高效价的多黏菌素E甲磺酸钠[发明专利]

2024-07-19 来源：个人技术集锦

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109996806 A(43)申请公布日 2019.07.09

(21)申请号 201780074766.6(22)申请日 2017.12.11

(66)本国优先权数据

201611128884.4 2016.12.09 CN(85)PCT国际申请进入国家阶段日

2019.06.03(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/CN2017/115467 2017.12.11(87)PCT国际申请的公布数据

WO2018/103758 ZH 2018.06.14

(71)申请人正大天晴药业集团股份有限公司

地址 222062 江苏省连云港市海州区郁州

南路369号

申请人上海医药工业研究院　

上海多米瑞生物技术有限公司(54)发明名称

高效价的多黏菌素E2甲磺酸钠(57)摘要

提供一种高效价的多黏菌素E 2甲磺酸钠，其制备方法以及在制备治疗革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。

(72)发明人冯军　张喜全　吴勇　郭猛　

薛春佳　胡明通　朱裕辉　周杰　王猛力　(51)Int.Cl.

C07K 7/62(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/36(2006.01)C07K 1/16(2006.01)A61K 38/12(2006.01)A61P 31/04(2006.01)

CN 109996806 A8卜S

(12)

(19)

按照专利合作条约所公布的国际申请

世界知识产权组织

国际局

(10)

国际公布号

国际公布日

2018年6月14日（14.06.2018)

(43)

(51)

PCT

WO2018/103758A1

国际专利分类号：

C07KC07KC07K

7/62(2006.01)1/34(2006.1/36(2006.01)

)

C07KA61K6

1/16(238/12/PCT/CN20

2017

)

(2006.01)(2006.01)17/115467

(74)代理人：北京信慧永光知识产权代理有限

责任公司（BEIJING

PROPERTY

LTD.)

;

SUNHOPE

100191

INTELLECTUAL(CN)。

中国北京市海淀区知春路9号

坤讯大厦1106室，Beijing

(81)

(21)(22)(25)(26)(30)

国际申请号国际申请日申请语公布语优先权：

201611128884.4

指定国（除另有指明，要求每一种可提供的国家保护）：AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,

BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,丽，MW,MX,MY,ML,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,

年12月11日(11.12.2017)

中文中文

2016年12月9曰（09.12.2016)

(71)申请人：上

(SHANGHAIINDUSTRY)

海

[CN/CN]

医药工业研究院PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW(84)

。

INSTITUTEOFPHARMACEUTICAL

(CN)。

TAI

；中国上海市静安区北京

200040

西路1320号，Shanghai

PHARMACEUTICAL

正大天晴

TIANQING[CN/CN]

药业集团股份有限公司（CHIA

GROUP

(CN)。

指定国（除另有指明，要求每一种可提供的地区保护）：ARIPO

(BW,

GH,GM,KE,LR,LS,MW,

MZ,

NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),

CO.,LTD.)；

中国江苏省连云港市海州区郁州南路369号,

Jiangsu

222062

欧亚（AM,

上海多米瑞生物技术

DUOMIRUI

[CN/CN]

BIOLOGICAL

欧洲(AL,AT,BE,BG,

MT,NL,NO,PL,PT,

有限公司(SHANGHAI

TECHNOLOGY

CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,

RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OAPI(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG)

。

CO.,LTD.)；中国上海市

浦东新区中国（上海）自由贸易试验区张衡路1559号1幢2B15室，Shanghai201203(CN)„

(72)

发明人：冯军(FENG,全(ZHANG,

(WU,Yong);Shanghai

Xiquan)

;

Jim);中国上海市静安区

200040

(CN)。

北京西路1320号，Shanghai区郁州南路369号，Jiangsu

200040(CN)。

(CN)„

张喜吴勇

本国际公布：

-包括国际检索报告(条约第21条(3))。

中国江苏省连云港市海州

222062

(CN)„

中国上海市静安区北京西路1320号,

郭猛(GUO,Meng)；中国

；中国上

200040

江苏省连云港市海州区郁州南路369号，Jiangsu

222062

薛春佳（XUE,Chunjia)

;

海市静安区北京西路1320号，Shanghai

(CN)„

胡明通（HU,Mingtong)朱裕辉(ZHU,

Yuh

i);

中国江苏省连

222062

云港市海州区郁州南路369号，Jiangsu

(CN

。

中国上海市静安

200040

(CN)。

区北京西路1320号，Shanghai杰(ZHOU,

(WANG,

周

Jie)；中国江苏省连云港市海州区

222062

(CN)„

郁州南路369号，Jiangsu

Mengli)

王猛力

；中国江苏省连云港市海州区

222062

(CN)„

郁州南路369号，Jiangsu

(54)

Title:HIGH-TITER

POLYMYXIN

E2SODIUM

METHANESULFONATE

(54)发明名称：高效价的多黏菌素E2甲磺酸钠(57)Abstract:medicament

Provided

areahigh-titer

polymyxin

sodiummethanesulfonate,

preparation

methodandusethereofinpreparing

fortreatinggram-negativebacterialinfection.

(57)摘要：提供一种高效价的多黏菌素E

甲磺酸钠，其制备方法以及在制备治疗

革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。

高效价的多黏菌素E2甲磺酸钠

技术领域

本发明属于医药领域，涉及效价不低于SOO^!g/mg的多黏菌素E2甲磺酸钠、其制备方法以及在制备治疗革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。背景技术

多黏菌素E(colistin)

是一种由多种组分组成的多肽类抗生素，主要由£1和E2组成（或称为A或B)

。

在20世纪50年代，多黏菌素E就应用于临床，主要用于革兰氏阴性菌引起的感染，特别是由多重耐药铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等引起感染的治疗。临床使用的多黏菌素E类产品有两种，一种是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(也称硫酸黏菌素），另一种是供注射用的多黏菌素E甲磺酸钠(Colistimethate

Sodium)

。这两种药物均是多组分药物，在硫酸多黏菌素E中，含有

，同样在多黏菌素

Ε2、Ε3等至少5

甲磺酸钠、多

种组分（参见欧洲药典7.0)

Ε甲磺酸钠中也至少含有对应的多黏菌素

黏菌素E2甲磺酸钠等5种组份，然而，不同的组分可能会带来药效学、药代动力学和毒理学的差异，为了保证多黏菌素E产品的批间质量稳定性，需制备单一组分的多黏菌素E组合物。

中国专利申请CN102190710A

公开了一种多黏菌素£2组合物，其中多黏菌素E2的结构如式I所示，

Og/mg,尽管其效价高于市

。

实施例4公开了多黏菌素E2甲磺酸钠组合物的制备，所述组合物的效价为售产品，但经测

中国专利申请CN104918951A公开了一种含有至少3个氨基被甲磺酸钠基双修饰的组合物，其中实施

例2公开了10修饰的多黏菌素E2甲磺酸钠的制备，其相比于CMS对照物一般具有较低的活性。

因此，仍需提供高效价且产品批间质量稳定的多黏菌素E2甲磺酸钠。发明内容

本发明一方面提供一种多黏菌素E2甲磺酸钠，其效价不低于60(^g/mg在一些优选实施方案中，其效价不低于62(^g/mg

。

在一些更优选的实施方案中，其效价不低于64(^g/mg在一些特别优选的实施方案中，其效价不低于660在一些实施方案中，本发明的多黏菌素Dbu的

。

甲磺酸钠包含修饰产物，其中修饰指，多黏菌素

取代。优选的，Dbu的

结构中，

γ氨基被甲磺酸钠基（-CH2S03Na)或甲醇基（-CH2OH)

取代。

γ氨基被甲磺酸钠

基（-CH2S03Na)

在本发明的一些优选实施方案中，本发明的多黏菌素构中，Dbu的

甲磺酸钠包含4修饰产物，即多黏菌素结

γ氨基被4个甲磺酸钠基（-C¾S03Na)取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，4

。

修饰产物占25%-50%。进一步优选的，4修饰产物占30%-43%

在本发明的一些优选实施方案中，本发明的多黏菌素

甲磺酸钠包含6修饰产物，即多黏菌素结

构中，Dbu的

γ氨基被6个甲磺酸钠基（-C¾S03Na)取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，6

甲磺酸钠包含8修饰产物，即多黏菌素

结

修饰产物占35%-65%。进一步优选的，6修饰产物占45%-55%。

在本发明的一些优选实施方案中，本发明的多黏菌素构中，Dbu的

γ氨基被8个甲磺酸钠基（-C¾S03Na)取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，8

修饰产物占5%-22%。进一步优选的，8修饰产物占7%-17%。

在本发明的一些更优选的实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物、6修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的取代，其中在HPLC

γ氨基被4个甲磺酸钠基（-CH2S03Na)

或6个甲磺酸钠基（-CH2S03Na)

图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25%-50%，6修饰产物占35%-65%。进一步

优选的，4修饰产物占30%-43%，6修饰产物占45%-55%。

在本发明的一些更优选的实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物、8修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的取代，其中在HPLC

γ氨基被4个甲磺酸钠基（-CH2S03Na)

或8个甲磺酸钠基（-CH2S03Na)

图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25%-50%，8修饰产物占5%-22%。进一步

优选的，4修饰产物占30%-43%，8修饰产物占7%-17%。

在本发明的一些更优选的实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物、6修饰产物、8修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu(-CH

S03Na)

的

γ氨基被4个甲磺酸钠基（-CH2S03Na)

取代，其中在HPLC

、6个甲磺酸钠基

或8个甲磺酸钠基（-CH2S03Na)

图谱中以面积归一化法计，4修饰

产物占25%-50%，6修饰产物占35%-65%，8修饰产物占5%-22%。进一步优选的，4修饰产物占30%-43%，6修饰产物占45%-55%，8修饰产物占7%-17%。

本发明再一方面提供一种制备效价不低于SOO^!g/mg的多黏菌素E2甲磺酸钠的方法，包括：(1)以硫酸多黏菌素E为原料，通过层析纯化得到纯度≥96%的硫酸多黏菌素E2;(2)

1:10-20；

(3)

向步骤（2)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，继续反应，其中硫酸多黏菌素E2与亚硫酸氢钠通过超滤的方式纯化步骤（3)的反应液，超滤膜的截留分子量在1000-4000

之间，向得到的超

将步骤（1)得到的硫酸多黏菌素E2与甲醛溶液反应，其中硫酸多黏菌素E2与甲醛的摩尔比为

的摩尔比为1:10-20;

(4)

滤截留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水，再进行超滤，再向得到的超滤截留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水，如此反复多次，当电导率降至2.0mS/cm-3.0mS/cm

(5)

时停止超滤；

将步骤（4)所得的超滤截留液进行冷冻干燥，得到多黏菌素E2甲磺酸钠。

更优选不

在一些实施方案中，多黏菌素E2甲磺酸钠的效价不低于低于660^ig/mg。

在一些实施方案中，步骤（1)中，使用反相层析进行纯化，层析填料选自反相硅胶基质（例如C18填料）或反相聚合物层析介质（例如以聚苯乙條/二乙烯苯或聚丙烯酸酯为骨架的反相聚合物层析介质，优选为陶氏化学公司出品的Amberchrom

XT30

或者苏州纳微生物科技有限公司生产的NM-100);

层析的流

动相选自乙醇的硫酸稀溶液或乙醇的盐酸稀溶液，pH控制在2.0-3.0;洗脱，优选为等度分段洗脱。

在-一些实施方案中，步骤(2)在-一些实施方案中，步骤(2)在-一些实施方案中，步骤(2)在-一些实施方案中，步骤(2)在-一些实施方案中，步骤(3)在-一些实施方案中，步骤(3)在-一些实施方案中，步骤(3)在-一些实施方案中，步骤(4)

洗脱方式选自等度分段洗脱或梯度

中，硫酸多黏菌素E2与甲醛的摩尔比优选为1:12-18。中，控制反应温度在20-25C。中，控制pH在6.5-7.5。

中，控制反应时间在1.5-2.5小时，优选为2小时。

中，硫酸多黏菌素E2与亚硫酸氢钠的摩尔比优选为1:12-18。中，控制pH在6.8-7.2。

中，控制反应时间在15-20小时，优选为18小时。中的超滤膜的截留分子量优选为1000-3000。

在-一些实施方案中，步骤（4)中，优选向超滤截留液中加入超滤截留液3-5倍体积的水，更优选向超

滤截留液中加入超滤截留液3.5-4.5倍体积的水，特别优选向超滤截留液中加入超滤截留液4倍体积的水。

在一些实施方案中，步骤（4)中，控制超滤时的温度在20-25C。在一些实施方案中，步骤（4)中，优选电导率降至2.2mS/cm-2.8mS/cm降至2.4mS/cm-2.6mS/cm

时停止超滤，特别优选电导率降至2.5mS/cm

时停止超滤，更优选电导率

时停止超滤。

本发明再一方面提供多黏菌素甲磺酸钠在制备治疗革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。优选的，所

细菌。

述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌或NDM-1

例如，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠可用于治疗敏感革兰阴性杆菌引起的急性或慢性感染，特别是针对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌（carbapenem败血症、肺炎、膀胱炎、肾炎等。

本发明的制备方法，通过制备高纯度的硫酸多黏菌素E2，以及在超滤过程中保证超滤截留液中多黏菌素E2甲磺酸钠高浓度（即超滤截留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水进行超滤），出乎意料地得到了高效价（不低于SOO^!g/mg)且修饰产物稳定的的多黏菌素E2甲磺酸钠，在保证产品高效的同时也保证了产品的批间质量稳定，有利于保证临床疗效的一致性和用药安全性。附图说明

图1:实施例1制备的硫酸多黏菌素E2的HPLC图2:实施例3制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC图3:实施例4制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC图4:实施例5制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC图5:实施例6制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。实施例1多黏菌素E2甲磺酸钠的制备

(1)

resistant

Enterobacteriaceae,

CRE)

和铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等引起的肺部感染、尿路感染、消化道感染或血液感染等，包括但不限于

图谱。图谱。图谱。图谱。图谱。

纯化硫酸多黏菌素E2

的

称取工业级硫酸多黏菌素E(购自绿康生化股份有限公司）适量，加水溶解，制成每lml含120mg溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下：

层析填料：聚苯乙條/二乙烯苯为骨架的反相微球，型号为XT-30,公司

柱规格：50x250mm流速：20.0ml/min上样量：300ml

洗脱条件：先用含3%乙醇的硫酸稀溶液（用0.05mol/L含8%乙醇的硫酸稀溶液（用0.05mol/L酸稀溶液（用0.05mol/L

收集：50ml/管。

收集样品的分析及处理：用分析型HPLC度大于96%的收集液合并，用2mol/L

硫酸调溶液的pH值为2.4)洗脱5CV,

，

产自美国陶氏（DOW)化学有限

柱体积（CV):491ml

再用

硫酸调溶液的pH值为2.4)洗脱30CV,最后用含60%乙醇的硫

硫酸调溶液的pH值为2.4)洗脱5CV。

分析（分析条件参照硫酸多黏菌素E的欧洲药典7.0)，将纯

图谱参见图1。

氢氧化钠溶液调溶液的pH值为5.0后并于55C下减压蒸馏浓缩后得

到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2，其HPLC

多黏菌素E2甲磺酸钠的制备

将步骤（1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25C水浴10mm后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L

NaOHpH

调节pH使其维持在6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40%NaHS0

溶液16ml，用2.5mol/L

NaOH

调节公

至7.0，水浴控制温度于25C下反应18h。将反应液用截留分子量为3000Da的超滤膜（MILLIPORE

司）进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到200ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25C之间，截留液的pH维持在6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25C，再按照同样的方式补加去离子水到200ml

进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素

甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。

实施例2多黏菌素E2甲磺酸钠修饰度分析

通过LC-MS

(1)LC-MSHPLC

对实施例1制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。

检测方法

条件如下：仪器：Shimadzu

UFLC

XR(LC-20AD

XR泵；SIL-20AC

XR自动进样器；CTO-20AC

柱温箱；SPD-M20A

检测器）

色谱柱：WatersAtlantis流动相：Α相：lOmM

B相:

10mM

T3(150mmx4.6mm,

3µιη)620#

甲酸铵-乙腈（95:5)

甲酸铵-乙腈（50:50)

线性梯度洗脱，洗脱程序如下表：

时间（分钟）

010353644

流动相A(%)

8068538080

流动相B(%)

2032472020

流速：l.Oml/min柱温：30C检测波长：210nm质谱条件如下：

仪器：ABSCIEX

Triple

TOF4600

(ESI)

离子源：DuoSpray™IonSource参数：

离子化方式：负离子气帘气CUR(Curtain雾化气GS1(Gas1):

Gas):35psi60psi

辅助加热气GS2(Gas2):60psi喷雾电压ISVF雾化温度TEM

(IonSpray

Voltage

：

Floating):-4500V

(Temperature)

550°C

：

碰撞能量CE(CollisionEnergy)35V

Spread):

：

碰撞能量范围CES(Collision去簇电压DP(Declustering

EnergyPotential)

15V

80V

扫描范围（MassRange):m/z100-2000

(2)LC-MS

分析结果

在质谱数据解析公式中：1155为多黏菌素E2的分子量，82为H2S0表1多黏菌素E2甲磺酸钠LC-MS色谱峰的保留时间

1.4min

的分子量，12为C的分子量。

分析结果及数据解析

数据解析

(

923.27x2+2-1

155-82x7

)

负离子模式下的特征离子峰（双电荷）

923.27

修饰度

10修饰

；882.29；

841.30÷12=10((

882.29x2+2-1841.30x2+2-1870.28x2+2-1829.30x2+2-1788.32x2+2-1

155-82x6155-82x5155-82x6155-82x5155-82x4

)))))

÷12=10÷12=10

1.8min2.5min3.0min3.4min4.7min8.8min9.1minll.Omin11.4min11.9min13.0min13.7min15.1min18.2min19.6min23.7min24.7min25.7min26.5min28.9min30.0

870.28788.32

；829.30；(((

修饰

÷12=8÷12=8÷12=8

870.29；829.30；782.32

870.29；829.30

858.29776.32858.29

；817.30；817.30；817.30；817.30

；；；；

；817.30

；

((((

858.29x2+2-1817.30x2+2-1776.32x2+2-1735.33x2+2-1

155-82x6155-82x5155-82x4155-82x3

))))

修饰

÷12=6÷12=6÷12=6÷12=6

776.32

858.29

776.32

858.29

776.32

858.29

776.32

858.29；817.30；776.32

817.30

；776.32；；817.30

；

((

764.32x2+2-1723.33x2+2-1

155-82x4155-82x3

))

735.33

858.29

776.32

764.32；723.33

修饰

764.32；723.33764.32

764.32；723.33764.32；723.33764.32764.32764.32

÷12=4÷12=4

即，1.8min、2.5min、3.0min、3.4min、4.7min得到的多黏菌素E2甲磺酸钠为8修饰产物;

8.8min、9.1min、11.0min、11.4min、11.9min、13.0min、13.7min、15.1min得到的多黏菌素E2甲磺酸

钠为6修饰产物；18.2min、19.6min、23.7min、24.7min、25.7min、26.5min、28.9min、30.0min得到的多黏菌素E2甲磺酸钠为4修饰产物。

经面积归一化法测定，8修饰产物占8.7%、6修饰产物占46.0%，4修饰产物占42.7%。实施例3多黏菌素E2甲磺酸钠的制备

参照实施例1步骤（1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。

将步骤（1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25C水浴10mm后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L

NaOH调节pH使其维持在至6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40%NaHS0

溶液16ml，用2.5mol/LNaOH调

节pH至7.0，水浴控制温度于25C下反应18h。将反应液用截留分子量为3000Da的超滤膜（MILLIPORE公司）进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到220ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25C之间，截留液的pH维持在至6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25C，再按照同样的方式

补加去离子水到220ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。

左右时停止超滤。将脱盐后的多黏

采用下述HPLC对实施例3制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。

HPLC条件如下：

色谱柱：XSELECT

B相：乙腈

CSHC18(4.6x250mm5µιη)

流动相：Α相：甲酸铵溶液（称取甲酸铵3.15g，加水溶解并定容至1L。）

线性梯度洗脱，洗脱程序如下表：

时间（分钟）

0635607071

流动相A(%)

90.085.080.075.040.090.090.0

流动相B(%)

10.015.020.025.060.010.010.0

流速：0.8ml/min柱温：30C检测波长：230nm

所得HPLC图谱参见图2，保留时间在10-20mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；

22-50min

得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠

的4修饰产物。

经面积归一化法测定，8修饰产物占7.9%、6修饰产物占50.8%，4修饰产物占41.3%。实施例4多黏菌素E2甲磺酸钠的制备

参照实施例1步骤（1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。

将步骤（1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25C水浴10mm后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L

NaOH调节pH使其维持在至6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40%NaHS0

溶液16ml，用2.5mol/LNaOH调

节pH至7.0，水浴控制温度于25C下反应18h。将反应液用截留分子量为3000Da的超滤膜（MILLIPORE公司）进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到180ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25C之间，截留液的pH维持在至6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25C，再按照同样的方式补加去离子水到180ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。

采用HPLC对实施例4制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。

HPLC条件同实施例3。

左右时停止超滤。将脱盐后的多黏

所得HPLC图谱参见图3，保留时间在10-20mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；

22-50min

得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠

的4修饰产物。

经面积归一化法测定，8修饰产物占15.2%、6修饰产物占54.6%，4修饰产物占30.2%。实施例5多黏菌素E2甲磺酸钠的制备

参照实施例1步骤（1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。

将步骤（1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25C水浴10mm后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L

NaOH调节pH使其维持在6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40%NaHS0

溶液16ml，用2.5mol/LNaOH调节

至7.0，水浴控制温度于25C下反应18h。将反应液用截留分子量为lOOODa的超滤膜（MILLIPORE公司）进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到240ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25C之间，截留液的pH维持在至6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25C，再按照同样的方式补加去离子水到240ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。

采用HPLC对实施例5制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。

HPLC

条件同实施例3。

所得HPLC图谱参见图4，保留时间在10-20mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；22-50min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的4修饰产物。

经面积归一化法测定，8修饰产物占13.3%、6修饰产物占54.9%，4修饰产物占31.7%。实施例6多黏菌素E2甲磺酸钠的制备

参照实施例1步骤（1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。

将步骤（1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25C水浴10mm后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/LNaOH调节pH使其维持在6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40%NaHS03溶液16ml，用2.5mol/LNaOH调节pH至7.0，水浴控制温度于25C下反应18h。将反应液用截留分子量为lOOODa的超滤膜（MILLIPORE公司）进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到190ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25C之间，截留液的pH维持在6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25C，再按照同样的方式补加去离子水到190ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素E甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。

采用HPLC对实施例6制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。

HPLC

条件同实施例3。

所得HPLC图谱参见图5，保留时间在10-20mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；22-50min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65mm得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的4修饰产物。

经面积归一化法测定，8修饰产物占8.3%、6修饰产物占50.8%，4修饰产物占40.9%。实施例7抗菌活性测定

采用美国药典公布的多黏菌素E甲磺酸钠效价测定方法，以多黏菌素E甲磺酸钠的美国药典标准品（批号：H3J047,效价为42(^g/mg)作为对照，分别对实施例1、3-6制备的多黏菌素E2甲磺酸钠和参比制剂(美国JHP制药公司，批号：762042)进行活性测定，具体结果参见下表。

多黏菌素E甲磺酸钠效价测定结果

另以大肠杆菌和铜绿假单孢菌为指示菌，比较这些多黏菌素E甲磺酸钠的抗菌活性差异，具体结果参

见下表。

多黏菌素E甲磺酸钠MIC(pg/mL)

测定结果

实施例8毒性测定

取SD大鼠20只，分为多黏菌素E2甲磺酸钠组

（5

雌5雄）、参比制剂组

（5

雌5雄），设不同的剂量，

静脉推注，每天1次，连续7天，比较动物的死亡率。试验结果参见下表。

多黏菌素E甲磺酸钠对大鼠急性毒性（死亡率）比较结果

参比制剂和多黏菌素E2甲磺酸钠给药后的毒性症状为：瘫软无力，耳朵、四肢、嘴巴红肿。死亡前全身瘫软无力，呼吸微弱。死亡后，全身水肿。解剖：未见明显的脏器异常。毒性反应的严重性与给药浓度相关，浓度越高越严重。

给药后参比制剂组动物较同剂量下多黏菌素E2甲磺酸钠组动物的反应严重。相同给药剂量下多黏菌素E2甲磺酸钠组动物死亡率较参比制剂组低，而且参比制剂有两个剂量组

总之，相同给药条件下多黏菌素

（80、40mg/kg),

在给药2次或3

次的情况下动物就出现了死亡，同剂量下的多黏菌素E2甲磺酸钠在给药4次后仍未出现死亡或少量死亡。

甲磺酸钠的毒性作用显著弱于参比制剂。

权利要求书

1.一种多黏菌素E2甲磺酸钠，其效价不低于60(^g/mg，优选不低于

更优选不低于64(^g/mg，

特别优选不低于66(^g/mg。

2.权利要求1的多黏菌素E2甲磺酸钠，其包含修饰产物，其中修饰指，多黏菌素E

构中，Dbu的γ氨

基被甲磺酸钠基或甲醇基取代，优选的，Dbu的γ氨基被甲磺酸钠基取代。

3.权利要求2的多黏菌素Ε2甲磺酸钠，其包含4修饰产物，即多黏菌素Ε2结构中，Dbu的γ氨基被4个

甲磺酸钠基取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25%-50%，进一步优选的，4修饰产物占30%-43%。

4.权利要求2的多黏菌素Ε2甲磺酸钠，其包含6修饰产物，即多黏菌素Ε2结构中，Dbu的γ氨基被6个

甲磺酸钠基取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，6修饰产物占35%-65%，进一步优选的，6修饰产物占45%-55%。

5.权利要求2的多黏菌素Ε2甲磺酸钠，其包含8修饰产物，即多黏菌素E

构中，Dbu的γ氨基被8个

甲磺酸钠基取代，其中，在HPLC修饰产物占7%-17%。

图谱中以面积归一化法计，8修饰产物占5%-22%，进一步优选的，8

6.权利要求2的多黏菌素E2甲磺酸钠，其包含4修饰产物、6修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的

γ氨基被4个甲磺酸钠基或6个甲磺酸钠基取代，其中在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占

25%-50%,

6修饰产物占35%-65%，进一步优选的，4修饰产物占30%-43%，6修饰产物占45%-55%。

7.权利要求2的多黏菌素E2甲磺酸钠，其包含4修饰产物、8修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的

γ氨基被4个甲磺酸钠基或8个甲磺酸钠基取代，其中在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占

25%-50%,

8修饰产物占5%-22%，进一步优选的，4修饰产物占30%-43%，8修饰产物占7%-17%。

权利要求2的多黏菌素E2甲磺酸钠，其包含4修饰产物、6修饰产物、8修饰产物，即多黏菌素E

构中，Dbu的γ氨基被4个甲磺酸钠基、6个甲磺酸钠基或8个甲磺酸钠基取代，其中在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25%-50%，6修饰产物占35%-65%，8修饰产物占5%-22%，进一步优选的，4修饰产物占30%-43%，6修饰产物占45%-55%，8修饰产物占7%-17%。

9.权利要求1-8中任一项的多黏菌素E2甲磺酸钠的制备方法，包括：

(1)以硫酸多黏菌素E为原料，通过层析纯化得到纯度≥96%的硫酸多黏菌素E2;

(2)将步骤（1)得到的硫酸多黏菌素E2与甲醛溶液反应，其中硫酸多黏菌素E2与甲醛的摩尔比为1:10-20;(3)向步骤

（2

)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，继续反应，其中硫酸多黏菌素E2与亚硫酸氢钠的摩

尔比为1:10-20;

(4)通过超滤的方式纯化步骤

（3

)的反应液，超滤膜的截留分子量在1000-4000之间，向得到的超滤截

留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水，再进行超滤，再向得到的超滤截留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水，如此反复多次，当电导率降至2.0mS/cm-3.0mS/cm

(5)将步骤

（4

时停止超滤；

)所得的超滤截留液进行冷冻干燥，得到多黏菌素E2甲磺酸钠。

10.权利要求1-8中任一项的多黏菌素E2甲磺酸钠在制备治疗革兰氏阴性菌感染的药物中的用途，优选的，

所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌或NDM-1细菌。

INTERNATIONALSEARCHREPORT

InternationalapplicationNo.

PCT/CN2017/115467

CLASSIFICATION

OFSUBJECT

MATTER

C07K7/62(2006.01)i;C07K1/34(2006.01)i;C07K1/36(2006.01)i;C07K1/16(2006.01)i;A61K38/12(2006.01)i;A61P31/04

(2006.01)i

AccordingB.

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searchtermsused)

黏霉素，粘霉素,

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DWPI,

SIPOABS,

search(nameofdatabaseand,wherepracticable,

CNKI,

BAIDU,

ISIWebofKnowledge,googlescholarandsearchterms:titer,valence,potency,

分类号等

黏菌素，粘菌素，粘杆菌素，黏杆菌素，抗敌素，甲磺酸钠，黏菌素甲磺酸钠，粘菌素甲磺酸钠，制备，分离，纯化，提取，效价,polymyxin,C.

colistin,

colistimethate

sodium,isolat+,extrac+,separat+,purifi+,TOBERELEVANT

whereappropriate,

oftherelevantpassages

RelevanttoclaimNo.

1,10

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高效价的多黏菌素E甲磺酸钠[发明专利]