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磁珠法提取组织DNA

来源:个人技术集锦


注意事项:1、任何组织在获得后如不立即使用,要尽快保存在低温环境中(一196℃液氮中速冻,一70℃保存)。组织的取量要比实际需要量大1一2倍,因为研磨时部分组织会粘在研钵和研棒上,会致部分组织样本丢失。

2、液氮研磨操作中所有接触的器皿及耗材须清洗干净并消毒。

材料:磁力架、试剂盒(Buffer MACL、Buffer MCL、Proteinase K、 Magicmag Beads、Buffer MA、TE Buffer)、液氮罐、保温桶、不锈钢或塑料汤勺(汤勺的柄不够长时要想办法加长,以免冻伤手)、干毛巾或纱布、泡沫板、研钵研棒、小药勺、200微升移液器,200微升枪头、

1、 组织匀浆制备:空钵先用液氮预冷,再将研棒的上端用纱布包裹(用力时手不会痛),研棒最好顶着手心,这样便于用力。研磨过程中要避免液氮干涸,研磨至细粉即可。待液氮刚蒸发完时,用一个小药勺取25mg于1.5ml EP管中。

附:液氮研磨原理

液氮的温度为一196℃,它既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。正是由于液氮的温度极低,操作时要特别小心。液氮研磨,一是为了终止细胞内外一切生物反应,比如提取RNA时,防止RNA酶的降解反应等;还有一个原因,就是在液氮中的细胞完全冻硬了,研磨可以达到很好的破胞效果,将细胞磨成粉,使里边的物质释放出来。

2、细胞裂解:加入400微升Buffer MACL、200微升Buffer MCL,20微升Proteinase K,震荡混匀,65℃水浴20-30min。

3、结合:取出EP管,12,000 rpm离心5-10min,小心吸取500微升上清至新的EP管中,再加入500微升Buffer MA,吸打或者点阵混匀,用移液器吸取15微升Magicmag Beads 加至液面一下尽量将枪头上残留的Magicmag Beads 吸打干净。

4、洗涤:将离心管置于磁力架30s,待Magicmag beads 完全吸收至管壁之后(若管口粘有少量磁珠,请用上清液将其洗至离心管内),吸弃上清,从磁力架上取出离心管。

向离心管中加入700微升 70%乙醇,吸打或者点阵混匀,将离心管置于磁力架上30 秒,待Magicmag Beads 完全至管壁之后,吸弃上清(尽量吸干净),从磁力架上取出离心管。重复本步骤一次,室温开盖干燥15-20min或者55℃恒温箱内开盖干燥5-7min至关内无液体残留。

5、洗脱:向离心管加入100微升TE Buffer(PH8.0),65℃水浴5-10min,间或混匀。

取出离心管并置于磁力架上30s,待magicmag beads完全吸至管壁上之后,小心吸取上清至新的离心管,即获得基因组DNA.

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