悬浮细胞培养技术讲义

一、 细胞传代

实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。

实验原理：

培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。

实验用品：

（一）仪器

净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；

（二）玻璃器皿

吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、

（三）塑料器皿

吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架

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（四）其他物品

微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪

（五）试剂

1640培养液、PBS

操作步骤：

1. 准备：

打开培养液，PBS；

取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

2. 从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

3. 首先观察培养板孔中培养液量。用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。

4. 离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。

5. 取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。

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6. 吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。

7. 其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。

8. 吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。

9. 镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。

二、细胞计数及生长曲线测定

培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期

潜伏期(latent phase)

细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。

(2) 指数增生期(logarithmic growth phase)

这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细

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胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。

（3）停滞期(Stagnate phase)

细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。

实验目的：

1.能独立的进行细胞技术，会绘制生长曲线，了解细胞生长的发育特性。

2. 学习在科研中如何应用生长曲线

实验原理：

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生长曲线的测定（计数法）是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。

为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数，通常计数7天。为精确起见，一般每次计数三瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，成平台状的平顶期及退化衰亡四个部分。以存活细胞数对培养时间做图，即生长曲线。

生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数期的1/3-1/2处加药。细胞技术的时间和次数依实验目的而定。

另外，测定生长曲线的常用方法还有MTT法。

计数板原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

操作步骤：

1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板，放在镜下观察。

2. 制备细胞悬液：细胞从培养板孔转移到离心管，离心1000转4-5分钟，弃去上清，加入PBS至一定体积（1ML）。

3. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，

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注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：

细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104

说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新稀释制备细胞悬液）

台盼兰染色操作步骤：

1、制备细胞悬液，放入EP管中。

2、以1：1的比例加入0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计算细胞活力。

冻存与复苏

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一、哺乳动物细胞冷冻保存

实验目的：

（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。

（2）减少细胞被微生物污染的危险性。

（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。

（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。

（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。

实验原理：

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

实验用品：

（一）仪器

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净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

（二）玻璃器皿

吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸；

（三）塑料器皿

吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）

（四）其他物品

微量加样枪、红血球计数板、记号笔、移液枪。

（五）试剂

1640培养液、DMSO（分析纯）

K562细胞，慢性粒细胞白血病细胞系中的一种。

操作步骤：

1. 准备：

打开培养液，PBS；

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取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

2. 配制冻存液：吸取9ML培养液放入离心管，用移液枪吸取1ML DMSO溶液，逐滴缓慢加入离心管中。最好把离心管插在冰中。

2. 从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

3. 吸出1个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。

4. 离心，设置离心机1000转4-5分钟。取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。轻轻吸出余下的培养液，注意勿吸出细胞沉淀。

5. 吸取1ML配制好的冻存液加入离心管，与细胞混匀后，转入冻存管。

6. 标注： 标明细胞种类、冻存日期，冻存人。

7. 在4℃冰箱中放置 30 分钟；然后转入-20℃，放置30 分钟；然后再转入-80℃放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用冻存盒。

注意事项：

（1）冻存过程需缓慢

（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。

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（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。

（5）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。

细胞复苏

操作步骤：

（一）准备工作

1、37℃水浴

2、准备一个内装5-10 ml 细胞完全培养液离心管 。

（二）复苏

1、带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，手持冻存管不断摇动。观察完全解冻后移入超净台。冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。

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2、打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀。

3、1000rpm离心5 min，弃去上清液。

4、沉淀中加入适当培养基，37℃常规培养，第二天观察生长情况。

注意事项：

1. 解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。

2. 解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，切不可直接用手，以免冻伤。

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