蛋白质含量测定方法

󰀁科普讲座󰀁

蛋白质含量测定方法

杨玉芳

青海明杏生物工程有限公司,青海西宁810015

摘要:蛋白质与生命的起源、存在和进化都密切相关,蛋白质测定涉及到生产和科研的众多领域。本实验用定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝法分别对牛奶、酸奶、豆浆进行蛋白质含量的测定。依此分析比较各种测定蛋白质的方法,总结出各方法的特点及适用条件。

关键词:定氮法;紫外吸收法;双缩脲法;考马斯亮蓝法;蛋白质;测定

蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有这几种古老的经典方法,即定氮法、双缩脲法(Biuret法)和紫外吸收法。另外,还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)

[4]

[1]

白质浓度的测定,通过对实验的过程和结果的分析来总结这几种方法的适用范围及实用性。通过分析表明,针对不同的待测样品以及对测定结果准确性的要求不同,我们可以采用不同的方法来测定样品中蛋白质的含量。1󰀁材料与方法1.1󰀁仪器材料

(1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。

(2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol󰀁LpH=4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0.050mol󰀁L标准盐酸溶液、硫酸钾-硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G-250试剂。1.2󰀁实验方法

(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量

将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂和加入K2SO4以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平。其中,Bradford法灵

敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。这后3种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这4种方法测定,有可能得出4种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:(1)实验对测定所要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定所要花费的时间。本实验分别用以上4种方法对牛奶、酸奶、豆浆进行蛋[3]

第27卷第2期杨玉芳:蛋白质含量测定方法

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均值。

(2)紫外吸收法测定蛋白质含量

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核

酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。

此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

取待测样品制成蛋白浓度大约在0.1~1.0mg󰀁mL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。

(3)双缩脲法测定蛋白质含量

双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180󰀂左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

󰀁󰀁此法的优点是测定较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少;主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。

取待测样品制成蛋白浓度大约在1~10mg󰀁mL的蛋白质溶液,加双缩脲试剂染色30min,用可见光分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品蛋白质含量。每个样品做3

100

次重复测定,取平均值。

明󰀁胶󰀁科󰀁学󰀁与󰀁技󰀁术2007年6月

测定未知蛋白质的浓度。

取待测样品加入考马斯亮蓝G-250试剂放置5min后,用可见光分光光度计比色,对照标准曲线得出样品蛋白质含量。每个样品做3次重复测定,取平均值。2󰀁结果与分析2.1󰀁实验结果

表1󰀁样品蛋白质含量的测定结果

牛奶

凯氏定氮法紫外吸收法双缩脲法考马斯亮蓝法

3.09-3.163.11

酸奶2.13-2.162.18

豆浆0.812.880.910.86

(4)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量由于双缩脲法(Biuret法)存在明显的缺点和许多限制,因此1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法(Bradford法),这是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

Bradford法的突出优点是:

a.灵敏度高。据估计,比Lowry法约高4倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。

b.测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2min即可完成,其颜色可以在1h内保持稳定,且在5~20min之间,颜色的稳定性最好,因而完全

+

2.2实验结果分析

(1)凯氏定氮法可测出全部3种样品的蛋白含量,测试结果准确,只是蒸馏与吸收装置复杂,不便于操作,实验过程所需时间较长,操作复杂。

(2)紫外吸收法无法测出牛奶、酸奶的蛋白含量,测出的豆浆蛋白含量也与实际值相差

不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。较大,不具实际使用价值。此方法实验过程简

c.干扰物质少。如干扰Lowry法的K、单,适用于测试无色样品,对于有色样品需进Na、Mg离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、行预处理,排除颜色干扰后才适用于此方法。巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是:

a.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用󰀁-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

b.仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、TritonX-100、十二烷基的酸干扰Lowry法一样)。

c.标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来3󰀁结论

4种蛋白质测定方法比较如附表所示。(3)双缩脲法适用于被测的3种样品,实验操作简便迅速,但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在1~20mg󰀁mL时测定结果较准确。因此实验前要估测被测样品的蛋白含量,把样品稀释至蛋白浓度为1~20mg󰀁mL。

(4)考马斯亮蓝染色法可以测出被测的全部3种样品,此方法快速、灵敏,但只有作微量蛋白测定时的结果才准确,因此在实验前应将样品稀释至蛋白浓度为0.1~1mg󰀁mL,而且实

+

2+

硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N验必须在1h内完成,不然测试结果不准确。

第27卷第2期杨玉芳:蛋白质含量测定方法附表󰀁蛋白质测定方法的比较

101

方󰀁法凯氏定氮法(Kjedahl法)双缩脲法(Biuret法)紫外吸收法

灵敏度时间原󰀁理用酸吸收后滴定。

干扰物质说󰀁明

灵敏度低,适用于费时,8~将蛋白氮转化为氨,非蛋白氮(可用三用于标准蛋白质含0.2~1.0mg氮,10h。误差为!2%。

氯乙酸沉淀蛋白质量的准确测定;干而分离)。

扰少;费时太长。

灵敏度低,1~中速,20~多肽键+碱性Cu2+硫酸铵;Tris缓冲用于快速测定,但20mg

30min。

∀紫色络合物。

液;某些氨基酸

不太灵敏;不同蛋白质显色相似。

较为灵敏,50~快速,5~蛋白质中的酪氨酸各种嘌呤和嘧啶;用于层析柱流出液100󰀂g

10min。

和色氨酸残基在各种核苷酸。280nm处的光吸收。

的检测;核酸的吸收可以校正。

考马斯亮蓝法(Bradford法)

灵敏度最高,1~快速,5~考马斯亮蓝染料与强碱性缓冲液;Tri󰀁最好的方法;干扰5󰀂g

15min。

蛋白质结合时,其tonX-100;SDS。 max由465nm变为595nm。

物质少;颜色稳定;颜色深浅随蛋白质不同而变化。

参󰀁考󰀁文󰀁献

1󰀁李宁.几种蛋白质测定方法的比较[J].陕

西农业大学学报2006:132~134

2󰀁蔡武成、袁厚积主编.生物物质常用化学分

析法[M].北京:化学工业出版社,1982:93

~99

3󰀁张龙翔、张庭芳、李令媛等编著.生化实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社,1981:164~169

4󰀁BradfordM.Anal.Biochem.1976,72:248

TheVariousMethodsforDetermingDifferentProteins

YangYufang

QinghaiBrightApricotBio-engineeringCo.Ltd.,Xining,Qinghai,China,810015

Abstract:Theproteinsareconnectedwiththelifeorigin,theexistenceandevolutionclosely,andthedeterminationofpro󰀁teincouldservetotheproductionandthescientificresearch.Theconcentrationsofproteinofmilk,yogurt,andsoybeanmilkaredeterminedbythemethodsofKjeldahl,UVspectrophotometry,BiuretreactionandCoomassiebrilliantblue,andthevariousmethodsarecomparedandsummarizedfromtheresultsinthispaper.

Keywords:Kjeldahl;UVspectrophotometry;Biuret;Coomassiebrilliantblue;Protein;Determination.