维普资讯 http://www.cqvip.com 中国乳品工业 ｄｑｉｒｙ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａ１．ｎｅｔ．ｃｎ 三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法在液态 奶蛋白质检测中适用性研究 牛巍，侯彩云，祝晓芳，刘莹 （中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京１０００８３） 摘 要：分别利用三氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸铜沉淀蛋白法与凯氏定氮法相结合，对液态奶蛋白质进行测定。比较研究了亚硝酸钠、硝 酸铵、尿素、甘氨酸、水解蛋白等几种非蛋白氮对这两种蛋白沉淀法的影响，并对这两种方法进行比较。结果表明，对于液态奶蛋白氮的 测定．三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法在数值上存在着显著性差异，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋白氮对液态奶蛋白氮测定的 影响。 关键词：液态奶：三氯乙酸；硫酸铜；凯氏定氮 中图分类号：ＴＳ２５２．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—２２３０（２００８）０９—００５９—０３ ＴＣＡ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｕｐｒｉｃｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ＮＩＵ Ｗｅｉ，ＨｏＵ Ｃａｉ—ｙｕｎ，ＺＨＵ Ｘｉａｏ—ｆａｎｇ，ＬＩＵ Ｙｉｎｇ （ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １ ０００８３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｂｙ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ Ｃｕｐｒｉｃｓｕｌｆａｔｅ． Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｖ￣ｏ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｏｉｌ Ｓｏｄｉｕｍ Ｎｉｔｒｉｔｅ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ、Ｕｒｅａ，Ｇｌｙｃｉｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｕｍ ｅｆ－ ｆｅｃｔｅｄ Ｏｉｌ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔ ｉｓ ｓｈｏｗｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔＷＯ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｘｉｓｔ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｖｅｒｓｉＷ ａｎｄ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ｍｏｒｅ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｃｕｐｒｉｃｓｕｌｆａｔｅ ｏｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｉｌｋ；ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ；ｃｕｐｒｉｃｓｕｌｆａｔｅ；Ｋｉｅｌｄａｈｌ ０ 引 言 凯氏定氮法 经过人们长期的应用和不断改进．凯氏 定氮法已演变成常量法、微量法、半微量法、改良凯氏 牛乳中富含大量的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质及 法和自动定氮法等，具有应用范围广、灵敏度高、回收 多种维生素．而乳蛋白是牛乳中最重要的特征营养成 率好及不需要昂贵仪器等优点［２－３１。根据测定原理，在 分之一 蛋白质是生命活动的基础物质。是构成人体 消化过程中除蛋白质中的氮转化成（ＮＨ４），ＳＯ，外，样品 新生组织、维持人体健康的重要成分．它有多种生物 中非蛋白质中的氮也能转化成（ＮＨ４）２Ｓ０ ，计算氮的含 学功能：酶的催化作用、激素的生理调节作用、血红蛋 量时，认为所有的氮都来源于蛋白质。因此，测定结果 白的运载作用等【１ ｌ蛋白质摄入不足或蛋白质丢失过 比实际值偏高 所以．用凯氏定氮法测定的蛋白质为 多将会导致人体发生多种综合病症 粗蛋白 凯氏定氮法的这一漏洞有可能给一些不法 测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法 此法是 厂商的制假售劣制造了可乘之机 通过测定出样品中的总氮含量再乘以相应的蛋白质 三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法是两种常规沉 系数而求出蛋白质含量的 目前．现行国家标准ＧＢ／Ｔ 淀蛋白质的方法。硫酸铜沉淀法的原理是：蛋白质在 ５４１３．１—１９９７中规定．液态乳中蛋白质含量的测定采用 高浓度的金属离子作用下．因盐析作用会生成沉淀 收稿日期：２００７—１２—３０ 在煮沸的样品中加入硫酸铜溶液．使得蛋白质发生沉 作者简介：牛巍（１９８４一）．硕士，从事农产品加工与贮藏方面的研究 淀，非蛋白氮在沸水中溶解．过滤后将二者分离的方 通讯作者：侯彩云 式．以达到测定蛋白氮的目的 三氯乙酸作为蛋白质 夕 维普资讯 http://www.cqvip.com 测定方法Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ 变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水 基团，使之聚集沉淀。两种沉淀法应用在液态乳中．都 准确吸取表格１中１～７号样品各１ ｍＬ加入５ ｍＬ质 量分数为１０％的ＴＣＡ溶液，在室温下静置１０ ｍｉｎ然后 能达到使液态乳蛋白与非蛋白分离的效果 本研究便 是利用这两种沉淀法对添加了非蛋白氮的液态奶进 在１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ的条件下离心１５ ｍｉｎ。利用凯氏定氮法 测定沉淀蛋白的蛋白氮质量浓度，每个样品平行３次 １．３．３ 两种方法检测适用性比较 行蛋白氮的测定，旨在反映其方法在液态奶蛋白氮检 测中的适用性 （Ｉ）两种方法测定市售５种品牌液态奶结果比较 １ 实 验 １．１ 材料 分别用三氯乙酸沉淀法、硫酸铜沉淀法测定市售 ５种品牌液态奶蛋白氮，比较这两种方法的测定值 （２）非乳蛋白氮对两种方法测定的比较 （ＮＰＮ）：亚硝酸 市购液态奶；７种非蛋白含氮物按照表１中所示的比例，向市售的三种液态奶中 添加７种非蛋白氮，分别用三氯乙酸沉淀法和硫酸铜 钠，硝酸铵，尿素，甘氨酸，水解蛋白１，水解蛋白２，水 解蛋白３；经凯氏定氮法测定水解蛋白１．水解蛋白２和 沉淀法测定其样品蛋白氮含量，对其测定数值进行 比较 水解蛋白３的粗蛋白质量分数分别为９４．２７ｇ／１００ｇ、 ９３．８０ｇ／１００ｇ；￣１００．ＯＯｇ／ｌＯＯｇ。 试剂（均为分析纯）：盐酸，浓硫酸，五水合硫酸 铜，硫酸钾，氢氧化钠，硼酸，甲基红，溴甲酚绿。 １．２仪器 ２结果与分析 图１为硫酸铜沉淀法所测定的７种样品的实测蛋 ２．１ 三氯乙酸沉淀法检测结果 分析天平（ＦＡ２００４），消煮炉（ＫＸＬ一１０１０），定氮仪 （ＫＤＹ－９８２０），微量吸取器，高速冷冻离心机２０Ｇ－１Ｉ），半微量滴定管。 １．３１．３．１白氮的质量浓度，按照样品号依次为２．９０，２．９３，２．９４， ２．９５，３．７３，３．８３，３．９８ｇ（均为每１０ｏＩｎＬ中）。 （ＧＬ一 方法 硫酸铜沉淀法 ｇ ８．Ｏ０ ｂ ７．Ｏ０ ６．Ｏ０ 购取某种品牌液态奶．经凯氏定氮法测定其蛋白 质量浓度为２．９７ ｇ／ｌＯ０ ｎｉＬ 吸取此液态乳５ ｍＬ ７份． 按表１所示比例，加入７种非蛋白氮，编号为１～７，以Ａ表 示样品中理论粗蛋白质量浓度．Ｂ表示样品中实际乳 蛋白质量浓度 表１样品组成 准确吸取表格１中１～７号样品各１ ｍＬ，放入５０ ｍＬ 离心管中．加入１０ ｍＬ蒸馏水．加热至沸，向烧杯中徐 徐倒入５ ｒｎＬ质量分数为６％的ＣｕＳＯ 溶液．边倒边搅 拌．加热１０ ｍｉｎ后，再慢慢倒入５ｍＬ质量分数为１．２５％ 的ＮａＯＨ溶液，边倒边搅拌，然后在室温下静置２ ｈ，用 慢速定量滤纸过滤．用热蒸馏水洗烧杯，直至用质量 分数为１０％的ＢａＣｌ，检查滤液不生成白色沉淀为止。将 漏斗连同滤纸置于５０￣６０℃烘箱中，烘至略潮，取下带 有沉淀物质的滤纸．连同滤纸用凯氏定氮法测定．结 果即为各样品中的蛋白氮质量浓度。此实验平行３次。 １．３．２三氯乙酸沉淀法 ６ ｌ８牵第 甭９期 ２｛ 朝） 维普资讯 http://www.cqvip.com
Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ测定方法 定值和硫酸铜沉淀法的测定值与理论蛋白值相差较 小．最高差值分别为０．２７和０．２４。而添加了３种水解蛋 骞８．００ 白的５，６，７ ｙ－样品．其三氯乙酸沉淀法的测定值与理 。ｌ７．００ 如６．Ｏ０ 论蛋白值相差较小．硫酸铜沉淀法则与理论蛋白值相 ＝＝＝５．０Ｏ 差较大．３种品牌添加水解蛋白的样品测定值与理论 ． ． 蛋白值的差值都在０．５以上 这说明三氯乙酸沉淀较硫 酸铜沉淀在液态奶蛋白质的测定中更具有广泛的适 ＿。 用 眭 ３ 结 论 （１）三氯乙酸沉淀法测定液态奶的蛋白值受非蛋 白氮，即亚硝酸钠、硝酸铵、尿素、甘氨酸、３种水解蛋 白的影响较小，是一种能较准确测定液态奶蛋白氮的 沉淀方法 （２）硫酸铜沉淀法测定液态奶的蛋白值受亚硝酸 钠、硝酸铵、尿素、甘氨酸这４种非蛋白氮的影响较小， 而对于添加了３种水解蛋白的液态奶．则检测蛋白氮 含量要比其理论蛋白氮质量浓度较高 （３）三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法在测定合 格液态奶的蛋白氮，这两种方法具有显著性的差异． 而三氯乙酸沉淀法能更广泛的排除非蛋白氮对液态 奶蛋白氮的影响．其比硫酸铜沉淀法更具有广泛的 适用性 表２ 三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法的比较ｇ／１００ｍＬ 参考文献： …郑林，钱波林．婴儿奶粉技术的发展现状 食品研究与开发，２００４，２４ （６）：１４～１６． １２Ｊ朱彦群，倪群．牛乳中蛋白质的快速测定Ｕ］．现代食品科技，，２２（１）： １２７－１２８． ［３】杨翠英，王小杰，杨增，等．奶粉中蛋白质样品消化方法的改进Ｕ】．中国 ２．３．２非乳蛋白氮对两种方法的影响 公共卫生【Ｉｌ１２００６，２２，３：３７８ 表３为３种品牌液态奶添］Ｊｌ１７种非蛋白氮后的三氯 ［４］盛成乐关于凯氏定氮法测定蛋白质的几个问题Ｕ］技术交流，４３． 乙酸沉淀法测定值与其理论蛋白氮的差值和硫酸铜 沉淀法测定值与其理论蛋白氮差值的对比结果。 表３ 两种沉淀法的蛋白差值比较 ｇ／１００ｍＬ 注：Ｐｒ为三氯乙酸沉淀法测定值与凯氏定氮法测定值的差值：Ｐｒ＂为 硫酸铜沉淀法测定值与凯氏定氮法测定值的差值 由表３可以看出，１～４号样品，即添加了亚硝酸钠硝酸铵、尿素和甘氨酸的样品其三氯乙酸沉淀法的测 ｆ．３６． ．９ ２００８（ｔ。 ｚ ２１４）６１