葡萄糖和不能只生长在半固体表面的培养物） ○4产气的培养物。（因为志贺菌产酸不产气）
○5有动力的培养物。（因为志贺菌无鞭毛、不能运动所以无动力的培养物）
○6产生硫化氢的培养物。（因为志贺菌不产生硫化氢的培养物）
（4）凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
3、血清学分型和进一步的生化试验 （1）、血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺菌，则用群和型因子血清分别检查。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。 4种志贺菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。 如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。 （2）进一步的生化试验
在作血清学分型的同时，应作进一步的生化试验，
1葡萄糖铵，○2西蒙柠檬酸盐，○3赖氨酸和○4鸟氨酸脱羧酶，○5pH7.2尿素，○6KCN生长，以及○7水杨苷的分解。 即：○
除宋内菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺菌属的培养物均为阴性结果。
必要时还应做革兰染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺菌属的培养物。
已判定志贺菌属的培养物，应进一步作5％乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺菌属4个生化群的培养物，应符合该
群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。
3、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
六、小肠结肠炎耶尔森菌病（肠道菌疾病检验—肠道属）
小肠结肠炎耶尔森菌病是近年来在国际上颇受重视的——种新的传染病，是目前较为常见的腹泻病种之—（是小肠结肠炎耶尔森菌病）， 该病在（小肠结肠炎耶尔森菌病）世界范围内均有发现，在中国20世纪80年代有两次大的暴发（是小肠结肠炎耶尔森菌病）。
1消化系统、2呼吸系统、3心血管系统、4骨骼结缔组织等局部组织和全身疾患，小肠结肠炎耶尔森菌病除肠道症状外（有肠道症状），还能引起○○○○
极少数情况下可引起败血症，有时造成死亡。 (一)病原学
小肠结肠炎耶尔森菌病，是由小肠结肠炎耶尔森菌感染引起的。，与鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌构成了这个属的3个主要致病种
1小肠结肠炎耶尔森菌病、○2鼠疫耶尔森菌、○3假结核耶尔森菌）（○，为革兰阴性小杆菌，对营养要求不严格，在0℃～42℃时均可生长， 1小肠结肠炎耶尔森菌病、○2鼠疫耶尔森菌、○3假结核耶尔森菌）是肠道致病菌中能在4℃生长的少数细菌之一（○。
小肠结肠炎耶尔森菌的鉴定主要依靠27种生化反应和动力试验，本病原体在37℃生长时无动力，而在25℃~28℃生长时有动力形成。该病原体常污
染多种食品和水源。 （总结：小肠结肠炎耶尔森菌是由小肠结肠炎耶尔森菌感染引起的，该菌属于肠杆菌科，耶尔森菌属。小肠结肠炎耶尔森菌是 肠道致病菌中能在4℃生长的少数细菌之一，37℃生长时无动力，而在25℃~28℃生长时有动力形成。腹泻病种之—） 小肠结肠炎耶尔森菌有如下特征：
1、抗原：这种病原体有革兰阴性肠杆菌特异性的多糖抗原和肠道菌的共同抗原，小肠结肠炎耶尔森菌血清型是根据脂多糖O抗原确定的。现在国际
上常报告的有57个抗原因子，将小肠结肠炎耶尔森菌分成50多个血清型。
2、V、W因子：由质粒编码的抗原，是—种毒力决定因子，也是毒力的标记。小肠结肠炎耶尔森菌在37℃生长时需要钙离子（小肠结肠炎耶尔森菌），
而在25℃～28℃生长时不需要钙离子（小肠结肠炎耶尔森菌）。
3、自凝性：小肠结肠炎耶尔森菌在含有10％小牛血清的组织培养液内37℃培养1天，发生自凝，而在25℃则不发生自凝。
目前的研究已证实这种自凝作用是由质粒编码的外膜蛋白A(YOPA)引起的。（YOPA—外膜蛋白A）
4、侵袭性：小肠结肠炎耶尔森菌能侵入肠上皮细胞，并且能侵入到人工培养的Hep-2及Hela细胞内，这种侵入性是由染色体编码的侵袭素所决定的。
目前还发现染色体上有另一基因位点，称作粘附侵袭位点(ail)，编码的—种蛋白质，是介导低水平的粘附侵袭作用。
5、外膜蛋白：小肠结肠炎耶尔森菌都具有一个约60kb的质粒，编码10多种外膜蛋白(YOPs)，现已证实这些外膜蛋白中的—些与致病密切相关。
有关小肠结肠炎耶尔森菌病原体的研究还在不断深入。 (二) 临床表现：
1、急性肠炎和急性胃肠炎：是小肠结肠炎耶尔森菌病最常见的临床类别，表现为腹泻和发热，病情轻重不一，部分患者伴有腹痛和呕吐。 2．有类似于阑尾炎的症状：有报道在外科手术后的阑尾内容物中分离别小肠结肠炎耶尔森菌。
3、慢性反应性关节炎及结节性红斑：这两种症状（慢性反应性关节炎及结节性红斑）引起的机制可能相似，很有可能都是该菌肠道感染后的迟发型
免疫后遗症。目前的研究发现，小肠结肠炎耶尔森菌质粒编码的外膜蛋白A(YopA)是引起关节炎的关键因素，有学者推测该菌产生的超抗原也是引起这两种症状（慢性反应性关节炎及结节性红斑）另一个原因。
4、耶氏肝炎：前苏联和我国学者都发现该菌感染可引起肝炎，称“耶氏肝炎”。这种病原体引起的与②病毒性肝炎症状相似。区别是前者（①肝炎）
高热、抗生素治疗效果显著，然后根据血清学和病原体检测作出进一步诊断。
5、其他： 还有一些少见症状，如败血症等全身性症状。这些症状虽然少见，但死亡率较高。 (三)诊断标准
对小肠结肠炎耶尔森菌病的确诊主要依靠病原体分离及血清学诊断。
在未分离到病原体之前，应根据临床症状(先有发热、腹泻，不久发生咽喉炎、扁桃体炎、颈部淋巴结肿大、关节炎以及结节性红斑等)作出初步诊断。目前还发展了一些分子生物学方法，以利于对该菌的感染作出快速诊断，如PCR技术(聚合酶链反应)，针对于外膜蛋白的单克隆抗体检查技术等。但这些方法推广却受到一定限制。
(四)治疗原则： 一般说来小肠结肠炎耶尔森菌感染症状较轻，主要采取支持疗法，症状很快消失。对于一些严重病例，特别是一些肠外型的感染应及
时采用抗生素治疗。链霉素和庆大霉素是临床上常用的药物。（小肠结肠炎耶尔森菌常用的药物是链霉素和庆大霉素）
(五)监测：小肠结肠炎耶尔森菌常存在于一些冷藏食品中，这类感染通常称作“冰箱病”因此食品检验是对该菌最好的监测方法。
(六)控制措施：1．控制传染源：(1)发现和治疗患者，执行隔离制度，以免病菌扩散。(2)在我国，牛、猪等家畜是主要的传染源，加强管理，防止排泄物
污染水源和食物。(3)有一些鼠类和昆虫也是携带有对人类致病性的小肠结肠炎耶尔森菌，因此消灭也是防治该病的主要环节。
2．切断传播途径：(1)加强环境卫生管理。 (2)保护水源。
3．个人防护：(1)讲究个人卫生，不食不洁食物，防止病从口入。 (2)不喝牛水(水源极易被该菌污染)和未消毒的牛奶。
七、空肠弯曲菌（肠道菌疾病检验—肠道属） (一)病原学：
弯曲菌为革兰阴性菌，为严格的微需氧菌。镜下观察菌细胞末端是尖的，且形态细长，呈弧形、螺旋形或“海鸥展翅”状，一端或两端各有一根鞭毛。(二)流行病学：
弯曲菌为人兽共患病，与人类感染有关的主要是家禽和家畜，也是主要的传染源，患者和带菌者也可以成为传染源。
最常见的传播途径是进食污染的食物和水。人群普遍易感。本病（空肠弯曲菌）的胃肠炎症状表现不一，可由无症状的带菌、轻型腹泻以至严重腹泻，潜伏期为l一10天，多数为3～5天。主要症状有发热、腹泻和腹痛，少数有呕吐等。与细菌性痢疾相似，但病情较轻。 空肠弯曲菌是弯曲菌中最常见的病原菌，感染后可表现为轻微的胃肠炎或重型的小肠结肠炎。 近年报道该菌（空肠弯曲菌）感染与格林巴利综合征的发生密切相关。 (三)病原分离
取新鲜粪便标本或肛拭子插入C—B运送培养基，在24小时内或经增菌后接种于相应抗生素的硫乙醇酸钠培养基（空肠弯曲菌），置42℃、微氧(浓度5％～10％)、高二氧化碳(3％～4％)的条件下培养约48小时。作生化试验和药敏试验以进一步确定细菌种。
蜡样芽胞杆菌检验（形态观察革兰阳性大杆菌有芽胞这是最大的特点）（食品）
一、菌数测定：以无菌操作将检样25g(m1)用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在2个选择性培养基
——甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置36℃±1℃温箱培养12～20小时后选取适当菌落数的平板进行计数，蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌落为粉红色(甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上为粉红色)（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验。根据汁实力蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以其稀释倍数，即得每克(或毫升)样品中所含蜡样芽胞杆菌数，例如MYP（甘露醇卵黄多粘菌素）平板的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为4个，乘以稀释倍数(如104)，再乘以Ig(或m1)检样数(取的是0.1ml样)则为： 25×4／5×104×10＝2×106 二、分离培养
取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基（MYP）（甘露醇卵黄多粘菌素）上，置37℃培养12～20小时，
挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌落接种于肉汤和营养琼脂作成纯培养，然后作证实试验。
三、证实试验
(一)形态观察
本菌为革兰阳性大杆菌（蜡样芽胞杆菌），宽度在1um或lum以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。 (二)培养特性
1本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环，振摇易乳化； ◇
2在普通琼脂平板上生成的菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不齐 ◇
(三)生化性状及生化分型
1、生化性状 本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；
在厌氧条件下能发酵葡萄糖。
2、生化分型 根据蜡样芽胞杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V—P反应、明胶液化性状的试验，将该菌分成不同的型别。
(四)与类似菌鉴别
本菌与其他类似菌(如巨大芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌等)的鉴别。
五、肠毒素试验(食品)
(一)酶联免疫吸附试验（ELISA）检测LT（双抗体夹心法测抗体）和ST（抗原竞争性测定抗原）
1、产毒培养： 将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6ml CAYE 培养基内．37℃振荡培养过夜。
加入20 000u／m1的多粘菌素B 0.05ml，于37℃1小时，离心4000转／分15分钟，分离上清液，加入0.1％硫柳汞0.05ml，于4℃保存待用。 2、LT检测方法(双抗体夹心法)： ①包被：先在产肠毒素大肠埃希菌LT（(双抗体夹心法)和ST（抗原竞争）酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗
体管，加入包被液0.5ml，混匀后全部吸出于3.6ml包被液中混匀，以每孔100ul量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照， 于4℃冰箱湿盒中过夜。②洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。 ③封闭：每孔加100ul封闭液，于37℃水浴中1小时。④洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑤加样本：每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100ul，37℃水浴中1小时。⑥洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑦加酶标抗体：先在酶标LT（双抗体夹心法）抗体管中加0.5ml稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液中混匀，每孔加100ul，37℃水浴中1小时。⑧洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。 ⑨酶底物反应：每孔(包括第1孔)各加基质液100 ul，室温下避光作用5～10分钟，加入终止液50 ul。 ⑩结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，
待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。
3、ST检测方法(抗原竞争性) ①包被：先在包被用ST（抗原竞争性）抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出，于1.6ml包被液中混匀，
以每孔50uL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第l孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。 ②洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。③封闭：每孔加100uL封闭液，37℃水浴1小时。④洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。 ⑤加样本及ST(抗原竞争性)单克隆抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50uL稀释的ST单克隆抗体50uL(先在ST单克隆抗体管中 加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出，于1.6ml稀释液中混匀备用)，37℃水浴l小时。⑥洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。 ⑦加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液中混匀，
每孔加100uL，37℃水浴中l小时。⑧洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑨酶底物反应：每孔(包括第1孔)各加基质液100uL，
室温下避光5～10分钟，再加入终止液50uL。
⑩结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值：
(二)双向琼脂扩散试验检测LT（双抗体夹心法测抗体）：
将被检菌株按5点环形接种于Elek培养基上。以同样操作，共做2份，于36℃培养48小时。
在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6小时，使肠毒素渗入琼脂中。在5点环形菌苔各5mm处的中央，挖1个直径4mm的圆孔，并用l滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT（双抗体夹心法测抗体）抗毒素30uL，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15～20小时观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。 (三)乳鼠灌胃试验检测SI'（(抗原竞争性)
将被检菌株接种于Honda产毒肉汤内，于36℃培养24小时，以3000转／分离心30分钟， 取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30分钟，每lml滤液内加入2％伊文思蓝溶液乱0.02ml。
将此滤液用塑料小管注入l～4日龄的乳鼠胃内0.11ml，同时接种3～4只，禁食3～4小时后用三氯甲烷麻醉， 取出全部肠管，称量肠管(包括积液)重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。
六、结果报告
综合上述牛化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。
八、其 他 属（肠道菌疾病检验—肠道属） (一)克雷伯菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
克雷伯菌属细菌一般不致病，当机体免疫力低下时，能引起多种感染。 对人类关系密切的有①肺炎克氏菌和②臭鼻克氏菌和③鼻硬结克氏菌。
肺炎克氏菌是形态较短粗的革兰阴性杆菌，常见端端排列，无鞭毛，多数有菌毛，有较厚的荚膜。营养要求不高，在普通培养基上生长的菌落大，呈粘液状，相互融合，以接种环挑之易拉成丝。
肺炎克氏菌是除大肠杆菌外的最重要条件致病菌，已成为医源性感染的重要细菌。
存在于人类肠道、呼吸道及水和谷物中，当机体免疫力降低或应用免疫抑制剂，也可因长期大量使用抗生素导致菌群失调而引起感染。常见有支气管炎、肺炎、泌尿道和创伤感染，有时导致严重的败血症、脑膜炎、腹膜炎等。
(二)变形杆菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
变形杆菌属中与医学关系密切的包括①普通变形杆菌和②奇异变形杆菌，为多形性的革兰阴性杆菌，可为球形或丝状，无荚膜，幼龄培养物
中有周身鞭毛，运动活泼。有菌毛，可粘附至植物和真菌细胞表面，但不与动物组织细胞或红细胞表面吸附。 需氧或兼性厌氧。
营养要求不高。在固体培养基上常呈扩散生长，形成以菌接种部位为中心的厚薄交替、同心圆形的层层波状菌苔，称为迁徙xi(迁移的意思)生长现象。在血琼脂平板上有溶血现象。能迅速分解尿素，是本属的一个重要特征。个别菌株发酵乳糖。变形杆菌根据菌种抗原分群，再以鞭毛抗原分型，现至少分为100多个血清型。X19、X2、和XK菌株含有特殊菌体O抗原，可与某些立克次体的部分抗原发生交叉反应， 故可替代立克次体作为抗原与患者血清进行凝集反应，此称为外斐试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等立克次体病。 变形杆菌属在自然界分布广泛，人和动物肠道也经常存在。对人类一般不致病，在特定条件下可单独或与其他细菌混合感染。
变形杆菌是尿道感染最常见菌之一，其尿素酶可分解尿素产氨，使尿液pH增高，碱性环境有利于变形杆菌的生长。肾结石和膀胱结石的形成与变形杆菌属可能也有关，因该菌属可使尿碱化促进磷酸铵镁结石的形成。
变形杆菌还能引起皮肤、耳、乳突小房、眼等局部感染，以及腹膜炎、败血症等，有的菌株可引起食物中毒。
(三)肠杆菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
为革兰阴性的杆菌或球杆菌，具周鞭毛，能运动，有些菌株有荚膜，无芽胞。兼性厌氧，无特殊营养要求，最适生长温度为30℃。 在营养培养基中均匀浑浊，有菌膜。对大多数对糖类产酸产气，但44.5℃只产酸不产气，
IMViC(吲哚形成、甲基红反应、VP反应和枸橼酸盐利用试验) 反应大多为+ + - -。是肠杆菌科中最常见的环境菌群，但不是肠道的常居菌群。在水和日常食品中比埃希菌属更常见，常自尿道感染和败血症时分离出，为机会病原菌（肠杆菌）。（肠杆菌比大肠埃希菌感染更常见） (四)沙雷菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
与医学有关的是①粘质沙雷菌和②液化沙雷菌，革兰阴性菌，具周鞭毛、能运动，一般无荚膜，不产芽胞。
兼性厌氧，营养要求不高，菌落不透明，常呈白色、粉红色或红色。液体培养物形成菌膜。触酶强阳性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖产气或不产气，VP阳性，DNA酶阳性，少数菌株可产生非水溶性红色色素，临床分离的粘质沙雷菌35℃大多不产色，转种22℃培养数天后可恢复产色。为环境常居菌群，常导致医院内感染，为机会病原菌。
(五)哈夫尼菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
只有1个种，即蜂房哈夫尼菌。革兰阴性杆菌，具周鞭毛，无荚膜，不产芽胞。兼性厌氧菌，菌落光滑、湿润、半透明，呈灰色带亮的表面和完整的边缘，最适生长温度为25℃～30℃，本菌的动力和许多生化反应在35℃时为阴性。触酶阳性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖产酸产气。 为周围环境常居菌，常导致医院内感染，为机会性病原菌。 (六)普城菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
革兰阴性菌，两端钝圆，有多形性，有周鞭毛，运动活泼，无芽胞，无荚膜。兼性厌氧菌，在25℃时动力比35℃时好。菌落小而透明， 在含①胆盐培养基上较扁平和透明，在②SS琼脂上产硫化氢，中心黑色（普城菌培养基的生长特点SS）。
液体培养时，培养基均匀浑浊生长，表面有菌膜，管底有沉淀。尿素和苯丙氨酸酶阳性，乳糖阴性，枸橼酸盐和阿东醇阳性，而鸟氨酸阴性。 为常见的环境和肠道寄居的正常菌群，也是医院内感染常见的机会菌，常分离自腹泻和尿道感染。 (七)摩根菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）
革兰阴性菌，在固体和液体培养基上的生长特性与普城菌属的一致。某些株30℃以上不形成鞭毛和不能运动。尿素和苯丙氨酸酶阳性，乳糖阴性，枸橼酸盐和阿东醇阴性，而鸟氨酸阳性。为常见的环境和肠道寄居的正常菌群，也是医院内感染常见的机会菌，常分离自腹泻和尿道感染。
九、寄生虫性腹泻（肠道菌疾病检验—肠道属）
(一)概述人体感染某些寄生虫后，会引起急性腹泻和慢性腹泻，多为慢性腹泻，或在急性发作后经常再发如艾滋病相关性腹泻中，以原虫尤其是最常见的
隐孢子虫引起的感染性腹泻，往往病程迁延，治疗困难，已成为艾滋病死亡原因之一（寄生虫性腹泻）。 去某些地区旅游会导致较高的蓝氏贾第鞭毛虫感染性腹泻。现已知能引起寄生虫性腹泻的寄生虫有50多种。
寄生虫性腹泻的发病机制主要为①渗出型、②渗透型、③分泌型、④脂肪泻及肠外致病等。寄生虫性腹泻与其他肠道病原体引起的腹泻往往难以鉴别，但有些流行病学和临床体征方面还是有差别的，主要表现在（寄生虫性腹泻）：潜伏期长，起病缓慢；呈地方性分布特征；发热少见；在艾滋病相关腹泻中常见；蠕虫性腹泻患者外周血嗜酸性粒细胞增多；确诊须依据病原学检查；针对病原治疗有效。
(二)阿米巴痢疾（寄生虫性腹泻—肠道菌疾病检验）
其病原体为溶组织内阿米巴，感染者中有90％为无症状的携带者，约10％的感染者由于阿米巴滋养体侵袭肠壁组织引起腹痛、腹泻、粘液血便等症状。本病易复发、迁延成慢性。如病原体由肠道借血流或直接蔓延而侵入肠外组织，则产生相应脏器的阿米巴病等肠外并发症。最常见为①阿米巴肝脓肿，其次还有②阿米巴肺脓肿、③脑脓肿及其他部位的脓肿。溶组织内阿米巴有①滋养体和②包囊二期。
滋养体又分为大小两型①寄生于结肠肠腔或肠壁内，以二分裂法繁殖。主要传染源为无症状带包囊者、慢性患者和恢复期患者其粪便中不断排出包囊。
②急性期患者主要排出包囊，故不成为主要传染源。该病的传播主要通过包囊污染饮水、食物等而感染。污染的手、苍蝇、蟑螂等可携带包囊而传播。粪便中检出阿米巴滋养体或包囊是确诊的重要依据。
(三)蓝氏贾第鞭毛虫（寄生虫性腹泻—肠道菌疾病检验）
蓝氏贾第鞭毛虫属于寄生于肠道的一种鞭毛虫，营二分裂繁殖。其生活史分①滋养体和②包囊两个时期，与之相应，其形态也有这两种。
①滋养体如同纵切的半个梨，背面隆起，腹面扁平，其前半部向内凹陷形成吸盘，以此吸附于肠壁。虫体左右对称，有4对鞭毛，依靠这些鞭毛的摆动，虫体运动非常迅速。②包囊为椭圆形，囊壁厚，碘液染色后呈黄绿色。未成熟的包囊内有2个核，成熟的包囊内有4个核。囊壁内的虫体除游离的自由鞭毛消失外，其他结构与滋养体类同。蓝氏贾第鞭毛虫所致腹泻中，人是该病的主要传染源，该病发生多见于环境卫生差、医疗水平低的地区。该病多为自限性。人感染蓝氏贾第鞭毛虫后，临床表现多样。许多人不表现任何症状，出现症状者也有轻有重。该虫寄生于小肠上段，大量滋养体吸附于肠黏膜上，影响吸收功能，造成机械刺激以及破坏肠上皮微绒毛，出现的全身症状体征可有失眠、头痛、乏力、眩晕、神经兴奋性增高等，
胃肠道症状有：腹泻、腹痛、厌食等，腹泻可为急性、更多见慢性，并由此可导致贫血、发育不良、体重下降。如不重视，这种腹泻可反复发作，病程可达数年。有些感染者会出现亚急性症状，主要表现为间歇性稀便、腹部疼痛、食欲不振等。本病为旅游者腹泻的常见原因之一（蓝氏贾第鞭毛虫）。
另外该虫进入阻管系统可能会引起胆囊炎。在粪便或十二指肠液中检查到滋养体或包囊才可确诊（蓝氏贾第鞭毛虫），而且不能仅靠单份标本作出诊断。蓝氏贾第鞭毛虫引起的感染性腹泻中，在稀水样便中一般可用生理盐水涂片镜检查到滋养体，还可用碘液涂片法检查包囊。粪便阴性不能排除本病，直接镜检或离心浓缩后检查十二指肠引流液可提高检出率，对诊断胆道蓝氏贾第鞭毛虫病有特殊意义。另有还有①小肠活检、②肠检胶囊法等。 第二节 呼吸道疾病病原学检验 一、呼吸系统防御机制：
呼吸系统是机体与外界环境持续接触、表面积最大的器官和系统。呼吸系统的防御机制可分①为非特异性防御和②特异性防御两大类。 (一)呼吸系统的非特异性防御机制：
1、机械物理性防御①解剖屏障：鼻腔由假复层纤毛柱状上皮细胞组成，黏膜下层有很多浆细胞，富含IgA②气流动力沉积③粘液纤毛运输④咳嗽反射。2、体液性防御 ①溶菌酶：多核白细胞颗粒中存在高浓度的溶菌酶，肺泡内存在大量溶菌酶，是一种l，4-β-N-乙酰胞壁质酶；
②铁结合蛋白：有乳铁蛋白和转铁蛋白两种，其作用是犹如铁螯合物阻碍细菌对铁的利用，而起到抑杀菌的作用； ③纤维连接蛋白；④蛋白降解酶；⑤表面活性物质和游离脂肪酸；⑥干扰素；⑦补体；⑧抗体。
3、细胞性防御 吞噬细胞：主要包括①多形核白细胞、②嗜酸性粒细胞、③肺巨噬细胞等。 (二)呼吸系统特异性防御机制
1、免疫器官：①胸腺；②腔上囊；③淋巴结与淋巴小结；④脾。
2、免疫活性细胞 ①T淋巴细胞；②B淋巴细胞；③NK细胞；④巨噬细胞。
3、免疫球蛋白和淋巴因子 ①免疫球蛋白(1g)：B淋巴细胞表面有Ig，各类的Ig的区别主要在于它们分子中重链氨基酸组成和抗原性的不同。 IgG是人血清中的主要抗体，IgG是固定补体，激活补体经典途径。
血清中IgA多为典型4链多肽单体结构，而外分泌液如呼吸道分泌物中的分泌型IgA（SigA）为双聚体IgA，是一种重要的局部抗体，其合成障碍是约有75％的患者并发呼吸道感染。
IgM是感染早期出现的抗体，有很高的结合价和凝集能力。IgE正常人血清中含量少，可引起过敏反应，可能对抗寄生虫感染有很大意义。 IgD功能尚不清楚。②淋巴因子：是活化淋巴细胞分泌的低分子多肽，具有广泛的生物学活性，在免疫应答和调节中发挥作用。 二、呼吸系统病原体的毒力
微生物的致病性是指其引起疾病或导致器官组织进行性病变的能力，是微生物种的特性。
致病力可分为①产毒性和②侵袭力，前者（①产毒性）表示微生物产生毒素的能力，
后者（②侵袭力）是微生物入侵宿主组织并在其中繁殖扩散的能力。
毒力以半数致死量(LD50)测定表示。毒力主要与毒素有关。毒素可分为①外毒素和②内毒素两类。 (一)外毒素（呼吸系统病原体的毒力）
外毒素是细菌分泌的、能从培养的上清液中提取并产生远隔部位作用的毒性物质，（外毒素）属蛋白质类。 按照其与宿主作用的机制可分为下列几类：
①细胞内作用毒素：以A、B白喉外毒素为代表，铜绿假单胞菌也可分泌A、B外毒素；
②膜作用毒素如金黄色葡萄球菌的σ毒素（属于外毒素）毒素，是金黄色葡萄球菌最强的毒力因子之一， 类似的还有化脓性链球菌的溶血素(O和S)等；
③诱导性物质：如金黄色葡萄球菌的中毒性休克综合征毒素和热原性外毒素；
④细胞外酶：某些化脓性细菌还分泌多种胞外酶类，可引起组织损伤，有助于细菌扩散。
(二)内毒素（呼吸系统病原体的毒力）
内毒素是革兰阴性杆菌细胞壁的脂多糖(LPS)成分，为革兰阴性杆菌最重要的毒力因子，
1螺旋体、○2衣原体、○3立克次体和○4个别革兰阳性细菌的细胞壁成分也具有内毒素活性。 ○
内毒素具有下列共同特点：
① 内毒素大多数是属于细胞壁固有成分，少数几种内毒素存在于细胞质中，如百日咳杆菌、鼠疫杆菌等；
1由O异性多糖、②非特异性核心多糖和③类质A三部分组成，类质A是内毒素的主要毒性组分； ② 内毒素的共同化学结构是：○
③ 内毒素耐热，100℃作用l～2小时不被破坏，对酶有抵抗力（内毒素）； ④ 内毒素的毒性较外毒素弱，缺少选择性； ⑤ 内毒素的免疫原性较外毒素弱；
⑥ 内毒素具有多种生物学活性如激活血凝系统等。
三、肺部感染的病原学诊断方法（呼吸道疾病）
肺部感染的病原学诊断技术包括临床标本采集和实验室对病原体的检测两部分，引起肺部感染的病原体有细菌、真菌、衣原体、支原体、病毒和原虫等。常用的检测方法有：包括涂片光镜检查、培养鉴定、组织病理检查、免疫学和分子生物学技术检测等。
临床上应按照疑似或需检测的肺部感染的病原体种类，采集相应的临床标本和采取相宜的实验室检测方法。
(一)病原学诊断标本采集：
人体喉以上呼吸道（肺部感染）黏膜表面及其分泌物含有众多微生物，这些称之为“正常菌群”的微生物有200种以上。
① 革兰阳性球菌：草绿色链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌等； ② 革兰阴性球菌：非致病性奈瑟菌、卡他莫拉菌、脑膜炎球菌； ③ 革兰阳性杆菌：乳酸杆菌、类白喉杆菌；
④ 革兰阴性杆菌：流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、不动杆菌；
⑤ 真菌：主要为念珠菌。一般真菌的标准培养基为沙堡培养基，适宜的生长pH为6.2～7.0。
(二)咳痰标本：
患者用清水反复漱口后，用力咳嗽，从呼吸道深部咳出新鲜痰送检。痰量少时，可用45℃10％氯化钠溶液雾化吸人进行导痰，痰标本采集后应及时送实验室。痰液在室温下延搁2～5小时会降低某些菌的分离率。痰涂片作革兰染色细胞学检查判断痰标本受到污染程度是一种较为可靠的方法。来自下呼吸道的合格的痰标本应是含有脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多。通常将挑取的痰液在系列含有灭菌等渗氯化钠的平板培养皿内顺次漂洗后接种于培养皿内，根据中国《医院内获得性支气管—肺感染诊断标准》，痰定量培养分离的致病菌或条件致病菌浓度≥107cfu／ml，可认为是肺部感染的病原体；
≤104cfu／ml，则为污染菌，界于两者之间，建议重复痰培养。
1、环甲膜穿刺经气管吸引：用于细菌培养的分泌物仅数滴便可，尽量避免吸引前向气管内注射等渗氯化钠注射液。主要并发症为出血、纵隔或皮下
气肿等，主要用于普通需氧菌和厌氧菌引起的肺部感染的病原学诊断，对肺部浸润病灶为感染或非感染因素的鉴别也有一定参考价值。 2、经胸部穿刺肺吸引：操作最好在X线透视定位下进行。针刺后数小时应做胸部X线透视以了解有无并发气胸。 3、支气管肺泡灌洗：作为肺部弥漫性病变以及免疫抑制患者肺部浸润性病变的病因诊断技术已广泛应用于临床。 4、血培养和胸水培养 为一种简单易行的肺部感染病原学诊断方法。但标本培养率相对较低。 四、肺部感染病原菌检测 (一)分枝杆菌属（呼吸道疾病）
分枝杆菌主要特点是细胞壁含有大量脂质，与其染色性、抵抗力、致病性等密切相关，一般不易着色（分枝杆菌），若经加温或因延长染色时间而着色后能抵抗脱色剂盐酸酒精的脱色，故又名抗酸杆菌。
该菌属（分枝杆菌）无鞭毛、无芽胞、无荚膜，不产生外毒素或内毒素，其致病性与菌体成分有关。引起的疾病呈慢性，伴有肉芽肿。 分枝杆菌种类较多，（分枝杆菌）可分为①结核分枝杆菌、②非结核分枝杆菌与③麻风分枝杆菌三类。
(二)结核分枝杆菌（呼吸道疾病） 经青霉素、
环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，又是异烟肼影响细胞壁分枝酸的合成均可导致其变为L型。
（结核分枝杆菌）专性需氧，营养要求较高，生长缓慢。初次培养常用L-J培养基（用于结核分枝），一般10～30天可见菌落生长。 1、抗酸染色：痰涂片抗酸染色光镜检查，对肺结核及其他非典型分枝杆菌感染的及时、初步诊断十分重要。
抗酸染色操作简便、结果快速，是分枝杆菌感染最初的基本检验步骤，也是确认所检细菌为分枝杆菌的重要方法。
1厚涂片法○2浮游集菌法和○3离心沉淀法三种。 根据涂片方法不同可分为○
1厚涂片抗酸杆菌检查结果报告方式： ◇
“一”代表“观察100—300视野未发现抗酸杆菌”，“ +”代表“全视野发现3～9条抗酸杆菌”， “++”代表“全视野发现10～99条抗酸杆菌”， “+++”代表“每油镜视野发现1～9条抗酸杆菌”， “++++”等表示“每油镜视野发现≥10条抗酸杆菌”。
2．分枝杆菌的培养：培养基可采用酸性改良罗氏培养基，用于分离培养，痰液中加入2％NaOH 2～4倍量，振荡使痰液化，取消化后痰液0.1ml，无菌
操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种2支酸性改良罗氏培养基，37℃孵育。 肺部常见感染的免疫血清学诊断方法：
包括凝集试验(AT)、间接免疫荧光试验(1FA)、直接免疫荧光试验(DFA)、乳胶凝集(LA)、ELISA（酶链免疫吸附试验）等， 分子生物学诊断手段如PCR（聚合酶链反应）等方法的应用越来越广泛。
(三)葡萄球菌属（肺部感染病原菌）
葡萄球菌为革兰阳性球菌，一般为需氧或兼性厌氧生长，营养要求简单，在血液琼脂平板上，菌落周围可有明显的完全溶血环。 现在多根据有无凝固酶将葡萄球菌分为三类：
① 金黄色葡萄球菌：能产生凝固酶，在琼脂培养基上菌落绝大多数呈金黄色，能产生多种毒素，对人类具有极强的致病力；
② 表皮葡萄球菌：凝固酶阴性（不能产生凝固酶），该菌为条件致病菌（表皮葡萄球菌），在机体抵抗力差、免疫力低下时可引起严重感染； ③ 腐生葡萄球菌：凝固酶阴性（不能产生凝固酶），呈白色菌落，该菌仅偶尔引起尿路感染。 葡萄球菌的毒力因子包括：①毒素、表皮剥脱毒素、毒性休克综合征毒素—1、肠毒素等；
②酶：凝固酶、纤维蛋白溶酶、耐热合算酶、透明质酸酶、脂酶等； ③其他：荚膜、胞壁肽聚糖等。
葡萄球菌具有天然的耐青霉素的特性，20世纪80年代后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)和耐苯唑西林(ORSA)的比例逐年增加。 正常人群体内和体表多处有葡萄球菌存在而不引起疾病。鼻腔是最主要的带菌部位（葡萄球菌带菌部位），其次为皮肤、咽喉及肠道。 肺炎患者痰标本为黄脓色、粘厚，应考虑为葡萄球菌感染。
金黄色葡萄球菌检验（葡萄球菌属的分类）现在多根据有无凝固酶将葡萄球菌分为三类：（金黄色葡萄球菌检验是其中的一类）（食品） 一、增菌培养法：(一)检样处理：称取25g(mL)样品，加入225m1灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。
(二)增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于7.5％氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养墓内，置36℃士l℃温箱培养
24小时，转种血平板和Baird—Parker平板，36℃±1℃培养24小时，挑取金黄色葡萄球菌落进行革兰染色镜检及血浆凝固酶试验。
(三)形态：本菌为革兰阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5—1um。
1在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长， (四)在肉汤中呈混浊生长：◇
2血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。 ◇
3在Baird—Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为 ◇
淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
(五)血浆凝固酶试验：吸取l：4新鲜兔血浆0.5ml，放人小试管中，再加入培养24小时的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml，
振荡摇匀，放36℃±1℃温箱或水浴内，每半小时观察1次，观察6小时，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
二、直接计数方法：1、吸取上述1：10混悬液，进行10倍递增稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液lml，分别加入3块Baird—Parker
平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3ml、0.4ml，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，
可将平板放在36℃±1℃温箱l小时，等水分蒸发后反转平皿置36℃±1℃温箱培养。
2、在3个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36℃±1℃ 24小时培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。
3、菌落计数 将3个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可
求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。
(四)链球菌属（肺部感染病原菌）
革兰阳性球菌，引起人的疾病主要有各种化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎和风湿热、肾小球肾炎等变态反应性疾病。 根据溶血现象的分类可分为3类（链球菌）：①甲型溶血性链球菌：菌落周围有1～2mm宽的草绿色溶血环，称甲型溶血或α溶血，因而这类菌
也称做草绿色链球菌，这类链球菌多为条件致病菌；
②乙型溶血性链球菌：菌落周围形成一个2～4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，称做乙型溶血或β溶血，因而这类菌多称做溶血性链球菌。这类链球菌致病性强； ③丙型溶血性链球菌：不产生溶血素，因而也称做不溶血链球菌，无致病性。
(五)肺炎链球菌（肺部感染病原菌）
肺炎链球菌为革兰阳性球菌，习惯上称为肺炎球菌，直径0.5一1.25um。无鞭毛、无芽胞、有荚膜，需氧或兼性厌氧、营养要求高，在含有血液或血清的培养基上才能生长。主要寄生于人的上呼吸道，仅部分菌株有致病力，主要引起大叶性肺炎（肺炎链球）。
肺炎链球菌在血琼脂培养基上基本呈灰白色，半透明，周围有草绿色溶血环（在血液琼脂平板上葡萄球菌的菌落周围可有明显的完全溶血环而 肺炎链球菌在血琼脂培养基的周围有草绿色溶血环这是与葡萄球菌的区别）。菌落在普通琼脂培养基上呈绿色，易与草绿色链球菌相混淆（甲型溶血性链球菌也称做草绿色链球菌）。肺炎球菌感染患者痰标本为铁锈色。肺炎链球菌不产生内、外毒素（葡萄球菌能产生毒素），而其致病力主要是荚膜的侵袭作用（因为肺炎链球有荚膜），有荚膜的菌株有毒力，失去荚膜的菌株毒力减低或丧失。根据荚膜多糖抗原性的不同，可分型。 同时，荚膜肿胀试验可用于肺炎链球菌的快速诊断。青霉素为治疗肺炎链球菌的标准药物。（而葡萄球菌耐青霉素，葡萄球菌与肺炎链球菌的区别）
溶血性链球菌检验（肺部感染病原菌）（食品）
一、样品处理：称取25g(m1)检样，加入225ml灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。
二、一般培养：吸取上述混悬液5ml，接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤；或自接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克肉汤，
经36℃±1培养24小时，接种血平板。置36℃±1培养24小时，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。 三、形态与染色
本菌（溶血性链球菌）呈球形或卵圆形，直径0.5～1um，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养中常呈短链。不形成芽胞，无鞭毛，不能运动（溶血性链球菌特点）。 四、培养特性
该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光（溶血性链球菌在血平板的特点），直径约0.5～0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血性链球菌（链球菌属根据溶血现象的分类可分为3类，其中的一类是乙型溶血性链球菌）周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。 这类链球菌致病性强（乙型溶血性链球菌 ） 五、链激酶试验：
1致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成为血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。 ○
2吸取草酸钾血浆0.2ml，加0.8ml灭菌生理盐水，混匀，再加入18～24小时36℃±1℃培养的链球菌培养物0.5ml及0.25％氯化钙0.25ml(如氯化○
钙已潮解，可适当加大至0.3％～0.35％)，振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中10分钟，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。
然后观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24小时后不溶解即为阴性。
3草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放人灭菌小试管中，再加入5m1人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。 ○
六、杆菌肽敏感试验
挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04u的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于培养36℃±1℃培养18～24小时，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知菌株作为对照。 (六)奈瑟菌属
1脑膜炎奈瑟菌和○2淋病奈瑟菌。 革兰阴性双球菌。无鞭毛、无芽胞，有菌毛，需氧，具有氧化酶和触酶。对人致病的只有○
除淋病奈瑟菌寄居于尿道黏膜外，其他奈瑟菌均存在于鼻腔黏膜。
1脑膜炎奈瑟菌） (七)脑膜炎奈瑟菌（对人致病的奈瑟菌有两种○
通称脑膜炎球菌（脑膜炎奈瑟菌），是流行性脑脊髓膜炎的病原菌。革兰阴性双球菌，需氧，非常脆弱，遇干、冷空气均可死亡。人是惟一宿主，生长营养要求高，需要在巧克力琼脂平板生长（脑膜炎奈瑟菌通称脑膜炎球菌培养的特点），发酵葡萄糖、不发酵乳糖，氧化酶阴性。 有荚膜结构，根据荚膜多糖可分为9个血清群。
1脑脊液、○2血液或其他○3渗出物，进行微生物学检查。采取患者○（脑膜炎奈瑟菌采取患者部位） 2淋病奈瑟菌） (八)淋病奈瑟菌（对人致病的奈瑟菌有两种○
通称淋球菌（淋病奈瑟菌）。为淋病的病原菌，严格的人体寄生菌。革兰阴性球菌。无芽胞、无鞭毛、有荚膜和菌毛。 分解葡萄糖，产酸不产气，不分解麦芽糖与蔗糖，氧化酶试验和过氧化酶试验阳性。营养要求高， 一般不易培养，培养时培养基中需加入腹水、血液或阴囊水肿液。 (九)肺炎克雷白杆菌
革兰阴性杆菌，兼性厌氧，不活动，常具有荚膜，营养要求低，分解葡萄糖。大多数社区及医院内获得性肺炎杆菌是内源性感染， 原发性肺炎克雷白杆菌肺炎呈大叶性分布。肺炎患者痰标本为砖红色胶胨样痰，应考虑为肺炎克雷白菌感染。 (十)铜绿假单胞菌（称为绿脓杆菌）
即通常所称的绿脓杆菌，是一种重要的条件致病菌。由于本菌固有的和极易产生的获得性耐药，加之它不易为呼吸防御机制彻底杀灭，故治疗困
难，病死率高（铜绿假单胞菌）。
其为（铜绿假单胞菌）革兰染色阴性杆菌，全需氧，有鞭毛，无芽胞，无荚膜，营养要求低， 在琼脂血平板上生长有特殊气味，典型的气味为生姜味（铜绿假单胞菌称为绿脓杆菌的特殊的气味）。 菌落呈灰绿色或蓝绿色。铜绿假单胞菌分离培养时宜选用NAC培养基。
1菌毛、○2粘液外多糖、○3内毒素、○4蛋白酶类、○5外毒素、○6溶血素、○7绿脓素等。铜绿假单胞菌感染患者主要毒力因子为（假单胞菌铜绿）：○
咳痰颜色为翠绿色或黄脓色（这是（铜绿假单胞菌又一特点）。 (十一)不动杆菌
是一类氧化酶阴性，厌氧下不能利用葡萄糖，无动力的革兰阴性杆菌。
根据最新分类系统，不动杆菌属分6个种，其中以鲍曼不动杆菌、硝酸盐阴性杆菌为多见（不动杆菌）。 不动杆菌感染治疗可采用氨基糖甙类抗生素加第三代头孢菌素。
1革兰阳性杆菌，菌体染色不均匀，有异染颗粒。无荚膜、无鞭毛。不产生芽胞。需氧或兼性厌氧。白喉棒状杆菌（属于不动杆菌属其中一种）：○
2其致病性与其产生的白喉毒素有关。在含有凝固血清的Loffler培养基上生长迅速。 ○
3调查人群对白喉的免疫力可用白喉毒素做皮内试验，又称锡克试验（白喉的免疫力可用白喉毒素做皮内试验）○。 4体外毒力鉴定可采用琼脂平板毒力试验和豚鼠试验。 ○
(十二)百日咳鲍特菌
革兰阴性球杆菌（百日咳鲍特菌），光滑型菌株有荚膜和菌毛。无芽胞或鞭毛。需氧，初次培养多用鲍—金培养基，培养基上生长时，菌落颜色为银灰色（在初次培养多用鲍—金培养基菌落颜色为，培养基上生长时银灰色）。革兰染色为阴性杆菌（培养基上生长时菌落颜色为银灰色做革兰染色为阴性杆菌），在普通血平板上不生长（这是百日咳鲍特菌的特点只有在初次培养多用鲍—金培养基上才能生长）。 (十三)嗜血杆菌（流感嗜血杆菌）
流感嗜血杆菌引起的肺炎主要发生在6个月至5岁的婴幼儿，常并发化脓性脑膜炎（流感嗜血杆菌引起），近年来，流感嗜血杆菌在成年人中引起感染的机会呈增高趋势。本菌为革兰阴性小杆菌，不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不能运动，部分菌株有多糖荚膜，与流感嗜血杆菌的毒力有密切
关系。本菌为需氧菌，营养要求高，在一般培养基上不容易生长，需要X和V两种生长因子才能生长。
1X因子为存在于血红蛋白中的一种血红素，为含铁的卟啉，是细菌合成过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素氧化酶的辅基。 ○
2V因子为一种维生素B类物质，血液中所含的V因子通常处于被抑制状态，经加热后，可使V因子释放。 ○
流感嗜血杆菌在巧克力培养基上生长较佳。培养24小时后菌落可呈三种状态：M型、R型和S型。有荚膜的菌株菌落呈M型，粘稠并有光泽，对人的毒力强（这是M型特点）。流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上共同生长时，因后者能合成V因子（金黄色葡萄球菌），可见“卫星现象”（只有在流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上共同生长时才能出现“卫星现象”）。即葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血
杆菌菌落较大，远离者较小。
1副流感嗜血杆菌培养时，培养基中不需要血红素及其衍生物，○2而溶血嗜血杆菌培养时，菌落周围有β溶血环现象。 与流感嗜血杆菌相比，○
3而杜克嗜血杆菌主要引起软性下疳疾病，并且杜克嗜血杆菌培养时只需要X（不需要V因子）○。
4有荚膜的流感嗜血杆菌含有荚膜多糖抗原又称M抗原，具有型特异性，能刺激机体产生保护性抗体。 ○
可应用型特异性免疫血清作特异性抗血清凝集试验进行血清学分型，通常将流感嗜血杆菌分为6个型。其中以b型致病力最强。 人类是流感嗜血杆菌的惟一宿主，它寄生于正常人的上呼吸道，无荚膜型菌株和b型流感嗜血杆菌均视为上呼吸道的正常菌群。 感染流感嗜血杆菌的婴幼儿肺炎患者并发症通常为脑膜炎。氨苄西林为流感嗜血杆菌肺炎的首选抗菌药物。
1荚膜多糖菌苗、○2多糖—载体蛋白结合菌苗和○3荚膜寡糖—变异性白喉类毒素结合菌苗。 目前流感嗜血杆菌菌苗的研制主要有以下三种：○
(十四)军团菌（主要是嗜肺军团菌引起疾病）
1976年，美国首次报道了军团菌病，在费城一家宾馆举行58届退伍军人大会期间和会后一个较短时间内，与会的退伍军人代表和其他成员中突然发生一种不明原因但临床表现相同的疾病。CDC等单位经过13个月的研究，最后证明本病为一种细菌性肺炎，并以会议的名称将其命名为退伍军人病或军团病1982年我国首次发现军团菌感染患者，经美国CDC间接免疫荧光抗体检测（IFA-间接免疫荧光检测，这个方法测抗体），证实为嗜肺军团菌感染。 军团菌为革兰染色阴性杆菌，无荚膜，不产酸，有鞭毛，能运动。需氧，生长时需要L—半胱氨酸和铁盐，氧化酶阴性或弱阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素酶阴性，液化明胶，水解马尿酸是嗜肺军团菌的特征。细胞壁上有支链脂肪酸。利用氨基酸作为能量来源，不发酵碳水化合物，可从地表水、泥土和热水中分离到本菌。军团菌主要以嗜肺军团菌为主引起人类疾病。嗜肺军团菌可分解淀粉，但不发酵葡萄糖或其他碳水化合物，需氧，对碳水化合物的利用可能是通过氧化途径而不是发酵途径。
嗜肺军团菌在F—G琼脂上生长时，其菌落呈现褐色（嗜肺军团菌在F—G琼脂上生长时，其菌落呈现褐色）。除米可戴德军团菌外所有军团菌种均能产生褐色色素。氨基酸是嗜肺军团菌的主要能源其中，谷氨酸为主要来源。军团菌具有独特的细胞脂肪酸，支链脂肪酸图谱可作为军团菌分类的依据。
1河水、○2溪水、○3污染的热水、○4天然温泉水中分离到。 军团菌在自然界中普遍存在。嗜肺军团菌和其他菌种的军团菌曾从○
同时军团菌又是人工管道水源中常见的一群微生物，可在人工管道水源中定居、生长、繁殖，并以气溶胶的方式传播感染人群。近年来，空调的广泛使用对于军团菌的定居和感染提供了一个良好的条件。空调冷却塔中的冷却水如果被军团菌污染，随着送风管道，军团菌将对人造成感染。天然环境中及人工管道系统中的阿米巴是军团菌的天然宿主，阿米巴存在于水、水龙头、淋浴器和空调冷却塔水中，世界上目前暴发的多次军团菌病与空调系统的冷却塔水有关。目前，豚鼠是实验性军团菌病的最佳动物模型。军团菌引起病灶的主要部位不是上呼吸道而是肺泡。临床上军团菌感染主要有三种形式：
1肺炎型、2发热型和◇3肺外感染型。1肺炎型主要表现为体温迅速上升，◇◇◇高达39℃～41℃，一般不超过39.5℃，发冷、不适、头痛、呼吸困难、呕 吐、 2发热型又称庞蒂亚克热，潜伏期短，仅1—3天，症状为发热、发冷、咳嗽、头痛、腹泻、呕腹泻等，咳嗽并有少量粘痰。X线检查，显示有肺炎。◇
3肺外感染型主要为继发感染，通过菌血症散布。 吐等，但无肺炎。可自愈预后良好，无死亡。◇
1分离或○2直接荧光抗体法(DFA)检测或○3以患者双份血清间接荧光法(1FA)做回顾性诊断，军团菌的诊断有赖于病原菌的○同时也是WHO推荐的检测军3IFA检测试验中，前后两次抗体滴度增长达到4倍增长达l：128以上：具有诊断意义。ELISA（酶联免疫吸附实验）团菌经典的方法。○、试管凝集方
法、尿抗原检测等方法对于军团菌病的诊断具有良好的前景。临床上进行鉴别诊断时，应注意军团菌与支原体肺炎的区别。尿液中抗原的检测有助于军团菌病的早期诊断，感染后第1天至35天，尿中都可以测出抗原。
β-内酰胺类和头孢菌素类抗生素治疗军团菌病无效，这是因为军团菌能产生内β-酰胺酶和酰基转移酶分别使上述两类抗生素水解。
大环内酯类药物如红霉素、螺旋霉素等（这是军团菌治疗上用的抗菌药大环内酯类药物如红霉素、螺旋霉素等）对军团菌有效。
对于重症患者可联合使用利福平治疗。军团菌的培养需要特殊的培养基，BCYE琼脂培养基为目前推荐使用的培养基，L-半胱氨酸和焦磷酸铁为必需成分，BCYE培养基中加入α-酮戊二酸即为BCYE-a培养基，一般军团菌的分离培养时，培养基中需加人万古霉素、多粘菌素等成分以抑制杂菌的生长。在MH—IH培养基上生长时，能产生褐色色素。军团菌进行β-内酰胺酶试验时，基质的颜色将变为红色。
第三节 衣原体疾病检验
衣原体是一类能通过细菌滤器，严格细胞内寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物，其特征是：
①革兰阴性、圆形或椭圆形体；②有细胞壁，无肽聚糖，只含有大量胞壁酸；③具有独特的发育周期，类似细菌以二分裂方式繁殖； ④含有DNA和RNA两种核酸；⑤有核蛋白体，能进行多种代谢，但不能合成带高能键的化合物；⑥对某些抗生素敏感。
衣原体在宿主细胞内生长繁殖，具有特殊的发育周期，可观察到两种不同的颗粒结构，一种小而致密，称为原体；另一种大而疏松，称为网状体。 原体有胞壁，是发育成熟的衣原体，Gimsa染色为紫色，当进入宿主易感细胞后，逐渐发育增大为网状体。 网状体无胞壁，代谢活跃，以二分裂方式繁殖，在空泡内发育成许多子代原体，不具有感染性。
1沙眼衣原体、◇2肺炎衣原体和◇3鹦鹉热衣原体。 衣原体属主要包括◇
一、沙眼衣原体（衣原体疾病检验的分类其中一种）
1沙眼生物变种、○2沙眼淋巴肉芽肿生物变种和○3鼠生物变种。 人是其主要自然宿主，沙眼衣原体有三个变种：○
1姬姆萨染色后，上皮细胞内涵体呈蓝色、深蓝色或紫色。◇2碘液染色结果上皮细胞内包涵体呈棕色，沙眼衣原体可采用直接涂片染色法进行检测，◇
其他细胞不着色。另外，鸡胚卵黄囊内接种法也可用于沙眼衣原体的分离和检测。利用此项技术，1956年，中国学者汤飞凡首次发现并报道了沙眼衣原体。沙眼衣原体是沙眼的病原体。侵犯眼结膜和角膜，引起颗粒性结膜炎、角膜炎。有些衣原体尚可引起泌尿生殖系统感染。 二、肺炎衣原体（衣原体疾病检验的分类其中一种）
肺炎衣原体寄生于人类，无动物储存宿主，人与人之间通过飞沫或呼吸道分泌物传播，扩散缓慢，潜伏期平均为30天左右。
1肺炎、○2支气管炎、○3咽炎、○4扁桃体炎和○5鼻窦炎等，老年人多见（肺炎衣原体）肺炎衣原体可引起○。
衣原体抗体的存在与慢性冠心病和急性心肌梗死有关，目前诊断肺炎衣原体感染的最敏感的方法是用微量免疫荧光试验检测血清中抗体。 三、鹦鹉热衣原体（衣原体疾病检验的分类其中一种）
首先从鹦鹉体内分离出，为鸟类胃肠道及呼吸道感染的病原体。哺乳动物(常见家畜)也可发生感染，尤其是幼年动物。 鹦鹉热衣原体可从鸟类传给人，使人发生肺炎。
多从呼吸道途径侵入，经过1—2周可急骤发病，有寒战、发热、咳嗽等症状。亦有徐缓发病或呈隐性发作。
第四节 螺旋体疾病检验
一、螺 旋 体
螺旋休是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物， 其基本结构（（螺旋体）与细菌类似，有细胞壁、核质，以二分裂方式繁殖和对抗生素敏感等（螺旋体）。 根据螺旋数目、大小与规则程度以及两螺旋间的距离，分为5个属， 对人和动物致病的行3个属。（○1疏螺旋体属、○2密螺旋体属、○3钩端螺旋体属）
1回归热螺旋体、○2伯氏螺旋体、○3奋森螺旋体。 1疏螺旋体属：螺旋稀疏，有3～10个螺旋，不规则呈波纹状。对人致病的有○○
1梅毒螺旋体、○2雅司螺旋体、○3品他螺旋体等。 2密螺旋体属：螺旋体细蜜，有8～14个规则螺旋，两端尖。对人致病的有○○
1黄疽出血型钩端螺旋体、○2流感伤寒型和○3肺出血型 3钩端螺旋体属：螺旋更细蜜而规则，数目较多。菌体一端或两端弯曲成钩状。对人致病的有○○
二、钩端螺旋体属（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中一种）
1一个是致病性钩体——肾脏钩端螺旋体。○2另一个非致病性钩体一一双曲钩端螺旋体。 钩端螺旋体属有两个种，○
钩端螺旋体的感染分为3个阶段，检测时应在不同阶段取不同标本。发病早期(第l周内为钩体败血症期)采集血液标本进行检测。发病第8天后(一直持续到第35天或更长时间)为钩体尿症期，可采集尿标本进行检测。有眼发病的患者可采集眼房水送检。有脑膜刺激症状者，可以无菌方式作腰椎穿刺，采集脑脊液送检。
观察钩端螺旋体时一般使用暗视野显微镜观察。一般培养螺旋体时常使用的培养基为Korlhof培养基，适宜的生长温度为28℃。
钩端螺旋体病是一种自然疫源性传染病，自然界中钩体可感染野生动物和家畜(鼠、猪、犬、牛、马、羊等)。钩体在其肾小管中长期繁殖，从尿排出，肾脏长期带菌和排菌的鼠类和猪是钩体的重要储存宿主和传染源。本病的发生常与某些工种有关，并有—定的季节性，常在多雨、水稻成熟田间鼠类活动频繁的夏秋季节流行。钩体具有较强的侵袭力，能通过皮肤的微小伤口、眼结膜、鼻或口腔侵入人体，迅速进入血液并繁殖。 临床上钩体病常见以下几个型：黄疽出血型、流感伤寒型和肺出血型。
三、回归热螺旋体（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中的疏螺旋体属分类其中一种）
回归热螺旋体属于疏螺旋体属，以节肢动物为传播媒介，可引起以周期性反复发作为特征的记性传染病—一回归热。其病原体有两种：
1回归热螺旋体，以虱为媒介，引起虱传播型回归热；○2杜通疏螺旋体，以蜱为媒介，引起蜱型回归热。 ○
四、伯道疏螺旋体（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中的疏螺旋体属分类其中一种）
引起莱姆病，经蜱传播。临床上以皮肤出现慢性游走性红斑、神经系统和心脏受损和一过性、复发性、多发性关节炎为特征的自然疫源性疾病。 中国于1985年在黑龙江林区首次发现本病（伯道疏螺旋体的引起莱姆病）。
五、梅毒螺旋体（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中的密螺旋体属分类其中一种）
梅毒螺旋体是性病梅毒的病原体，属于密螺旋体属中不能培养的螺旋体，接种家兔睾九或眼前房，能保持其繁殖和毒力。抵抗力弱，对青霉素、四环素、红霉素敏感。检查梅毒螺旋体最适合的标本是下疳渗出液。通常用暗视野显微镜观察（观察钩端螺旋体时一般使用暗视野显微镜观察）。人是梅毒螺旋体的惟一传染源。
第五节 支 原 体（无细胞壁是支原体的特点）
支原体是一群介于细菌、立克次体和病毒之间，能营独立生活，有细胞结构，但无细胞壁的最小的原核细胞型微生物。
1没有细胞壁，◇2呈高度多形性，◇3最小的个体自径200nm左右，◇4可通过滤器，◇5在无生命的人工培养基上能生长繁殖的最小微生物。 其特点是：◇
支原体在固体培养基上生长时可形成典型的“荷包蛋”样菌落（这是支原体在固体培养基上生长时最典型的特性）。其基因组是一个环状双股DNA， 革兰染色阴性。支原体在自然界中广泛存在。污水、土壤等有腐生株，多数人和动物的病变或正常黏膜处可分得寄生株，泌尿生殖道分离率较高， 而眼标本中分离率低。营养要求比较高，大多需要胆固醇，在适宜的培养基上易分离和传代。集落小，直径大多为0.1～0.3mm。圆形透明，大多中央部分深埋于琼脂，形成明显的“油煎蛋’’状集落这是支原体在固体培养基上生长时又一个最典型的特性）。 除牛、羊、大鼠支原体以及人肺炎支原体能引起原发性疾病外，其他在致病性上尚未肯定。应与细菌L型相区别。
肺炎支原体肺炎引起原发性非典型性肺炎，(支原体)主要以飞沫形式感染，大多发生于夏末秋初，发病率以5～19岁青年最多。 支原体的诊断方法靠分离培养和血清学检测，但肺炎支原体生长缓慢，与血清学检查一样，均不能达到早期诊断的目的。 国外应用较多的是补体结合试验，双份血清抗体4倍以上升高或单份血清大于1：32可判断为阳性。 解脲支原体的基础培养基为U—9基础培养基，与一般基础培养基相比，其培养基中添加了尿素成分。 第六节 细菌药敏试验
1．稀释法(全量法)：一般采用Mueller—Hinton液体培养基(MH)。测定抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度(MIC)或最小杀菌浓度(MBC)。
2．脂稀释法制备：MH（Mueller—Hinton液体培养基）琼脂平板时，当琼脂温度在50℃左右时加入抗菌药物，琼脂厚度为3mm。 3、纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer法)：纸片含药浓度的对数与抑菌环的半径平方值呈直线相关。
抑菌环直径的分界点分为四级：耐药(R)、中介度(1)、中度敏感(MS)和敏感(S)。MIC是指细菌的最小抑菌浓度，抑菌环直径越大，MIC越小。
第二节 菌落总数测定
菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这—方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 一、检样稀释及培养
1、 以无菌操作，将检样25g(或m1)剪碎放子含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，
经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8 000—10 000转／分的速度处理1分钟，做成1：10的均匀稀释液。
2、 用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液lml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，
振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液
3、 另取lml灭菌吸管，按上条操作顺序，做l0倍递增稀释液，如此每递增稀释1次，即换用1支1mL灭菌吸管。
4、 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lml
稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
5、 稀释液移人平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置46℃±1℃水浴保温)注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养
琼脂培养基倾人加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。 6． 待琼脂凝固后，翻转平板，置36温箱内培养(48℃±2℃)小时。 二、菌落计数方法
作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。
三、菌落计数的报告
1．平板菌落数的选择：选取菌落数在30—300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用2个平板，应采用2个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可汁算半个平板后乘以2以代表全平皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有1条链，可视为1个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为1个菌落计。 2．稀释度的选择：
(1)应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。
(2)若有2个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视两者之比值来决定。若其比值小于或等于2（≤2），应报告其平均数； 若大于（＞2）2则报告其中较小的数字。
(3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300【＞300 】，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 (4)若所有稀释度的平均菌落数均小于【30＜】，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 (5)若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。
(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
3． 菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算。为
了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。 第三节 大肠茵群测定
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 一、大肠菌群检验方法 (一)检样稀释
1、以无菌操作将检样25ml(g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，
经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000—10000转／分的速度处理1分钟，做成1：10的均匀稀释液。 2．用lml灭菌吸管吸取1：10稀释液lml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。 3．另取lml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释1次，换用1支lml灭菌吸管。 4．根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。 (二)乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在lml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lml及lml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管，置36℃±1℃温箱内，培养(24℃±2℃)小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气。则可报告为大肠菌群阴性， 如有产气者，则按下列程序进行。
(三)分离培养：
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并做革兰染色和证实试验。 (四)证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃温箱内培养(24℃±2℃)小时，观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
(五)报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。 二、粪大肠菌群检验方法
1、用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内，置44.5℃±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，
培养(24±2)小时，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℉培养18～24小时，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。
2．结果报告 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)粪大肠菌群的MPN值。
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