3_5_二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖_还原糖及淀粉的探讨

2007年　11月　　　　　　　　　　JournalofYunnanAgriculturalUniversity　　　　　

Vol122　No16

Nov.2007

3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草

水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨

尹建雄

1,2

,卢　红

23

,谢　强,丁金玲,李尼杭

222

(1.石林县天合烟叶复烤有限责任公司,云南石林6522001;2.云南农业大学烟草学院,云南昆明650201)

摘要:通过还原糖对3,5-二硝基水杨酸的还原产物的吸收光谱分析,结果表明,该还原产物在500nm波长下有最大吸收峰,但最佳的工作波长确定为540nm。同时找出了显色反应时间及显色剂的最佳用量。并对烟草中水溶性总糖的提取方法进行了优化,建立了批量连续测定烟样中还原糖、水溶性总糖(进行酸水解)、淀粉的快速方法。同时对多个烟样进行了测定,与伯川法测定结果比较,其相对误差在5%以内。关键词:烟草;比色法;3,5-二硝基水杨酸

中图分类号:TS411　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X(2007)06-0829-05

AStudyonRapidColorimetricDeterminationofWaterSolubleTotalSugar,ReducingSugarandStarchin

Tobaccowith3,52dinitrosalicylicAcid

YINJian2xiong,LUHong,XIEQiang,DINGJin2ling,LINi2hang

(1.TIANGHETobaccoThreshingLID,CO.StoneForest652200,China;

2.FacultyofTobaccoScience,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

1

22

2

2

Abstract:Theabsorptionspectrumof3,52dinitrosalicylicacidreducingproductwithreducingsugarhasbeenstudied.Theresultshowsamaximumabsorptionat500nm,butthebestworkwavelengthwasdeterminedby540nm.Thebesttimeofcolorreactionandbestsuitableamountofthecolorreagentwasgiven.Theextractionmethodsofwatersolubletotalsugarwasoptimized,andarapidcontinuousbatchdeterminationofreducingsugar,watersolubletotalsugarandstarchwasestablished.Whensometobaccosamplesweredetermined.TherelativeerrorsoftheresultsobtainedbythismethodrelatedtothoseobtainedbytheBertrandπsmethodwereunderof5%.Keywords:tobacco;colorimetry;3,52dinitrosalicylicacid

　　烟草中的水溶性总糖、还原糖、淀粉对烟叶品

质影响巨大,是烟草化学分析中的重要项目,水溶性总糖和淀粉通常都是通过水解(酶解或酸水解法)成单糖按还原糖的测定方法进行测定。还原糖经典的测定方法是铜还原-滴定法(如芒森・

[1][2]

沃克法、伯川法),该方法具有准确度高、重现性好等优点,但流程长、步骤多、操作繁、试剂及水

电消耗大,只能用于小数量样品的常量分析。虽然有人对水溶性总糖的提取过程进行了改进、优化准

[3,4][5]

,但效果不是很明显。最新的烟草行业标

采用连续流动分析仪测定水溶性糖,但所用

[6]

仪器比较昂贵。一般实验室所用的比较快捷的方法当属比色分析法,如斐林试剂比色法比色法

[7]

、磷钼酸

[9]

、邻甲苯胺比色法

[8]

、硫酸-蒽酮法

　收稿日期:2006-09-14　　3通讯作者

　作者简介:尹建雄(1979-),男,湖南邵阳人,硕士研究生,主要从事烟草生理生化研究。

E-mail:axiong168@sina.com

830云南农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　第22卷

烟样(过80目筛)100mg于100mL大试管中,加

入10mL80%乙醇,浸泡过夜。次日加入热蒸馏水10mL,并在80℃水浴中加热015h,过滤于100mL

等。本文以3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosali2

cylicacid,DNS)为显色剂,对烟草中水溶性总糖的提取方法进行了优化,建立了批量连续测定烟样中水溶性总糖、还原糖和淀粉的比色测定方法。该方法方便快捷,与伯川法(Bertrand’smethod)相比,相对误差5%以内。1　材料与方法1.1　主要仪器与试剂

1.1.1　仪器　731型紫外-可见分光光度计1.1.2　试剂

015mg/mL葡萄糖标准液:将分析纯葡萄糖在80℃下烘干至恒重,精确称取500mg,加少量蒸馏

容量瓶中,并用热蒸馏水反复冲洗滤渣,定容,即为

还原糖待测液。

(2)水溶性总糖的提取。吸取上述还原糖待测液25mL于250mL三角瓶中,并加入1∶3(浓盐酸与蒸馏水体积比)的盐酸溶液7mL,置于沸水浴中酸化015h,加1～2滴甲基红指示剂,用10%NaOH调至中性或偏碱性(pH=710～715),转移到100mL容量瓶并定容。即为水溶性总糖待测液。

(3)淀粉待测液的制备。将步骤(1)中滤渣用50mL蒸馏水洗入250mL三角瓶中,加入5∶4(浓盐酸与蒸馏水体积比)的盐酸溶液7mL,置于100～105℃恒温烘箱中酸化215h,加1～2滴甲基红指示剂,用10%NaOH调至中性或偏碱性(pH=710～715),转移到100mL容量瓶并定容。1.2.3　糖分的测定水溶解,移入100mL容量瓶中并定容、摇匀,即为5mg/mL葡萄糖标准液。精确吸取上述标准液10mL移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。

3,5-二硝基水杨酸显色剂:采用许尧兴等的

方法并作如下优化:取酒石酸钾钠182g,加热

溶于800mL蒸馏水中。于热溶液中依次加入氢氧化钠21g,3,5-二硝基水杨酸613g,苯酚5g,无水亚硫酸钠5g,搅拌至溶解,冷却后移入于1000mL容量瓶并用蒸馏水定容至刻度,混匀,贮于棕色试剂瓶中,于暗处放置3d后使用。1.2　操作步骤1.2.1　标准曲线的绘制

[10]

分别取还原糖待测液2100mL,水溶性总糖待

测液2100mL,淀粉待测液4100mL,加入3,5-二硝基水杨酸显色剂2100mL,按标准液的处理方法测定吸光度,然后从标准曲线上查出对应的浓度并计算总糖含量。

μg/mL)×糖%(以葡萄糖计)=[葡萄糖(100]/

[烟样重(mg)×1000×(1-含水率)]×100%2　结果与讨论

2.1　反应产物吸收光谱特性

分别量取015mg/mL葡萄糖标准溶液0,013,

016,019,112,115,118和210mL,置于具塞25mL试管中,吸取蒸馏水分别补充至210mL,再各加210mLDNS试剂。盖上塞子,置于沸水浴中加热6min,取出,用流动冷水冷却后用蒸馏水定容到刻度25mL,充分摇匀,静置10min后,在紫外可见分光光度计上于540nm波长下,以空白(即量取标准溶液0mL)为参比液,测其吸光度。经回归统计求出其回归方程。1.2.2　糖分的提取

(1)还原糖的提取。先天晚上称取磨碎后的

已报道的还原产物的最大吸收波长有:474nm490nm503nm

[11]

,480nm,492nm

[12][17]

,483nm

[13]

,484nm

[14]

,,

[15,16][22]

,495nm

[18,19]

,500nm

[20,21]

。而采用的工作波长也有:520nm,[26][27～32][33,34][35]

530nm,540nm,550nm,560nm,

[36]

610nm。最大吸收波长不一,而采用作为工作波长大多也没有说明其原因。所以本文对反应产物吸收光谱特性进行了探索,以确定最佳工作波长。

[23～25]

表1　不同波长下吸光度值及其比值

Tab.1　Theabsorbanceunderdifferentwavelength

波长/nm

wavelengthA0

AA/A0

460

470

4801.321.561.18

490

500

510

520

530

540

550

560

570

580

590

600

610

1.5141.5171.5451.5451.02

1.02

0.7680.3770.1550.0780.0430.0240.0120.0110.0090.0070.0060.0050.0051.4721.92

1.293.42

1.0770.9330.8090.6970.5660.5010.4350.3680.3180.2620.2186.95

11.9618.8129.0447.1745.5548.3352.57

53

52.4

43.6

尹建雄,等:3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨第6期　　　　831

　　取015mg/mL葡萄糖标准液1100mL,用蒸馏

水补充至2100mL,加显色剂2100mL,按步骤1.2.1进行显色反应。直接以蒸馏水为参比液,用731型紫外-可见分光光度计在400～700nm波

长范围内每10nm波长间隔测定显色反应液吸光度值(A)及原参比液(即空白)(A0)吸光度值,它们之间的差值可认为是还原反应产物的吸光度。光谱图(见图1)显示,还原产物在500nm波长下有最大吸收。这与以前报道的最大吸收峰不同,这可能是由于紫外可见分光光度计的型号不同及不同的溶液干扰体系所致。综合以前的报道,可以推定最大吸收波长应在490～510nm之间。在500nm波长下测定有最大吸光度值,即可以获得比

较高的灵敏性。但此波长下原参比液也有较大的吸光度值,而且所测得的数据稳定性差。所以最大吸收波长并非最佳工作波长。根据“吸收最大,干扰最小”原则,并考察显色反应液吸光度值(A)与原参比液(即空白)的吸光度值(A0)来确定最佳工作波长。从表2可以看出,520～550nm任一波长作为工作波长,都可以兼顾有较大的吸光度值和较小的干扰。本文选用540nm作为最佳工作波长,因为此波长是DNS比色法首创时使用的工作波长,并已在一些国标中采用。本试验中,在此波长下可以得到最佳线性关系的工作曲线,而且测量的数据稳定性也比较高。

[29]

[30]

分别吸取标准1100mL,用蒸馏水补充至2100mL,按步骤1.2.1在沸水浴中加热不同时间(2～10min),在540nm波长下吸光度测定结果如图2。当显色反应时间少于5min时,溶液吸光度随时间的增加而增大,当显色反应时间增至6min时,吸光度的增大就不明显,所以以6min为最佳反应时间。2.3　显色剂用量试验取015mg/mL葡萄糖标准液2100mL与不同浓度的DNS显色剂显色,在540nm波长下吸光度测定结果如图3。当显色剂用量小于1140mL时,溶液吸光度随显色剂用量的增加而增大,当显色剂用量增加至1150mL时,吸光度的增大就不明显,而显色剂用量增加至1180mL之后,吸光度则基本保持不变。由于考虑到糖分含量的不确定因素和操作的方便,因此,本文选用显色剂的最佳用量为2100mL。

2.2　显色反应时间试验

分别吸取标准1100mL,用蒸馏水补充至2100mL,按步骤1.2.1在沸水浴中加热不同时间(2～10min),在540nm波长下吸光度测定结果如图2。

当显色反应时间少于5min时,溶液吸光度随时间的增加而增大,当显色反应时间增至6min时,吸光度的增大就不明显,所以以6min为最佳反应时间。

2.4　反应产物稳定性试验

取015mg/mL葡萄糖标准液1100mL与DNS显色剂2100mL,按步骤1.2.1进行显色反应,定容后计时,在不同的时间段测其吸光度,结果如图

832云南农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　第22卷

线出现负偏离,而在此浓度范围内,线性关系良好。

并且,为了提高测定的精确度,吸光度值最好能在012～018之间,所以葡萄糖浓度(待测液中)的适宜浓度在75～300μg/mL为最好。2.6　色素及蛋白质干扰试验

4。试液显色后4h内基本稳定,而4h后,吸光度

逐渐减小。为减少误差,整批样品测量最好在沸水浴显色后冷却定容后稳定10min,然后进行测量。

各个样品在显色时间、冷却时间、测定时间上严格一致,以减少误差。

烟草中水溶性总糖的经典提取方法是用乙醇提取,并回收其中乙醇,此法耗时较多,且受色素和蛋白质的影响。用活性碳可进行脱色处理,但活性

[9]

碳吸附色素的同时也吸附糖分,这样将使测定

[11]

结果偏低。参考罗志刚等的方法,经反复试验,采用如步骤(2)所述提取方法。取烟样待测液2100mL加入2100mL的显色剂(不加热),以原参比液(即空白)测定其吸光度。多次测定结果均表明其吸光度很小(01007左右),说明烟样色素对还原产物干扰很小。这可能是由于显色剂本身亦为黄色,且提取液的颜色极浅,在540nm的吸光度很小所致,说明其不影响测定,从而省去了除蛋白质和色素的步骤。待测液中乙醇的浓度很小,且在水浴中加热的6min中内基本上已蒸发完毕,对测定干扰很小,所以不需回收乙醇。2.7　水溶性总糖的回收率测定

经典的回收率测定方法为标样添加法。但由于所加糖(葡萄糖)与烟叶中的水溶性总糖物理性质差异太大,所以本文采用直接测定滤渣中残留水溶性总糖的方法来测定回收率。已有资料表明乙

[4,37]

醇提取方法的回收率的可信性。所以本试验

[2]

对步骤1.2.2提取水溶性总糖后的滤渣按资料

2.5　标准曲线

葡萄糖的标准曲线见图5,拟合曲线的R=019986,说明其有良的相关性。试验中发现当葡萄糖浓度(待测液中)高于450μg/mL时,标准曲

2

的提取方法经3次提取,合并提取液,并按步骤11213测定滤渣中水溶性总糖,结果如表2。其回收率达到97%左右,证明本提取方法可行。

表2　回收率测定结果

Tab.2　Theresultofrecoveryratiodetermination

样品编号

samples

水溶性总糖/%watersolubletotalsugar残留糖含量/%residualsugarcontent

回收率/%recoveryratio

　　样品1　　12

26.780.720.974

26.270.750.972

　　样品2　　12

22.120.640.972

21.950.690.970

　　样品3　　12

31.210.760.976

31.470.630.980

2.8　糖分测定精密度试验

影响本实验精密度有主要原因有紫外分光光

度计的稳定性、待测液在水浴中显色(加热)时间及其后放置冷却的时间以及试管的容积差异。在

充分排除上述影响因素后,对3个烟叶样品进行了5次重复测定,结果如表3。变异系数均不到3%,证明此方法测定重复性好。

尹建雄,等:3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨第6期　　　　

表3　精密度试验结果

Tab.3　Theresultofdegreeofprecisiondetermination

833

样品

samples

123

平行测定值/%paralleldeterminationresults12345

27.3118.5621.76

27.2518.4322.57

27.8919.2122.12

26.9118.1623.23

27.6817.9722.43

平均值/%

mean

27.4118.4722.42

标准差SD

0.3840.4750.549

变异系数/%coefficientofvariation

1.402.572.45

2.9　与伯川法测定结果比较

表4　本法与伯川法对比试验结果

Tab.4　TheresultofcomparativeexperimentalstudywithBertrandπsmethods

样品号samples

DNS法/%

bertrand法/%

118.5117.982.95

226.3425.433.58

316.7817.21-2.50

430.2528.974.42

517.4917.132.10

628.5727.723.07

719.4120.25-4.15

831.2629.864.69

相对误差/%relativeerror

　　本法与伯川法测定结果如表4。从比较结果来看,相对误差基本在5%以内,证明两种方法有较好的一致性。值得注意的是,相对误差基本上是正值,即伯川法测定的结果通常要小,这可能是伯川法测定流程长、步骤多、操作繁,每个步骤都可能造成糖分的损失有关。3　结论

流动法[S].

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