茅苍术及其麸炒品对胃溃疡大鼠抗炎作用的比较研究

茅苍术及其麸炒品对胃溃疡大鼠抗炎作用的比较研究

该实验旨在比较茅苍术生品和麸炒品对实验性胃溃疡大鼠的抗炎作用，初步探讨茅苍术抗胃溃疡的作用机制。采用改良Okabe法即外科手术胃黏膜局部注射乙酸法诱导大鼠胃溃疡模型。大鼠分成10组，即假手术组，模型组，奥美拉唑组，三九胃泰组，茅苍术生品和麸炒品低、中、高剂量组，灌胃给药，每日2次，连续给药10 d，腹主动脉采血，分离血清，分取胃组织溃疡面。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清及胃组织中炎症因子白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和前列腺素E2（PGE2）的含量。实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的表达。免疫组织化学法检测胃组织中TNF-α和IL-8的蛋白表达。与假手术组比较，模型组大鼠血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE2的含量明显升高，胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的表达和二者的蛋白表达量显著增加，各治疗组均出现不同程度的降低。与茅苍术生品比较，相同剂量的茅苍术麸炒品具有更好的降低血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE2的含量，下调胃组织中IL-8和TNF-α mRNA表达的作用，其中高剂量组及中剂量组均有显著性差异。茅苍术对乙酸致胃溃疡大鼠具有明显的抗炎作用，麸炒后该作用增强；茅苍术抗胃溃疡的作用部分是由于下调IL-6，IL-8，TNF-α和PGE2的含量。

标签：茅苍术；胃溃疡；炮制；ELISA；RT-PCR；免疫组织化学

[Abstract]To compare the anti-inflammatory activity of the crude Atractylodes lancea （AL） and AL processed products by stir-baking with bran in rat models of gastric ulcer， and preliminarily explore the anti-ulcer mechanisms of AL， the model of gastric ulcer was imitated by local acetic acid injection into gastric mucosa in rats by surgery according to the modified Okabe method. All rats were randomly divided into the following 10 groups： sham-operation group， model group， omeprazole group， Sanjiu Weitai granule group， crude AL low dose group， crude AL middle dose group， crude AL high dose group， processed AL low dose group， processed AL middle dose group， and processed AL high dose group. Rats were administered via intragastric （ig） two times each day， for 10 consecutive days. Blood was collected from the abdominal aorta， serum was separated， and the ulcer tissues were taken. The levels of inflammatory factors interleukin 6， 8 （IL-6， 8）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and prostaglandin E2（PGE2） in serum and gastric tissues were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and the mRNA expressions of TNF-α and IL-8 in gastric tissues were detected by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The protein expressions of TNF-α and IL-8 in gastric tissues were detected by immunohistochemistry. Compared with sham-operation group， the levels of TNF-α， IL-8， IL-6， PGE2 as well as the mRNA expressions and protein expressions of TNF-α， IL-8 in gastric tissues were significantly higher in model group. The above levels were reduced in different degrees in all treatment groups. Compared with the crude AL， same dose of processed AL was more effective in decreasing the levels of

TNF-α， IL-8， IL-6， PGE2 in serum and gastric tissues and down-regulating the mRNA expressions of TNF-α and IL-8 in gastric tissues， with significant difference in middle dose groups and high dose groups. The results showed that AL had potent anti-inflammatory effects in rat models of gastric ulcer induced by acetic acid， and the processed AL had more obvious effect. The anti-ulcer action of AL could be attributed partly to down-regulating the levels of TNF-α， IL-8， IL-6 and PGE2.[Key words]Atractylodes lancea （AL）； gastric ulcer； processing； ELISA； RT-PCR；immunohistochemistry

茅苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea Thunb. DC.的干燥根茎，始载于《神农本草经》[1]，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目之功效[2]。现代药理研究表明其具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗溃疡等多种生物活性[3-6]。茅苍术的炮制方法从古至今有很多种，但大部分炮制方法现代已不再延用，目前最为常用的炮制方法为麸炒法。胃溃疡属于中医“脾虚”、“胃虚”、“脾胃虚寒”、“胃脘痛”等范畴[7-8]。现代医学认为溃疡发生是黏膜侵袭因素和防御因素失衡的结果。胃黏膜攻击因子如炎症因子等是引起溃疡、加重溃疡、延迟溃疡愈合的重要因素[9]。本实验以乙酸诱导大鼠胃溃疡模型，采用ELISA，RT-PCR及免疫组织化学法检测血清及胃组织中重要的炎症因子白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和前列腺素E2（PGE2），考察茅苍术对胃溃疡大鼠的抗炎作用，比较生品和麸炒品抗炎作用的差异。

1 材料

INFINITE M200型多功能酶标仪（奥地利 TECAN）；Stratgene M3000 型荧光定量PCR 仪（德国Agilent公司）；DU640型核酸蛋白分析仪（美国Beckman公司）；MR1822型低温高速离心机（法国Jouan公司）；BS-51型奥林巴斯显微镜，JD801形态学图像分析系统（日本Olympus公司）。

生茅苍术购自安徽济人药业有限公司（产地江苏，批号121019），由辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为菊科植物茅苍术A. lancea的干燥根茎。麸炒茅苍术为辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心按照《中国药典》2010年版苍术项下及炮制通则（附录ⅡD）“麸炒法”进行炮制。三九胃泰颗粒（华润三九医药股份有限公司，国药准字Z44020705，批号1301022N）；奥美拉唑胶囊（吉林省东北亚药业股份有限公司，国药准字H20057570，批号20120601）。ELISA试剂盒（美国R&D生物科技有限公司）；Trizol 试剂（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒（大连TaKaRa生物科技有限公司）；荧光定量PCR试剂盒（美国Agilent公司）；免疫组织化学试剂盒（美国Zymed公司）；目标基因引物由中国科学院北京基因组研究所合成；矿物油（美国Sigma公司）。冰乙酸、水合氯醛、多聚甲醛等试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重220～240 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，合格证号SCXK（辽）2010-0001。适应性喂养1周。

2 方法

2.1 实验分组 SPF级SD大鼠100只，雌雄各半，体重220～240 g，随机分成10组，每组10只：假手术组，模型组，奥美拉唑组，三九胃泰组，茅苍术生品低、中、高剂量组，茅苍术麸炒品低、中、高剂量组。

2.2 动物造模 大鼠胃溃疡模型的制备参考Okabe等[10-11]方法改良后所建立的造模方法，即胃黏膜局部注射乙酸的方法。大鼠在术前禁食并自由饮水24 h，严格控制其食粪便及垫料，10%水合氯醛（4.0 mL·kg-1体重）肌肉注射麻醉。用0.5%碘伏消毒大鼠腹部皮肤，沿左肋下缘开腹，将胃轻轻拉出。用实验室自行设计的胃溃疡制备镊子（一种尖端为直径9 mm圆环的镊子，专利号200920015194.7）夹住距幽门部3 mm胃体部区域。将事先吸好矿物油0.18 mL和60%乙酸0.02 mL的注射器插入挟闭区的胃腔内，注入液体，45 s后从胃部吸出，再向胃腔内注入2 mL生理盐水，1 min后吸出。将胃复位，逐层缝合。假手术组以生理盐水代替乙酸。

2.3 给药 阳性对照药奥美拉唑肠溶胶囊及三九胃泰颗粒研细，茅苍术生品及麸炒品粉碎，过140目筛，临用前用蒸馏水混悬均匀。于手术后第2天采用等容积不等浓度灌胃给药，给药体积0.01 mL·g-1体重，单次给药剂量如下：奥美拉唑组0.013 g·kg-1，三九胃泰组2.08 g·kg-1，茅苍术生品低剂量组（生低组）0.625 g·kg-1，茅苍术生品中剂量组（生中组）1.25 g·kg-1，茅苍术生品高剂量组（生高组）2.5 g·kg-1，茅苍术麸炒品低剂量组（炒低组）0.625 g·kg-1，茅苍术麸炒品中剂量组（炒中组）1.25 g·kg-1，茅苍术麸炒品高剂量组（炒高组）2.5 g·kg-1，每日上午、下午各给药1次，假手术组和模型组灌胃等体积的生理盐水，连续给药10 d。

2.4 标本采集 大鼠末次给药后禁食、自由饮水15 h，严格控制其食粪便及垫料，用10%水合氯醛（4.0 mL·kg-1体重）腹腔注射麻醉，开腹，腹主动脉采血，室温放置2 h后，3 000 r·min-1离心15 min，收集血清于-70 ℃保存以备进行ELISA法检测。取出胃，沿胃大弯剪开，用生理盐水将胃黏膜冲洗干净，取出胃部溃疡处，取1/2溃疡面置4%多聚甲醛中固定以制备病理切片供免疫组化检测；另取1/4 溃疡面置Trizol试剂中保存，以备RT-PCR检测；剩余1/4 溃疡面于-70 ℃冰箱中保存，以备ELISA法检测，假手术组在相同部位切取相同面积的胃组织。2.5 ELISA法检测血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE2的含量 将胃组织自然解冻后，剪碎，称重，按9 mL·g-1加PBS液匀浆，得到胃组织匀浆液，血清样品自然解冻。用酶联免疫吸附实验法（ELISA）检测血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE2的含量，实验严格按照大鼠酶联免疫检测试剂盒使用说明书操作，用多功能酶标仪进行检测，波长450 nm测定吸光度（A）。根据对照品的浓度及对应的A，计算出相应标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A在回归方程上计算出对应的样品浓度。

2.6 实时荧光定量RT-PCR法检测胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的表达 取胃组织100 mg剪碎，按 Trizol试剂盒说明书操作，提取总RNA，即苯酚/三氯甲烷提取，异丙醇沉淀法。取总RNA 0.5 μg，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒，按说明书操作将RNA反转录成cDNA（37 ℃ 15 min，85 ℃

5 s）。DNA扩增按照Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix试剂盒说明书操作。IL-8上游引物5′-CTAGGCATCTTCGTCCGTCC-3′，下游引物5′-TTGGGCCAACAGTAGCCTTC-3′；TNF-α上游引物5′-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′，下游引物5′-AAATGGCAAATCGGCTGACG-3′，β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′，下游引物5′-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3′。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 min后采集荧光信号，重复40个循环。在循环反应后，按以下条件测溶解曲线：95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。在55 ℃升温至95 ℃过程中，每升高0.5 ℃采集一次荧光信号。以β-actin为内参，用所得各样品CT计算出各样品mRNA的相对表达量。

2.7 免疫组织化学法检测胃组织中TNF-α和IL-8的表达 胃组织石蜡切片（5 μm），常规脱蜡至水。将玻片放入装有0.01 mol·L-1柠檬酸钠溶液的容器中，置微波炉中加热至95 ℃以上，保持10 min，以修复抗原。滴加3%H2O2，室温孵育15 min，以消除内源性过氧化物酶活性。滴加10%正常山羊血清，室温孵育20 min。滴加兔抗大鼠TNF-α和IL-8（1∶100）一抗工作液，4 ℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加适量生物素化二抗工作液，37 ℃孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min。加入3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色剂显色10 min。自来水充分冲洗。用中性树胶封片。显微镜下观察染色标本，棕黄色或棕褐色为阳性表达。每个标本随机选取10个视野，用奥林巴斯数据成像系统和JD801形态学图像分析系统测定平均吸光度，进行半定量分析。

2.8 统计学方法 采用SPSS 10.0软件，多组间比较应用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，方差齐采用LSD方法（最小显著差法），方差不齐采用Tamhane′s T2方法（近似方差分析），并进一步行两两比较。结果均以±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ELISA法检测血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE2的含量 与假手术组比较，模型组4种炎症因子含量显著升高，与模型组比较，各给药组均呈现含量下降的趋势；茅苍术生品及麸炒品3个剂量组各指标均呈现一定的量效关系；经进一步组间两两比较，除个别指标炒低组与生低组无显著性差异外，其他各指标组间均呈现炒低组与生低组、炒中组与生中组、炒高组与生高组之间存在显著性差异（图1，2）。在降低IL-6，IL-8，TNF-α和PGE2的含量方面，茅苍术麸炒品的作用优于生品。

3.2 胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的相对表达量 与假手术组比较，模型组大鼠胃组织中IL-8，TNF-α mRNA的相对表达量显著升高；与模型组比较，各给药组均呈现胃组织中IL-8，TNF-α mRNA的相对表达量下降的趋势，除TNF-α生低组及炒低组外，差异有显著性；茅苍术生品及麸炒品3个剂量组各指标均呈现一定的量效关系；经进一步组间两两比较，除TNF-α炒低组与生低组无显著

性差异外，组间均呈现炒低组与生低组、炒中组与生中组、炒高组与生高组之间存在显著性差异（图3）。在降低胃组织中IL-8，TNF-α mRNA的相对表达量方面，茅苍术麸炒品的作用优于生品。

3.3 免疫组化法检测胃组织中IL-8和TNF-α蛋白表达 与假手术组比较，模型组大鼠胃组织中IL-8，TNF-α蛋白表达量显著升高；与模型组比较，各给药组均呈现胃组织中IL-8，TNF-α蛋白表达量下降的趋势，除生低组外，差异有显著性；茅苍术生品及麸炒品3个剂量组各指标均呈现一定的量效关系；经进一步组间两两比较，呈现炒低组低于生低组、炒中组低于生中组、炒高组低于生高组的趋势；与茅苍术生品比较，茅苍术麸炒品具有更好的降低胃组织中IL-8，TNF-α蛋白表达量的作用（图4）。

4 讨论

中药炮制是中医药应用的重要组成部分，是几千年中华中医药文化的瑰宝，中药炮制技术是我国所特有的，“生熟异治”更是中药在临床应用的鲜明特色[12]。茅苍术为临床常用中药，传统认为其生品燥性较强，多炮制后入药，麸炒茅苍术目前应用最为广泛，也是药典收载的唯一的炮制品种。本实验采用乙酸诱导大鼠胃溃疡模型，比较茅苍术麸炒前后对胃溃疡大鼠的抗炎作用。乙酸法是目前使用较多的一种慢性胃溃疡造模方法，一般认为乙酸法造成的溃疡模型病理形态特点与修复过程与人类消化性溃疡相似[7]，广泛用于胃溃疡的病理生理学研究、抗溃疡药物的疗效研究以及溃疡愈合的机制研究等。本实验参考Okabe方法并进行了适当的改良，在圆形挟闭区内同时注射矿物油和乙酸，矿物油比重小于乙酸，可以保护一侧胃壁，因此形成的是单个圆形深浅一致的溃疡面。PGE2是花生四烯酸环氧合酶代谢产物，为二十碳不饱和脂肪酸，是一种重要的细胞生长和调节因子。然而，PGE2过量则会成为一种较强烈的炎症因子，参与炎症反应过程，增加血管的通透性[13]。IL-8是一种很强的中性粒细胞趋化因子和活化因子，对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用[14-15]。IL-8通过促进中性粒细胞浸润及酶释放、释放氧自由基而诱发一系列病理生理变化，引起局部的炎症反应，最终导致黏膜损伤，甚至组织器官损伤[16-17]。IL-6属前炎性细胞因子，在炎症反应的诱导和延续中起重要作用[18]。TNF-α是一种重要的促炎因子，其本身具有细胞毒作用，可导致炎症、细胞坏死等，从而促进胃肠细胞的组织损害。同时，其通过诱导单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞产生并释放IL-8 等炎症因子，TNF-α亦可提高单核细胞趋化因子的分泌，促进免疫炎症反应的进展[19-21]。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组4种炎症因子均显著升高，茅苍术生品组和麸炒品组4种炎症因子均有不同程度降低。与生品组比较，茅苍术麸炒品相同剂量组血清和胃组织中PGE2，IL-6，IL-8和TNF-α的含量降低，其中炒中组与生中组、炒高组与生高组差异均具有显著性，血清中TNF-α的含量炒低组与生低组有显著性差异。茅苍术麸炒品胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的相对表达量低于相同剂量的生品组，其中炒中组与生中组、炒高组与生高组差异均具有显著性，IL-8 mRNA的相对表达量炒低组与生低组有显著性差异。

综上所述，茅苍术麸炒后对乙酸致胃溃疡大鼠的抗炎作用明显增强，同时初步表明了茅苍术抗胃溃疡的作用机制部分是通过下调炎症因子而发挥抗炎作用。

化学成分是中药发挥药效的物质基础，麸炒茅苍术抗炎作用增强，是否茅苍术经炮制后某些成分含量发生了变化，或是新增加了某些成分，亦或是促进了血液吸收，经口服给药后增加了血药浓度，这些都有待于进一步探讨，本课题组正在进行相关的深入研究。

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