第３２卷第３期 ２０１０年３月 中国预防兽医学报 Ｖｏ１．３２．Ｎｏ．３ Ｍａｒ．２０１０ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 套式ＲＴ—ＰＣＲ检测牛呼吸道合胞体病毒的研究 史鸿飞 ，朱远茂 ，高欲燃１，２，任宪刚 ，冯军科 ，于 作 ，薛 飞 （１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／大动物传染病研究室，黑龙江哈尔滨１５０００１； ２．东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０） 摘要：为了检测牛呼吸道合胞体病毒（ＢＲＳＶ），根据已发表的融合蛋白（Ｆ）基因序列，设计了套式ＲＴ－ＰＣＲ 引物，初步建立了ＢＲＳＶ的套式ＲＴ—ＰＣＲ检测方法。对１３８份牛鼻腔棉拭子进行了检测，结果检测到了ＢＲＳＶ阳 性样品５４份，总的阳性检出率为３９．１％。对大部分ＢＲＳＶ阳性样品的Ｆ基因扩增产物进行了序列测定与分析。 用该套式ＲＴ．ＰＣＲ对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒３型、牛病毒性腹泻病毒等进行了检测，结果无交叉 反应，表明该检测方法具有良好的特异性。本研究首次用套式ＲＴ．ＰＣＲ技术证实了我国部分省的牛群中存在 ＢＲＳＶ感染。 关键词：牛呼吸道合胞体病毒；套式ＲＴ ＰＣＲ；牛鼻腔拭子 中图分类号：￥８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—０５８９（２０１０）０３－０２３８—０３ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－－ｎｅｓｔｅｄ・－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ＳＨＩ Ｈｏｎｇ—ｆｅｉ ，ＺＨＵ Ｙｕａｎ—ｍａｏ ，ＧＡＯ Ｙｕ—ｒａｎ ，ＲＥＮ Ｘｉａｎ—ｇａｎｇ ， ＦＥＮＧ Ｊｕｎ—ｋｅ ，ＹＵ Ｚｕｏ ，ＸＵＥ Ｆｅｉ （１．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａ￣ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｕｒｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｆｏｒ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ（ＢＲＳＶ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）ｇｅｎｅ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＢＲＳＶ．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １ ３８ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎａｓａｌ ｓｗａｂ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｆｏｒ ＢＲＳＶ，ａｎｄ ５４ ｏｆ １３８ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ（３９．１％）．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｎｏ ｃｒｏｓｓ—ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｕｓ ｔｒｙｐｅ ３，ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｉｃ ｆｏｒ ＢＲＳＶ ｄｅｔｅｃｔｉｆｏｎ，Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＲＳＶ ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｓｏｍｅ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｕｓ；ｎｅｓｔｒｅｄ ＲＴ—ＰＣＲ；ｂｏｖｉｎｅ ｎａｓａｌ ｓｗａｂｓ 牛呼吸道合胞体病毒（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ，ＢＲＳＶ）为副黏病毒科、肺病毒属成员，是引 起犊牛呼吸系统疾病的主要病原之一。常引起牛群 ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 的急性暴发感染，临床表现为发热、咳嗽、呼吸困 难，呈严重的问质性肺炎。自１９７０年首次在美国分 离到ＢＲＳＶ以来…，在许多国家和地区相继分离到 收稿日期：２００９—０７—１２ 基金项目：黑龙江省“十一五”科技攻关项目（ＧＡ０６Ｂ２０２—３） 作者简介：史鸿ｑ￣（１９８４一），男，湖北天门人，硕士研究生，主要从事动物病毒分子生物学研究 通信作者：Ｅ．ｍａｉｌ：ｘｕｅｆｅｉｃｎｈ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 第３期 史鸿飞 等．套式ＲＴ—ＰＣＲ检测牛呼吸道合胞体病毒的研究 ２３９ 该病毒 。ＢＲＳＶ主要感染６月龄以上的牛，发病率 在７０％以上，病死率在一些暴发中可高达２０％【５Ｊ。 １．５ ｃＤＮＡ样品的ＰＣＲ扩增取５ 上述反转录 产物ｃＤＮＡ作为模板，用外侧引物Ｐ１、Ｐ２进行第一 近年来，在我国不同地区相继有牛呼吸道病发生， 在ｌ临床症状与病理剖检变化与ＢＲＳＶ感染非常相 似，通过截短表达的ＢＲＳＶ Ｇ蛋白的血清学检测， 表明国内存在ＢＲＳＶ血清阳性牛ｆ６１。 ２００８年我国多个省份发生了犊牛肺炎疫情，在 病牛的样品中检测并分离到了牛源荚膜血清Ａ型多 轮ＰＣＲ扩增，反应体积为５０ Ｌ。反应条件：９３℃ ３ ｍｉｎ；９４℃３０ ｓ、５６℃４５ Ｓ、７２℃９０ Ｓ，３０个循 环，最后一个循环７２℃延伸１０ ｍｉｎ。 取０．５ ｐ．Ｌ第一次ＰＣＲ扩增产物为模板，用内 侧引物Ｐ３、Ｐ４进行第二轮ＰＣＲ扩增。反应条件同 第一轮ＰＣＲ。扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测。 杀性巴氏杆菌与牛支原体【７＿８］。在流行病学调查中发 现所有患有肺炎的犊牛都表现出一个共同特点，即 用抗生素治疗后基本无效，提示有病毒性病原的存 在。为此，我们利用套式ＲＴ—ＰＣＲ对临床样品进行 了检测，结果在２００８年从山东采集的牛鼻腔棉拭子 中检测到了牛呼吸道ＢＲＳＶ。这是在国内首次用套 式ＲＴ．ＰＣＲ检测到了ＢＲＳＶ，之前国内一直没有该 病原的报道。随后对来自黑龙江、辽宁及山东济南 的样品中也检测到了ＢＲＳＶ。这些结果进一步证实 国内已存在ＢＲＳＶ感染的流行。 １ 材料和方法 １．１ 病毒株及样品来源 牛副流感病毒３型 （ＢＰ１Ｖ．３）、牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）、牛传染性鼻 气管炎病毒（ＩＢＲＶ）由本实验室保存。牛鼻腔棉拭子 样品：２００８年采集的山东省样品６７份、黑龙江省 样品２０份，２００９年采集的辽宁省样品１２份、山东 省样品３９份。 １．２ 主要试剂ＴＲＩｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司； Ｐｒｉｍｅｒｓｃｒｉｐｔ反转录酶试剂盒、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、 ｐＭＤ１８．Ｔ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００均购自ＴａＫａＲａ公 司；ＤＮＡ琼脂糖胶回收试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司。 １．３引物设计根据已发表的ＢＲＳＶ的基因序列， 选择Ｆ基因的保守区设计了２对引物，外侧引物Ｐｌ （５’一ＣＡＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧ一３’）、Ｐ２（５’一ＣＣＡ ＣＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＧＡＡＴＡＡＣＴ一３’）预期扩增片段大小 为７７１ ｂｐ，内侧引物Ｐ３（５’．ＡＡＧＡＴＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣ ＡＧＴＡＧＴＧ一３’）、Ｐ４（５＇－ＣＡＣＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＴＧＴＡ ＴＧＴ．３’）预期扩增片段大小为５１５ ｂｐ。 １．４总ＲＮＡ抽提与ｃＤＮＡ合成取牛鼻腔棉拭子 样品浸出液，参照ＴＲＩｚｏｌ试剂说明书抽提总ＲＮＡ。 用Ｐ１作为反转录引物，按照Ｐｒｉｍｅｒｓｃｒｉｐｔ的使用说 明书进行反转录制备ｃＤＮＡ样品。 １．６ ＰＣＲ扩增产物的回收与测序将ＰＣＲ产物纯 化回收，连接于ｐＭＤ１８．Ｔ中，转化受体菌、提取质 粒，测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。 将测定的序列进行ＢＬＡＳＴ分析和鉴定扩增产物。 １＿７特异性试验按照１．４中的方法分别提取 ＢＶＤＶ和ＢＰＩＶ．３总ＲＮＡ，反转录获得ｃＤＮＡ；同时 制备ＩＢＲＶ基因组ＤＮＡ样品。按照１．５中的方法进 行ＰＣＲ扩增，扩增产物用１％凝胶电泳检测。 ２结果与讨论 用针对ＢＲＳＶ Ｆ基因的套式ＲＴ．ＰＣＲ检测１３８ 份牛鼻腔棉拭子样品，结果显示５４份样品为ＢＲＳＶ 阳性，阳性率为３９．１％。其中，山东２００８年的６７ 份样品有４１份呈阳性（６１．２％）；黑龙江２０份样品 有６份呈阳性（３０％）；辽宁ｌ２份样品有３份呈阳性 （２５％）；山东２００９年的３９份样品有４份呈阳性（１０．３％） （表１）。 表１ 牛鼻腔拭子样品及检测结果 Ｔａｂｌｅ ｌ Ｄｅ￣ｃｆｉＯｎ ｏｆＢＲＳＶ ｆｒｏｍ １３８ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＢＲＳＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｒｅａｓ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｏｓｔｉｖｅ Ｐｏｓｔｉｖｅ ｒａｔｅ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｊｉａｘｉａｎｇ ２００８ ６７ ２６ ４１ ６１．２％ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ ２００８ ２０ １４ ６ ３Ｏ％ Ｌｉａｏｎｉｎｇ ２００９ １２ ９ ３ ２５％ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｊｉｎｉａｎ ２００９ ３９ ３５ ４ ｌＯ．３％ Ｔｏｔａｌ １３８ ８４ ５４ ３９．１％ 将大部分ＢＲＳＶ阳性样品的ＲＴ．ＰＣＲ回收产物 进行测序。将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中登录的ＢＲＳＶ 的Ｆ基因序列进行ＢＬＡＳＴ对比分析，其核苷酸同 源性为９７％，氨基酸同源性为９５％。 采用上述引物对几种常见的牛呼吸道病毒性传 染病的病原进行套式ＲＴ．ＰＣＲ扩增。结果只有 ＢＲＳＶ阳性样品能扩增出一条长约５００ ｂｐ的特异性 目的基因片段，而ＢＶＤＶ、ＢＰＩＶ一３、ＩＢＲＶ、阴性对