真菌感染检测方法的研究进展

中国真菌学杂志２０１７年８月第１２卷第４期Ｃ　Ｉｎ　！　！垒　ｇ　！！　！！　！　．　・综述・　真菌感染检测方法的研究进展　余菁　马越娥　史玉玲　（同济大学附属第十人民医院皮肤科，上海２０００７２）　【摘要】近年来，随着抗生素、免疫抑制剂和激素等的广泛应用，真菌感染有不断上升的趋势，真菌已成为医院感染的常见　病原菌之一。由于不同病原菌对抗真菌药物的敏感性不同，能否准确诊断病原菌直接影响药物的选择。及时准确地检测真　菌感染以及确定菌种，在临床治疗中尤为重要。该文对真菌感染检测方法的研究进展作一综述。　【关键词】真菌感染；病原菌；检测方法　【中图分类号】Ｒ　３７９　【文献标识码】Ｂ　【文章编号１　１６７３　３８２７（２Ｏ１　７）１　２－０２５２—０５　真菌感染是指一种或多种真菌侵犯机体组织，　由真菌或其代谢产物引起的疾病，其范围可从浅表　感染到深部组织感染。近年来，真菌感染发生率不　及酵母）的细胞壁产生荧光标记，包括皮肤癣菌、马　拉色菌、念珠菌、曲霉及各类变异的菌丝结构，而且　特异性高，反应时间只需数秒钟即可完成，大大提　断上升，真菌的继发感染问题也越来越多［　。真菌　检测对临床的诊断与治疗尤为重要，随着真菌检测　高了临床真菌检测灵敏度和效率。适用于皮屑、甲　屑、毛发、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各种标　本。荧光染色后，真菌（菌丝和孢子）在镜下为清　晰的亮蓝色，菌丝的横隔结构和孢子的出芽形态清　晰可见，非常易于识别。特别是在ＫＯＨ涂片中真　技术的发展，有越来越多的方法可以应用于真菌的　检测和鉴定。　１　真菌镜检　菌孢子与脂肪滴有时很难鉴别，而荧光染色法对脂　肪滴不产生标记，使得特异性大大提高，弥补了传　统的ＫＯＨ涂片法在真菌数量少时检出率不高的　不足。已有许多文献证实荧光染色法在真菌检测　中较传统的ＫＯＨ湿片法具有敏感性强、阳性率高　真菌镜检是应用最为普遍的真菌检查。最常　用的是１０　～２０　ＫＯＨ溶液涂片法，操作简便，　能够快速判定有无真菌感染，但其不能鉴定菌种，　而且由于缺乏颜色对比，需要观察者有很熟练的　检查技术，导致存在５　～１５　左右假阴性　］。　的特点ｌ４］。在具备荧光显微镜的条件下，荧光染色　法可取代传统的ＫＯＨ湿片法，成为常规真菌镜检　的一种优良检测方法［５］。　１．２派克墨水染色　在ＫＯＨ中加入二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）后可以快速　溶解角质而不需加热，更容易辨认真菌结构，并能　与人工假象相区别。通过提高ＫＯＨ浓度及添加　渗透剂ＤＭＳＯ，可促进角质细胞化学变性，使背　派克墨水染液的配制：用２Ｏ　ＫＯＨ溶液和派　克墨水各半混匀即成。经派克墨水染色的标本在　镜下菌丝、孢子均被染成蓝色，而背景上的角质细　胞、脂滴、气泡均不着色，对比鲜明，尤其利于马拉　景清楚，减少纤维织物和细胞间隙干扰，易于辨　认，特别是针对指、趾甲标本有其优越性＿３］。此　外，还有许多特殊的染色方法，可以使真菌结构更　加清晰可辨。　１．１　荧光染色　色菌孢子与背景脂滴、气泡的鉴别，在低倍镜下即　可迅速发现目标孢子。　１．３乳酸酚棉蓝染色法　目前，多种荧光染料（包括异硫氰酸荧光素、　Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ　Ｆｌａｖｉｎｅ染料、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ　Ｗｈｉｔｅ染料　等）由于与真菌细胞壁的纤维素或几丁质有很强的　亲和力而被用于真菌的染色上，使各类真菌（霉菌　作者简介：余菁，女（汉族），硕士研究生在读．Ｅ—ｍａｉｌ：２２８０９９４９５４＠　ｑｑ．ｔｏｍ　乳酸酚棉蓝染色是比较常用的一种染色方法，　染色后菌丝和孢子呈深蓝色。形态结构清晰，背景　干净，反差大。乳酸可杀灭真菌，棉蓝可使其着色，　甘油可使玻片长期保存＿６］，可以提高镜检阳性率。　１．４过碘酸雪夫（ＰＡＳ）染色　ＰＡＳ染色镜检可看到真菌呈红色或紫红色，　通信作者：史玉玲，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈｉｙｕｌｉｎｇｌ９７３＠ｔｏｎｇｊｉ．ｅｄｕ．ｃｎ　±垦皇堕堂盘查　！生　筮　鲞第４期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍｙｃｏｌ，Ａｕｇｕｓｔ　２０１７，Ｖｏｌ　１２，Ｎｏ．４　胞核蓝色。其原理是由于真菌荚膜有多糖类物　质，过碘酸能氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛　基与无色品红结合又能生成新的红色品红复合　物。ＰＡＳ对真菌染色特异性强，着色鲜艳，易观　２．１改良沙氏琼脂培养基　根据不同用途可以将沙氏琼脂培养基进行改　良，加入维生素Ｂ　０．１　ｍｇ／ｍＬ，可以促进紫色毛癣　菌和断发毛癣菌生长繁殖；加入酵母浸膏５　ｍｇ／　ｍＬ，可促进皮肤癣菌生长。　察，比较简单方便，是鉴别真菌非常好的方法，值　得推广Ｅ７－８３。目前多用于深部真菌病理切片的真　菌染色。　１．５芝加哥天蓝染色　２．２科马嘉（ＣＨＲＯＭａｇａｒ）显色培养基　科马嘉显色培养基是一种新型的鉴定培养基，　能对临床常见的假丝酵母菌进行分离并根据菌落　的颜色快速鉴定常见菌种口　。根据培养基上生长　芝加哥天蓝染色即用１　ｇ固体芝加哥天蓝加　入到１００　ｍＬ　１０　ＡＫＯＨ充分溶解用于涂片，镜下　ｏ可见蓝色的孢子及菌丝，及淡红色的皮屑等杂质背　景，形成鲜明的色彩对比，这对于在低倍镜下或技　术不够熟练的观察者，能更快速发现真菌的菌丝及　孢子等特征结构。芝加哥天蓝涂片镜检提供了一　个更快速、准确的诊断方法，已有用于浅表真菌感　染检查的报道＿ｇ］。　１．６六胺银染色　六胺银染色使真菌菌丝和孢子呈明显的黑褐　色，细胞核红色。其原理是用５　铬酸氧化真菌内　的多糖化合物而暴露出醛基，醛基还原六胺银成为　黑色的金属银＿８］。　１．７其他　除上述染色方法外，还有苏木精一伊红（ＨＥ）　染色、革兰染色、抗酸染色、嗜银染色、吉姆萨染色、　黏蛋白卡红染色、子囊孢子染色、美蓝染色、Ｓｅｌｌｅｒ　染色、Ｇｒｉｄｌｅｙ染色、Ｗｒｉｇｈｔ染色等多种方法可用　于真菌的染色检查。　２真菌培养　真菌培养检查是将待测标本在一定温度和湿　度下进行培养，２～４周后根据生长真菌的菌落形　态和镜下结构进行菌种鉴定。临床上常用真菌培　养基有沙氏葡萄糖琼脂培养基（ＳＤＡ）、马铃薯培　养基（ＰＤＡ）。ＳＤＡ是将葡萄糖４０　ｇ、蛋白胨１Ｏ　ｇ、琼脂１８～２０　ｇ加入烧杯或铝锅内，加少量蒸馏　水加热溶解，待完全溶解后补足蒸馏水至１　０００　ｍＬ，分装试管，ｌｌ５℃１０　ｍｉｎ高压灭菌。ＳＤＡ主　要用于临床真菌常规培养。ＰＤＡ即把铃薯２００　ｇ，　洗皮切成碎块，加水煮沸２０　ｍｉｎ，纱布过滤，滤液　中加入琼脂２０　ｇ，葡萄糖２０　ｇ，加热使之溶化，再补　足蒸馏水至１　０００　ｍＬ，分装，高压灭菌。ＰＤＡ可用　于真菌的培养及曲霉菌和青霉菌的鉴定。此外，还　有许多常用的培养基【＿】。。。　菌落的颜色和形态进行判断：绿色菌落为白色假丝　酵母菌即白念珠菌，蓝灰色菌落为热带念珠菌，粉　红色、边缘模糊、有微毛的为克柔念珠菌，紫红色为　光滑念珠菌，白色为其他念珠菌属。对于混合感染　的标本，也可以根据菌落在培养基上呈现的不同颜　色作出判断。用科马嘉显色培养基快速鉴定常见　念珠菌属，目前已广泛应用于临床真菌培养。　２．３米饭培养基　米饭培养基即按１　ｇ大米、３　ｍＬ水的比例放　人试管或培养皿中，１２１℃１５　ｍｉｎ高压灭菌备用。　可用于鉴别非典型的羊毛状小孢子菌和奥杜盎小　孢子菌，还能促进许多皮肤癣菌产生其特征性分生　孢子，有助于菌种鉴定。　２．４玉米粉吐温琼脂　玉米粉吐温琼脂即将玉米粉５０　ｇ混于水中，　６５℃水浴１　ｈ，过滤，蒸馏水补足１　０００　ｍＬ，再加入　葡萄糖２　ｇ、琼脂１５　ｇ、吐温一８０，１２１℃１０　ｍｉｎ高压　灭菌后分装，冷却后冰箱保存。它能促进红色毛癣　菌产生深红色色素，可用于红色毛癣菌的鉴别。如　不加葡萄糖，玉米粉吐温琼脂可用作念珠菌鉴定的　小培养，以促进白念珠菌假菌丝和厚壁孢子的形　成，也会促进暗色孢科真菌孢子的形成。　２．５尿素琼脂　尿素琼脂是将葡萄糖１０　ｇ、蛋白胨１　ｇ、ＮａＣ１　５　ｇ，ＫＨ。ＰＯ　２　ｇ，０．０２　酚红水溶液６　ｍＬ，蒸馏水１　０００　ｍＬ混匀后调ｐＨ至６．８，加入琼脂２０　ｇ，煮沸　至琼脂完全溶解，１０　ｍｉｎ高压灭菌，取出后冷却至　４５￣５０℃时，每４５０　ｍＬ培养基中加入抽滤灭菌的　２０　９／６尿素溶液５０　ｍＬ，混合均匀后分装斜面，冷却　后备用。新生隐球菌等一些隐球菌和一些酵母能　够产生尿素酶，而许多其他酵母却不能产生尿素　酶，尿素酶能分解培养基中的尿素，并形成大量的　氨，使培养基ｐＨ值升高而呈碱性，使酚红指示剂　变红，因此尿素琼脂可用于隐球菌的鉴定。另外皮　中国真菌学杂志２０１７年８月第１２卷第４期Ｃｈｉｎ　！　，垒　ｇ　！　！！　！　！：　肤癣菌的尿素酶试验用含５　葡萄糖的此培养基，　用于鉴别红色毛癣菌和须癣毛癣菌。　２．６其他　除上述培养方法，常用的培养基还有咖啡酸　琼脂，用于鉴别新生隐球菌；芽管实验培养基，可　鉴定白念珠菌；脑心浸膏琼脂（ＢＨＩ），双相真菌　可在该培养基上呈酵母相；卡菌鉴定培养基，鉴定　奴卡菌与链霉菌；葡萄糖酵母汁蛋白胨液体基，可　分离培养酵母菌；子囊琼脂、石膏块培养基，可培　养酵母菌产生子囊孢子；Ｌｅｅｍｉｎｇ和Ｎｏｔｍａｎ培养　基、橄榄油培养基、七叶苷琼脂可用于培养鉴定马　拉色菌；皮肤癣菌鉴别琼脂（ＤＴＭ），用于鉴定皮　肤癣菌等等。　３真菌检测方法的新进展　针对真菌感染，除了通过真菌培养菌落特征来　鉴别常见菌种，目前有越来越多的新的真菌检测方　法，在检测是否有真菌感染、抗真菌药物有效性及　准确鉴定各种菌种等方面起到了重要作用。　３．１分子生物学检测　目前，常用的分子生物学分型方法有很多，包　括多聚酶链式反应（ＰＣＲ）、分子杂交、随机扩增片　段长度多态性（ＲＡＰＤ）、脉冲场凝胶电泳（ＰＦ—　ＧＥ）、限制性片段长度多态性聚合酶链反应（ＰＣＲ—　ＲＦＬＰ）、多位点序列分析（ＭＬＳＴ）、重复序列　ＰＣＲ、实时荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ—ＰＣＲ）、任意引物聚　合酶链反应（ＡＰ—ＰＣＲ）、单链构象多态性分析　（ＳＳＣＰ）、ＤＮＡ序列分析、基因芯片技术等。其中　ＭＩ　ＳＴ技术是目前公认的最为权威客观的分子分　型方法＿１。　。其基础是通过ＰＣＲ技术，分析真菌　ｒＤＮＡ和ＩＴＳ核酸序列，从基因水平上分析各菌种　之间的亲缘关系，使得菌种鉴定更加准确、可靠。　ｒＤＮＡ基因是一种串联重复基因，其序列和重复次　数有显著的株间差异，可用于种水平的鉴定　。　ｒＤＮＡ上的１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓ　ｒＤＮＡ基因序列进化速　率慢且相对保守，存在广泛的异种同源性，其中小　亚基１８Ｓ　ｒＤＮＡ序列常被用来研究属及属以上分　类群的演化关系，大亚基２８Ｓ　ｒＤＮＡ中的Ｄ１／Ｄ２　区域可用于属及临近等级的分类群ｌ１　。ｒＤＮＡ间　的间隔区为内转录间隔区（ＩＴＳ），由于进化相对迅　速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学　研究。Ｓｃｈｏｃｈ等提出ｒＤＮＡ　ＩＴＳ作为真核生物域　的第二大界——真菌界的ＤＮＡ条形码，以利于真　菌多型分类生态学和生物多样性的研究ｕ　。　３．２质谱技术　２０世纪８０年代以来，有４种软电离质谱技术　产生，分别为等离子体解吸质谱技术（ＰＤ—ＭＳ）、基　质辅助激光解吸电离技术（ＭＡＬＤＩ　ＭＳ）、快原子　轰击质谱技术（ＦＡＢ—ＭＳ）和电喷雾质谱技术　（ＥＳＩ—ＭＳ）。其中，ＭＡＬＤＩ和ＥＳＩ两种技术突破性　解决了极性大和热不稳定类蛋白质以及相关生物　大分子的测定问题，具有高灵敏度、高准确度等优　点。在此基础上，相关衍生和串联技术也不断产　生，如ＰＣＲ—ＥＳＩ—ＭＳ、ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ等。其中，　ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ　ＭＳ是目前应用最为广泛的一种质　谱技术口　。它通过直接检测生物标志物（蛋白）鉴　定病毒、细菌、真菌及分枝杆菌，具有高敏感性、高　通量和快速的特点。不同真菌通过质谱仪得到不　同的蛋白质图谱，与数据库进行比对，根据图谱的　匹配度，得出鉴定结果和相应的鉴定分值，分值越　高匹配度越好，结果越可信　。因此，质谱法准确　性依赖数据库中菌株种类，实验室需不断更新和补　充数据库。质谱技术在酵母菌属鉴定应用比较广　泛，数据库已包括了大量临床酵母菌的参考图谱，　常用于鉴定常见酵母菌（白假丝酵母、光滑假丝酵　母、热带假丝酵母、克柔假丝酵母和近平滑假丝酵　母），准确率高　。Ｒａｎｑｕｅ等发现质谱仪对以下　丝状真菌鉴定效果较好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癣　菌、镰刀菌、木霉和毛霉目，特别是临床常见的曲霉　菌。但是数据库中只有少量的丝状真菌参考图谱，　标本的制备程序复杂还需改进。另外，丝状真菌的　图谱很容易受到真菌不同阶段的产物包括孢子、子　实体、表面菌丝和基内菌丝体等的影响　。　３．３　１，３一Ｊ３一Ｄ－葡聚糖定量分析（Ｇ试验）　所有真菌的细胞壁均含有１，３　Ｊ３　Ｄ一葡聚糖，而　其他微生物及人的细胞和细胞外液都不含这种成　分。当真菌进入人体血液或深部组织后，吞噬细胞　的吞噬、消化等作用使１，３一ｌ３一Ｄ一葡聚糖从胞壁中释　放出来，使其在血液及其他体液（如尿液、脑脊液、　腹水、胸腔积液等）中的含量增高，而在浅部真菌感　染中不增高。因此，通过检测血清或体液中１，３—８一　Ｄ一葡聚糖的含量，可以更早、更灵敏、更直接反映深　部真菌感染的程度。该办法适用于除隐球菌和毛　霉菌外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念　珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种和菌属ｌ２　。　３．４半乳甘露聚糖检测（ＧＭ试验）　主国真菌学杂志２０１７年８月第１２卷第４期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍｙｃｏｌ，Ａｕｇｕｓｔ　２０１７，Ｖｏｌ　１２，Ｎｏ．４　ＧＭ是曲霉菌细胞壁的主要成分，被认为是曲　霉菌感染后最早释放人血的标志性抗原，其释放量　子振动信息。因其主要根据细胞中生物大分子的　化学组分进行分类，结果与传统的真菌分类系统有　一与菌量成正比，可以反映感染程度。ＧＭ实验是侵　袭性曲霉菌感染的早期诊断方法，有学者报道，外　定的差别。其与聚类分析方法相结合，使所有测　试在种水平上都得到正确归类，但在属、科等种以　上等级的分类结果跟传统的真菌分类系统有差异。　目前，傅里叶变换红外光谱技术已成功应用于细　菌、真菌、酵母菌、放线菌等微生物的识别［２　。　４　其　他　周血检测出ＧＭ的时间比临床症状早５～８　ｄ，比经　验性治疗平均时间早１２．５　ｄＥ船］。　３．５　流式细胞术（ＦＣＭ）检测　ＦＣＭ适合对真菌细胞逐个进行快速多参数的　精确测量，目前主要用于白念珠菌的检测。以标准　珠作为对照，可以测量真茵细胞的总ＤＮＡ含量、　细胞周期及增殖指数（ＰＩ），若细胞总ＤＮＡ含量相　等，说明是相同种属的菌株。同时，根据测出的细　胞周期及增殖指数可以判断真菌的生长情况。此　外，ＦＣＭ还是一种快速、准确的药敏试验方法。其　原理是抗真菌药物与真菌作用需要一定时间，通过　药物介导细胞损害，利用某些荧光染料不能进入活　菌细胞，只进入死细胞并同其内ＤＮＡ或ＲＮＡ结　合产生荧光的特点，使用ＦＣＭ检测死细胞和活细　胞的荧光值，借以区分死菌和活菌，并依据荧光强　度的变化趋势推断最小抑菌浓度（ＭＩＣ）Ｅ２４］。　３．６电镜技术　电镜技术包括扫描电镜、透射电镜、超高压电　镜、分析电镜等。其中，应用最多的是扫描电镜。　扫描电镜对观察研究真菌表面超微形态是一种重　要的手段。在ＳＥＭ下可清晰地分辨出真菌的菌丝　和大、小分生孢子，为真菌的病原学分类和抗真菌　药物筛选等方面提供形态学依据　。　３．７　活体共聚焦显微镜（ＩＶＣＭ）　ＩＶＣＭ是一种活体生物检查技术，通过对角膜　组织进行三维空间的扫描，动态观察角膜组织细胞　形态，具有高分辨率、高图像对比度的特点，且重复　性好［２　。ＩＶＣＭ对感染性角膜炎中棘阿米巴性角　膜炎及丝状真菌性角膜炎的诊断具有重要应用价　值。２０１１年Ｖａｄｄａｖａｌｌｉ对１０３例微生物检查确诊　的阿米巴角膜炎或真菌性角膜炎使用ＩＶＣＭ检　查，发现敏感性为８８．３　，特异性为９１．１　，与金标　准诊断结果的一致性非常好［２　，但很难对真菌的　菌属及类型进行鉴定。　．　３．８　傅里叶变换衰减全反射红外光谱法（ＦＴＩＲ—　ＡＴＲ）　傅里叶变换红外光谱分辨率高，可以反映微生　物细胞壁、细胞膜、细胞质甚至细胞核中的蛋白质、　多糖、脂质、核酸及其大分子、水分等混合成分的分　此外，真菌药敏试验、组织病理、微生物自动鉴　定系统、隐球菌荚膜抗原检测、循环抗原检测、循环　抗体检测、外抗原实验、皮肤实验等方法也可用于　真菌感染的检测和鉴定。　５　结　语　目前，对于皮肤及甲的真菌感染，最常用的还　是真菌镜检和培养，荧光染色因其操作简单、快速、　灵敏度高的优点也开始广泛应用于临床。对于深　部及皮下组织真菌感染，组织病理是诊断的金标　准。Ｇ试验、ＧＭ试验和隐球菌荚膜抗原检测是目　前临床常用的真菌血清学试验。分子生物学、流　式细胞术等先进的诊断试验由于种种原因，在我国　各级医院尚未能顺利展开。新兴的质谱技术及其　相关衍生和串联技术凭借其快速、操作简单、稳定　可靠等优点，相信在未来临床致病真菌鉴定中将具　有很大优势。随着科研人员的不断研究和科技的　不断进步，会有越来越多的技术应用于真菌的检　测，为临床诊断和治疗提供指导。　参考文献　［１］　冯佩英，席丽艳．加强对新现临床真菌感染的认识［Ｊ］．中华皮　肤科杂志，２０１６，４９（７）：４５卜４５５．　［２］　阳眉，兰长贵，梅晓锋．３种真菌直接镜检溶液诊断甲真菌病　的比较研究［Ｊ］．检验医学与临床，２０１３，１０（３）：２７５—２７６．　ｒ３］　Ｗｉｌｓｍａｎｎ　Ｔｈｅｉｓ　Ｄ，Ｓａｒｅｉｋａ　Ｆ，Ｂｉｅｂｅｒ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｗ　ｒｅａｓｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｉｓｔ０ｐａｔｈｏ１ｏｇｉｃａｌ　ｎａｉｌ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏ—　ｓｉｓ　ｏｆ　ｏｎｙｃｈｏｍｙｃｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｕｒ　Ａｃａｄ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　Ｖｅｎｅｒｅｏｌ，　２Ｏ１１，２５（２）：２３５－２３７．　［４］　韩德忘，刘原志，朱均吴，等．荧光染色法与ＫＯＨ湿片法在真　菌直接镜检中的应用比较ＥＪ］．中国真菌学杂志，２Ｏ１６，１１　（４）：２４０　２４２．　［５］　陈锐君，佟韬，李超，等．荧光染色法和ＫＯＨ湿片法在诊断浅　部真菌感染中的效果比较［Ｊ］．中国真菌学杂志，２０１６，１１　（６）：３７８—３８０．　［６］　董兴军．Ｋ０Ｈ和乳酸酚棉蓝染色法在浅部真菌病直接镜检　中的应用比较［Ｊ］．中国真菌学杂志，２０１４，９（３）：１７０—１７１．　ＥＴ］　曾秋林，陈灵敏，闵志刚．ＰＡＳ染色显示真菌在临床上的应用　・　２５６　・　中国真菌学杂志２０１７年８月第ｌ２卷第４期　Ｊ　！　．垒　！　！！　！！　！　：！　［Ｊ］．检验医学与临床，２ｏ１ｏ，７（２１）：２４２５．　ＰＡＳ联合ｃｒｏｃｏｔｔ六胺银染色在真　［８］　邱小文，黄建平，杨映红．菌显示中的应用［Ｊ］．福建医药杂志，２０１２，３４（４）：９７—９８．　［９］　Ｔａｍｂｏｓｉｓ　Ｅ。Ｌｉｍ　Ｃ．Ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｓｔａｉｎｓ，ｃｈｉ—　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）ｒｅｇｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＤＮ　Ａ　ｂａｒｃｏｄｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，　２０１２，１０９（１６）：６２４１　６２４６．　［１８］张霄霄，汪定成，张惠中．质谱在临床病原真菌检测及鉴定中　的研究进展［Ｊ］．临床检验杂志，２ｏ１５，３３（４）：２９４—２９６．　［１９］　Ｒａｎｑｕｅ　Ｓ，Ｎｏｒｍａｎｄ　ＡＣ，Ｃａｓｓａｇｎｅ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．ＭＡＩ　ＤＩ—ＴＯＦ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒｔｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｉ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｇｏ　ｂｌｕｅ，Ｃｂｌｏｒａｚｏｌｅ　ｂｌａｃｋ，ａｎｄ　Ｐａｒｋｅｒ　ｉｎｋ　ｒｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｉ—　ａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｓｋｉｎ　ａｎｄ　ｎａｉｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２０１２，　５１（８）：９３５－９３８．　　［１Ｏ］　朱红梅，徐红，温海．医学真菌常用培养基的制备和应用［Ｊ］．中国真菌学杂志，２０１０，５（５）：２９６—３０６．　ａｎｉｕｋ　Ｅ，Ｂａｒａｎｉａｋ　Ａ，Ｆｏｒｔｕｎａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ　ｏｆ　［１１］　ＳｔｅｆＣＨＲＯＭａｇａｒ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｄｉｕｍ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ—ＡＰＩ　ＩＤ３２Ｃ　ａｎｄ　ＶＩＴＥＫ　２　ｃｏｍｐａｃｔ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ　ＭＳ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｅｓ，２０ｌ４，５７（３）：１３５—１４０．　［２ｏ］张博筠，叶乃芳，王中新．ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ　ＭＳ鉴定酵母菌应用　评价ＥＪ］．安徽医科大学学报，２０１　７，５２（４）：５０１－５０４．　［２１］　叶丽艳，郭玲，马艳宁，等．基质辅助激光解析电离飞行时间　质谱技术在快速鉴定真菌中的ｌ临床应用研究［Ｊ］．中华医院　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｐｐ．ｉｄｅｎｔＩｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｏｌ　Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　感染学杂志，２０１５，２５（１５）：３３６１－３３６３．　２０１６，６５（１）：１１１—１１４．　［２２］匡红，周琳瑶，刘书荣，等．Ｇ实验与真菌培养在临床深部真　［１２］　Ｌｏｔｔ　ＴＪ，Ｆｒａｄｅ　ＪＰ，Ｌｏｃｋｈａｒｔ　ＳＲ　Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔｙｐｅ　ａ—　菌感染辅助诊断的价值［Ｊ］．检验医学与临床，２ｏ１４，１ｌ（２３）：　ｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｂｏｔｈ　ｃｌｏｎａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｏｐｕｌａ—　３３０８　３３０９．　ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ　ｂｌｏｏｄ　ｓｔｒｅａｍ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｕ．Ｓ．　［２３１焦二莉，李跃宇，马文慧．侵袭性真菌感染的３种免疫学检测　ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｅｕｋａｒｙｏｔ　Ｃｅｌｌ，２０１０，９（４）：６１９－６２５．　方法的应用研究［Ｊ］．卫生检验，２Ｏ１６，１３（２０）：１ｉ７－－Ｉ１９．　［１３］　Ｂｒｉｌｌｏｗｓｋａ—Ｄａｂｒｏｗｓｋａ　Ａ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ　Ｏ，Ｊｅｎｓｅｎ　ＩＭ，ｅｔ　ａ１．　［２４］祁瑛，张秀丽．流式细胞术在抑菌试验中的应用发展ｒＪ］．内　Ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｉｎ—　蒙古医学杂志，２０１２，４４（５）：５８３　５８５．　ｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ　ｃ０ｌ０ｎｉｚａｔｉｏｎｒＪ］．Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，　［２５］崔芳，胡丹丹，黄攀登，等．趾甲镰刀菌病真菌的扫描电镜观　２Ｏ１０，４２（２）：１Ｏ９—１１３．　察和特殊制样方法［Ｊ］．电子显微学报，２０１３，３２（６）：４９６　５００．　［１４］　Ｌ６ｖｅｓｑｕｅ　Ｓ，Ｍｉｃｈａｕｄ　Ｓ，Ａｒｂｅｉｔ　ＲＤ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈ—ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　［２　６］　Ｋｕｒｂａｎｙａｎ　Ｋ，Ｈｏｅｓｌ　ＬＭ，Ｓｃｈｒｅｍｓ　ＷＡ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｒｎｅａｌ　ｎｅｒｖｅ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｐｅｒｆｏｒｍ　ｍｕｈｉｌｏｃｕｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　Ａｅａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ａｎｄ　ｆｕｎｇａｌ　ｋｅｒａｔｉｔｉｓ：ａｎ　ｉｎ　ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉＥＪ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１１，６（１）：ｅ１６１６７．　ｖｉｖｏ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ），２０１　２，２６（１）：　［１５］　Ｍｉｒｈｅｎｄｉ　Ｈ，Ｂｒｕｕｎ　Ｂ，Ｓｃｈｏｎｈｅｙｄｅｒ　ＨＣ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　１２６　１３２．　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ，Ｃ．ｎｉｖａｒｉｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃ．ｂｒａｃａｒｅｎｓｉｓ　ｂａｓｅｄ　ｒ２７］Ｖａｄｄａｖａｌｌｉ　ＰＫ，Ｇａｒｇ　Ｐ，Ｓｈａｒｍａ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉ—　ｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆ　ＩＴＳ１　ａｎｄ　ＩＴＳ２　ａｎｄ　ｒｅ—　ｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ａｎｄ　ａｃａｎｔｈａＩｎｏｅｂａ　ｋｅｒａｔｉ　ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆ　ＩＴＳ　ａｎｄ　Ｄ１／Ｄ２　ｔｉｓ［Ｊ］．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，２０１１，１１８（１）：２９　３５．　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｒＤＮＡ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２０１１，３Ｏ　［２８１　Ｏｂｅｒｌｅ　Ｊ，Ｄｉｇｈｔｏｎ　Ｊ，Ａｒｂｕｃｋｌｅ　Ｋｅｉｌ　Ｇ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈ　（１１）：１４Ｏ９－１４１６．　ｏｄｏｌｏｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｆｏｕｒｉｅｒ　［１６］　Ｍａｋｉｎｏ　Ｈ，Ｆ　ｕｊｉｍｏｔｏ　Ｊ，Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｋ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｉｎｆｒａｒｅｄ（ＦＴＩＲ）ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ａｎｄ　Ｆｏｕｒｉｅｒ　ｔｒａｎｓ—　ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅｎｔ—ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｏｒｍ　ｉｎｆｒａｒｅｄ—ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｔｏｔａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ（ＦＴＩＲ　ＡＴＲ）ｍｉ—　ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔｓ　ｏｆ　ｐｕｂｌｉｃ　ｈｅａｌｔｈ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ　ｉｎ　ｄａｉｒｙ　ｐｒｏｄ—　ｃｒｏｓｐｅｃｔｒ０ｓｃ０ｐｙ［Ｊ］．Ｆｕｎｇａｌ　Ｂｉｏｌ，２０１５，ｌ１９（１１）：ｌ１００一ｌ１１４．　ｕｃｔｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，１４０（１）：７６～８３．　［收稿日期］２ｏｌ７　０２　１２　［１７］　Ｓｃｈｏｃｈ　ＣＬ，Ｓｅｉｆｅｒｔ　ＫＡ，Ｈｕｈｎｄｏｒｆ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　［本文编辑］王飞　（上接第２４７页）　［５５］　Ａｌｖａｒｅｚ　Ｍ，Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ　Ａ．Ｐｈａｇｏｓｏｍｅ　ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　［４９］　Ｍａｎｔｏｖａｎｉ　Ａ，Ｂｉｓｗａｓ　ＳＫ，Ｇａｌｄｉｅｒｏ　ＭＲ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ａｆｔｅｒ　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｅｏｆｏｒｍ．ｎｓ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｒｅｐａｉｒ　ａｎｄ　ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ　２００６，ｌ６（２１）：２ｌ６１　２１６５．　［Ｊ］．Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１３，２２９（２）：１７６—１８５．　［５６］　Ｍａ　Ｈ，Ｃｒｏｕｄａｃｅ　ＪＥ，Ｌａｍｍａｓ　ＤＡ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｕｌｓｉｏｎ　ｏｆ　１ｉｖｅ　［５Ｏ］Ｌｅｖｉｔｚ　ＳＭ，Ｎｏｎｇ　ＳＨ，Ｓｅｅｔｏｏ　ＫＦ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒ—　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｙｅａｓｔ　ｂｙ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ，２００６，１６　ｍａｒｔｓ　ｒｅｓｉｄｅｓ　ｉｎ　ａｎ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍａｃｒｏ　（２１）：２１５６　２１６Ｏ．　ｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，１９９９，６７（２）：８８５　８９０．　［ｓ７］　Ａｌｖａｒｅｚ　Ｍ，Ｓａｙｌｏｒ　Ｃ，Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ　Ａ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　［５ｉ］Ｓｈｏｈａｍ　Ｓ，Ｌｅｖｉｔｚ　ＳＭ．Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｆｕｎｇａｌ　ｉｎｆｅｃ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ　ａｎｄ　Ｃｒｙｐ　ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００５，１２９（５）：５６９　５８２．　ｔｏＣＯＣＣＵ￥ｇａｔｔｉｉ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｂｉｏｆｉｌｍ—‘ｌｉｋｅ　ｍｉ——　Ｅ５２］Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ　ＦＳ，Ｐｕｒｉｃｈ　ＤＩ　．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｌｉｓｔｅ—　ｃｒｏｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００８，１０（８）：ｌ６２２　ｒｉｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，１９９６，３３４（１２）：７７０—７７６．　１６３３．　［５３］Ｚａｒａｇｏｚａ　Ｏ，Ｃｈｒｉｓｍａｎ　ＣＪ，Ｃａｓｔｅｌｌｉ　ＭＶ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｐｓｕｌｅ　ｅｎｌａｒｇｅ　［５８］　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　ＰＲ，Ｊａｒｖｉｓ　ＪＮ，Ｐａｎａｃｋａｌ　ＡＡ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａ】　ｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａ．ｓ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｏｘｉ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａ—　ｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ　ａ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｆｏｒ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｕｒ　ｐｙ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｎｅｕｒｏｌ，２０１７，１３（１）：１３—２４．　ｖｉｖａｌ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００８，１０（１０）：２０４３—２０５７．　［５９］　Ｗａｌｋｅｒ　ＪＡ，ＭｃＫｅｎｚｉｅ　ＡＮ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　［５４］Ｆｅｌｄｍｅｓｓｅｒ　Ｍ，Ｍｅｄｎｉｃｋ　Ａ，Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ　Ａ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　２　ｉｎｎａｔｅ　Ｉｙｍｐｈｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ（）ｐｉｎ　ｌｍｍｕｎｏｌ，２０ｌ３，　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｓ　２５（２）：１４８—１５５．　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｌｅｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ａｎｄ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　［收稿日期］２０１　７一Ｏ３　２２　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，２００２，７０（３）：１５７卜１５８０．　［本文编辑］施慧