(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109651508 A(43)申请公布日 2019.04.19
(21)申请号 201811323396.8(22)申请日 2018.11.08
(71)申请人 南京帆博生物科技有限公司
地址 210038 江苏省南京市经济开发区红
枫科技园A6&A7栋4层(72)发明人 李永刚 李双林 王玉婷 (51)Int.Cl.
C07K 16/28(2006.01)C07K 1/36(2006.01)C07K 1/16(2006.01)C07K 1/34(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页序列表5页 附图1页
(54)发明名称
异嗜性抗体阻断剂HBT-1及其制备方法(57)摘要
本发明提出一种异嗜性抗体阻断剂HBT-1，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Val-Gln-Ser-Ser-Ile-Thr，CDR2：Gln-Asp-Asp-Tyr-Ala-Tyr-Thr-Leu-Tyr，CDR3：Val-Tyr-Lys-Leu；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gly-Asp-Val-Leu-Ser-Lys-Ser-Cys，CDR2：Lys-Asp-Arg-Phe，CDR3：His-Ile-Ile-Ser-Thr-Ser,具备良好的亲和性。同时本发明还提出了异嗜性抗体阻断剂HBT-1的制备方法。
CN 109651508 ACN 109651508 A
权 利 要 求 书
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1.异嗜性抗体阻断剂HBT-1，其特征在于，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Val-Gln-Ser-Ser-Ile-Thr，CDR2：Gln-Asp-Asp-Tyr-Ala-Tyr-Thr-Leu-Tyr，CDR3：Val-Tyr-Lys-Leu；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gly-Asp-Val-Leu-Ser-Lys-Ser-Cys，CDR2：Lys-Asp-Arg-Phe，CDR3：His-Ile-Ile-Ser-Thr-Ser。
2.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，其特征在于，所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，其特征在于，所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.异嗜性抗体阻断剂HBT-1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：准备试剂：平衡缓冲液、解离缓冲液、透析缓冲液、pH中和液，准备设备：Protein G柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵；
步骤2：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；柱准备：填装Protein G填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，去除乙醇；
步骤3：进行平衡、上样、平衡、解离、平衡、透析、回收，保存Protein A柱，清洗蠕动泵进样管；
步骤4：配制试剂：10mM Tris-NaCl、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。
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CN 109651508 A
说 明 书
异嗜性抗体阻断剂HBT-1及其制备方法
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技术领域
[0001]本发明属于生物医学技术领域，尤其是一种异嗜性抗体阻断剂HBT-1及其制备方法。
背景技术
[0002]阻断剂，也叫受体拮抗剂，指能与受体结合，并能阻止激动剂产生效应的一类配体物质。拮抗剂对相应受体有亲和性，但没有效能，从而抑制了激动剂对受体的作用。拮抗剂可以结合受体的活性位点，也可以结合别构位点，甚至单独结合通常没有生物调节作用的位点来达到效果。拮抗剂和受体结合性质不同，所以结合时间有长有短，结合的可逆性也有不同。
[0003]拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂等类型。大部分药物拮抗剂都与内源性配体或底物竞争受体结合位点来达到效果。
[0004]受体是可被配体结合而激活的大型蛋白质分子。受体可以结合在细胞膜上，也可存在于细胞内部，比如在细胞核或线粒体中。受体在活性位点与配体以非共价键结合，一个受体上可以有多个结合不同配体的位点。配体和受体在活性位点或别构位点结合后，都可以调节受体的活性。拮抗剂可以通过结合活性位点、别构位点，或者单独结合通常不参与生物调节的位点来产生效果。
发明内容
[0005]本发明所解决的技术问题在于提供一种异嗜性抗体阻断剂HBT-1，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，具备良好的亲和性。[0006]实现本发明目的的技术解决方案为：[0007]异嗜性抗体阻断剂HBT-1，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Val-Gln-Ser-Ser-Ile-Thr，CDR2：Gln-Asp-Asp-Tyr-Ala-Tyr-Thr-Leu-Tyr，CDR3：Val-Tyr-Lys-Leu；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gly-Asp-Val-Leu-Ser-Lys-Ser-Cys，CDR2：Lys-Asp-Arg-Phe，CDR3：His-Ile-Ile-Ser-Thr-Ser。[0008]进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBT-1，所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]本发明还提出异嗜性抗体阻断剂HBT-1的制备方法，包括以下步骤：[0013]步骤1：准备试剂：平衡缓冲液、解离缓冲液、透析缓冲液、pH中和液，准备设备：
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说 明 书
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Protein G柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵；[0014]步骤2：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；柱准备：填装Protein G填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，去除乙醇；[0015]步骤3：进行平衡、上样、平衡、解离、平衡、透析、回收，保存Protein A柱，清洗蠕动泵进样管；
[0016]步骤4：配制试剂：10mM Tris-NaCl、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。
[0017]本发明采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：[0018]本发明筛选出异嗜性抗体阻断剂HBT-1，并获得其重链和轻链可变区，测序后得到其独特的核苷酸序列，具有良好的亲和性。附图说明
[0019]图1是本发明的亲和力数据结果图。
具体实施方式
[0020]下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。[0021]实施例1
[0022]异嗜性抗体阻断剂HBT-1，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Val-Gln-Ser-Ser-Ile-Thr，CDR2：Gln-Asp-Asp-Tyr-Ala-Tyr-Thr-Leu-Tyr，CDR3：Val-Tyr-Lys-Leu；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gly-Asp-Val-Leu-Ser-Lys-Ser-Cys，CDR2：Lys-Asp-Arg-Phe，CDR3：His-Ile-Ile-Ser-Thr-Ser。[0023]重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0024]如图1所示，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBT-1具备良好的亲和力，其与其他阻断剂相比如下表所示：
[0025]
Loading Sample IDResponseKD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)本发明阻断剂0.73591.08E-104.51E+054.87E-05其他阻断剂1.01461.04E-094.50E+054.70E-04[0026]异嗜性抗体阻断剂HBT-1的制备方法具体包括以下步骤：[0027]步骤1：准备试剂：平衡缓冲液、解离缓冲液、透析缓冲液、pH中和液，准备设备：Protein G柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵；[0028]步骤2：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；柱准备：填装Protein G填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，去除乙醇；
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说 明 书
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步骤3：进行平衡、上样、平衡、解离、平衡、透析、回收，保存Protein A柱，清洗蠕动
泵进样管；
[0030]步骤4：配制试剂：10mM Tris-NaCl、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。[0031]实施例2
[0032]异嗜性抗体阻断剂HBT-1的制备方法如下：[0033]一、准备：[0034]1、试剂准备：[0035]平衡缓冲液：10mM Tris-NaCl(pH 8.3)[0036]解离缓冲液：0.1M甘氨酸(pH 2.7)[0037]透析缓冲液：20mM Tris-NaCl(pH7.5)或10mM PBS(pH7.4)[0038]pH中和液：2M Tris(pH8.0)[0039]2、设备准备：[0040]Protein G柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵。[0041]二、制备操作[0042]1、样品准备：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清。[0043]柱准备：填装Protein G填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，去除乙醇；[0044]2、平衡：Protein G柱用平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH 8.3)平衡5倍柱体积，柱平衡好后将蛋白紫外检测仪显示值调整为0，作为基线；[0045]3、上样：腹水用两倍体积的平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH 8.3)稀释作为样品上样，使用蠕动泵在20-25℃条件下缓慢上样；[0046]4、平衡：上样完成后再用平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH 8.3)平衡5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测仪显示值为0；[0047]5、解离：平衡完成后使用0.1M甘氨酸(pH 2.7)进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白；[0048]6、平衡：解离完成后继续用0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗涤柱至无蛋白流出，用平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH 8.3)平衡柱约5-10倍柱体积；[0049]7、透析：合并收集蛋白组分，使用透析缓冲液20mM Tris-NaCl(pH7.5)或10mM PBS(pH7.4)透析，透析比例为1:50，换液3次，每次透析时间不低于4小时；[0050]8、抗体处理：透析完成后回收抗体并用0.22μm滤膜过滤后添加0.09％NaN3保存蛋白。
[0051]三、Protein G柱保存[0052]Protein G柱长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存。[0053]四、蠕动泵进样管的清洗
[0054]同一蠕动泵处理其它样品时应使用该样品上样缓冲液冲洗5-10遍硅胶管再进行其它操作。[0055]五、试剂配制[0056]1、10mM Tris-NaCl(pH 8.3)
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原料来源1L标准量北京益利1.21g北京益利11.688g自制，质检合格1L
[0058]用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至8.3，定容至1L。[0059]2、0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.7)
[0060]
品名TrisNaCl纯化水
原料来源1L标准量北京益利7.51g自制，质检合格1L
[0061]用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至2.7，定容至1L。[0062]3、20mM Tris-NaCl(pH7.5)
[0063]
品名甘氨酸纯化水
原料来源1L标准量北京益利2.4218g北京益利11.688g自制，质检合格1L
[0064]用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至7.5，定容至1L。[0065]4、2M Tris(pH8.0)
[0066]
品名TrisNaCl纯化水
原料来源1L标准量北京益利242.18g自制，质检合格1L
[0067]用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至8.0，定容至1L。[0068]5、透析缓冲液：10mM PBS(pH7.4)
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品名Tris纯化水
品名原料要求1L标准量Na2HPO4·12H2O国药2.87gNaH2PO4·2H2O国药0.31gNaCl国药9g纯化水自制，质检合格1L[0070]用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至7.4，定容至1L。
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说 明 书 附 图
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