第３４卷第２期 海 洋 学 报 Ｖ０ｌ＿３４。Ｎｏ．２ ２０１２年３月 ＡＣＴＡ ０ＣＥＡＮＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ Ｍａｒｃｈ ２０１２ 应用新一代测序技术测定大室别藻苔虫 线粒体基因组全序列 申欣 ，田美 ，朱长保 ，刘会莲。，赵方庆 （１．淮海工学院海洋学院，江苏连云港２２２００５；２．中国科学院北京生命科学研究院，北京１００１０１；３．中国科学 院海洋研究所，山东青岛２６６０７１） 摘要：线粒体基因组的获得传统上通常是采取长ＰＣＲ结合鸟枪法或步移法测序。近年来新一代测序 技术蓬勃发展，以４５４，Ｓｏｌｅｘａ和ＳＯＬＩＤ测序平台为代表。应用新一代高通量测序技术（Ｓｏｌｅｘａ）并结 合巢式ＰＣＲ扩增，完成了大室别藻苔虫（Ｍｅｍｂｒａｎｉｐｏｒａ ｇｒａｎｄｉｃｅｌｌａ）的线粒体基因组全序列。大室别 藻苔虫线粒体基因组是目前国际上获得的第一条苔藓动物软壁亚目线粒体基因组全序列，基因组全 长为１５ ８６１ ｂｐ，比已完成的４种苔藓动物线粒体基因组略大。大室别藻苔虫线粒体基因组包含１３个 蛋白质编码基因、２个核糖体ＲＮＡ基因和２Ｏ个转运ＲＮＡ基因。通过与已测得的苔藓动物进行比 较，发现目前已完成的５个苔藓动物线粒体基因组的基因排列顺序显著不同。苔藓动物线粒体基因 组基因排列的比较，今后可能会成为探讨该类群系统演化关系的重要信息来源。 关键词：大室别藻苔虫；线粒体基因组；新一代测序技术；巢式ＰＣＲ；基因排列 中图分类号：Ｑ９１５．８１５ 文献标忘码：Ａ 文章编号：０２５３－４１９３（２０１２）０２—０１３６—０７ １ 引言 诞生于２Ｏ世纪７０年代的Ｓａｎｇｅｒ法是最早被 广泛使用的ＤＮＡ测序技术，也是完成人类基因组 群体遗传分化的理想材料Ｌ２ Ｊ。线粒体基因组的获 得传统上通常是采取长ＰＣＲ结合鸟枪法或步移法 测序。虽然ＰＣＲ方法操作简单，对样品需求量少， 但是花费时间较长、工作量较大等问题，并且利用长 ＰＣＲ扩增有时成功率不高，难以获得目的片段ｌ５］。 苔藓动物（ｂｒｙｏｚｏａｎｓ）作为重要的海洋无脊椎 计划的基础，但是由于它测序通量低、费时费力，科 学家们一直在努力寻求通量更高、速度更快、价格更 便宜的测序技术。自２００５年以来，以Ｒｏｃｈｅ公司 的４５４技术、Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司的Ｓｏｌｅｘａ技术和ＡＢＩ公 动物门类，现存６０００余种。目前国际上对苔藓动物 线粒体基因组的研究还比较少，仅完成４个苔藓动 物物种的线粒体全基因组，包括多室草苔虫Ｂｕｇｕｌａ ｎｅｒｉｔｉｎａ、栉口目苔虫Ｆｌｕｓｔｒｅｌｌｉｄｒａ ｈｉｓｐｉｄａ、颈链血 苔虫Ｗａｔｅｒｓｉｐｏｒａ ｓｕｂｔｏｒｑｕａｔａ和扇形管孔苔虫Ｔ“一 ｂｕｌｉｐｏｒａ ｆｌａｂｅｌｌａｒｉｓ¨６ ］。大室别藻苔虫Ｍｅｍｂｒａ ｎｉｐｏｒａ ｇｒａｎｄｉｃｅｌｌａ属于裸唇纲Ｇｙｍｎｏｌａｅｍａｔａ，唇 司的ＳＯＬＩＤ技术为代表的新一代测序技术相继诞 生。新一代测序技术又称高通量测序技术，主要特 点是测序通量高，测序时间和成本显著降低口］。 与单个基因相比，线粒体基因组是一个完整的 体系，具有信息量丰富和系统发育树结构稳定等优 点。由于线粒体基因组具有众多优势，使其成为研 究后生动物关键类群的起源、进化、系统发育关系及 收稿日期：２０１１－０６—２６；修订日期：２０１卜Ｏ９—２６。 口目Ｃｈｅｉｌｏｓｔｏｍｉｄａ，软壁亚目Ｍａｌａｃｏｓｔｅｇｉｎａ、膜孔 苔虫超科Ｍｅｍｂｒａｎｉｐｏｒｏｉｄｅａ，膜孔苔虫科Ｍｅｍｂｒａ一 基金项目：国家自然科学基金（４０９０６０６７）；中国科学院基金（ＹＯ６４Ｏ２１ＢＪ１；０８６９０１ １ＢＪ５）；江苏省“青蓝工程”人才基金（苏教师［２０１０１２７号）。 作者简介：申欣（１９８１一），男，副教授，博士．研究方向为线粒体基因组学。Ｅ—ｍａｉｌ；ｓｈｅｎｔｈｉｎ＠１６３．ｃｏｒｎ ２期 申欣等：应用新一代测序技术测定大室别藻苔虫线粒体基因组全序列 ｎｉｐｏｒｉｄａｅ。本研究利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ 表１大室别藻苔虫线粒体基因组的特异引物 引物名称 （Ｓｏｌｅｘａ）新一代测序平台获得大室别藻苔虫线粒体 引物序列（５ 一３ ） 基因组的部分序列。根据获得的部分序列设计引 物，进行巢式ＰＣＲ和测序，最终获得大室别藻苔虫 的线粒体基因组全序列。本实验流程避开了长 ＰＣＲ扩增等技术的限制，为其他海洋动物线粒体基 因组的获得提供重要的参考价值。 ２材料和方法 ２．１ 样品 大室别藻苔虫采自于江苏连云港，样品清理后， 用９５ 乙醇固定备用。 ２．２基因组ＤＮＡ的提取 称取５０ ｍｇ大室别藻苔虫样品放入培养皿中， 用蒸馏水洗涤，浸泡过夜。研磨后置于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中，加入６００ Ｌ的裂解液（４０ ｍｍｏｌ／ｄｍ。Ｔｒｉｓ— ＨＣｌ，２０ ｍｍｏｌ／ｄｍ。醋酸钠、１ ｍｍｏｌ／ｄｍ。ＥＤＴＡ， １％ＳＤＳｌ ｐＨ一８．０）和５ Ｌ的蛋白酶Ｋ（２０ ｒａｇ／ ｔｉｎ。），充分混匀后，置于５５℃水浴锅中硝化４ ｈ。 ４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ去除钙质沉淀，小心将上清 液转入新的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。加入等体积的酚：氯 仿：异戊醇（２５：２４：１）抽提２次，等体积的氯仿： 异戊醇抽提１次。将上清液转入新的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管 中，加入２倍体积的无水乙醇，充分混匀后置于 ２Ｏ℃冰箱３０ ｒａｉｎ。１２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｍｉｎ沉 淀ＤＮＡ，７Ｏ 乙醇洗涤２次后置于室温下干燥。 ５０ Ｉ ＴＥ（含２０ ｍｇ／ｃｍ。ＲＮａｓｅ）溶解ＤＮＡ，用 ０．６％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量。 ２．３ Ｓｏｌｅｘａ高通量测序和序列拼接 Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ是一种基于单分子 簇的边合成边测序技术，它基于专有的可逆终止化 学反应原理，具体步骤包括文库制备、产生ＤＮＡ 簇、上机测序和数据分析。高纯度的大室别藻苔虫 ＤＮＡ经Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ测序平台获得 序列，使用Ａｂｙｓｓ软件口叼进行序列拼接。 ２．４组合ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ扩增 拼接后得到的ｃｏｎｔｉｇｓ在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进 行ＢＬＡＳＴ比对，从中得到线粒体基因组序列信息， 设计本物种线粒体基因组的特异引物（引物名称及 序列见表１），进行组合ＰＣＲ扩增（反应体系和反应 条件见表２，３）。ＰＣＲ产物通过１ 琼脂糖凝胶电 泳检测质量。 Ｍｇｒ－ｃｇｌ Ｆ１２２３１ ＴＴＣＧＡＧＣＡＧＴＡＧＣＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴ Ｍｇｒ－ｃｇｌ—Ｆ１２４１５ ＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＴＣ Ｍｇｒ－ｃｇｌ—Ｒ１ ３６ ＴＴＡＧＴＡＧＧＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＡ Ｍｇｒ－ｃｇｌ—Ｒ２６６ ＡＡＧＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ Ｍｇｒ－ｃｇ２一Ｆ２７０９ ＣＴＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ Ｍｇｒ—。ｃｇ２—。Ｆ２８３８ ＡＡＣＣＡＡＴＡＡＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＴＡＣＡＴ Ｍｇｒ—。ｃｇ２—’Ｒ１０１ ＧＴＴＧＡＴＣＡＴＡＴＣＧＴＡＧＧＣＧＡＧＧＧＴ Ｍｇｒ－ｃｇ２一Ｒ２５８ ＡＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＡＴＡＧＣＣＧＣＡＡＣＴＣ 表２组合ＰＣＲ的反应体系 组分 体积／ｕＬ ｄｄＨ２Ｏ １Ｏ×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ ｐｌｕｓ） ｄＮＴＰ（２．５ ｍｌＴｌＯ１・ｄｍ ｅａｃｈ） 引物１（１０ ｍｍｏｌ・ｄｍ ） 引物２（１０ ｍｍｏｌ・ｄｍ ） 模板 Ｔａｑ酶（５ Ｕ・ｍｍ ）０．２ １ 预变性 ２ 变性 ４５ Ｓ ３ 退火 ４５ ｓ ４ 延伸 ２ ｒａｉｎ 步骤２～４，３５次循环 ５ 再延伸 １０ ｒａｉｎ ６ 保存 由于组合ＰＣＲ的扩增效率低或者产生了非特 异扩增产物，而巢式ＰＣＲ则能消除非特异扩增产 物、增加扩增效率，所以以组合ＰＣＲ的反应产物为 模板来进行巢式ＰＣＲ扩增（巢式ＰＣＲ的反应体系 和反应条件见表４，５）。用１ 琼脂糖凝胶电泳检测 巢式ＰＣＲ产物质量，纯化后用ＡＢＩ ３７３０型测序 仪测序。 １３８ 表４巢式ＰＣＲ的反应体系 组分 ｄｄＨ２０ 海洋学报３４卷 ２．５序列拼接及基因注释 体积／ｕＬ １８．２１ ２．５ ２．０ １．０ １．０ ０．１ 用ＤＮＡＳＴＡＲ软件对测得的序列进行碱基识 别和序列拼接，从而获得线粒体基因组的全序列。 通过线粒体基因组的基因预测工具ＤＯＧＭＡＥ“ 对 蛋白质编码基因及２个ｒＲＮＡ基因进行预浸０。ｔＲ～ ＮＡ基因是通过ｔＲＮＡｓｃａｎ～ＳＥ １．２１ｌ＿１ 进行基因 预测。 １０×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ ｐｌｕｓ） ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ・ｄｍ一０ ｅａｃｈ） 引物１（１０ ｍｍｏｌ・ｄｍ ） 引物２（１０ ｍｍｏｌ・ｄｍ ） 模板 Ｔａｑ酶（５Ｕ－ｍｍ一。） ３结果与讨论 ３．１ Ｓｏｌｅｘａ测序和ＢＬＡＳＴ比对 Ｏ．２ 使用Ａｂｙｓｓｌ５ 软件对Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ 测序结果进行拼接所获得的ｃｏｎｔｉｇｓ，在ＧｅｎＢａｎｋ数 １ ２ 预变性 变性 ９４ ９４ ５６ ７２ ５ ｒａｉｎ ４５ Ｓ ４５ ｓ １ ｒａｉｎ 据库中与苔藓动物线粒体基因组进行ＢＩ ＡＳＴ相似 性比对，得到大室别藻苔虫线粒体基因组的部分序列 （２个ｃｏｎｔｉｇｓ，长度分别为１２ ５４０和２ ９８３ ｂｐ）。将其 ３ ４ 退火 延伸 在ＧｅｎＢａｎｋ上与已测得大室别藻苔虫线粒体ｌｒＲＮＡ 序列进行两两比对，发现与ｌｒＲＮＡ吻合（图１）。从图 １可以看出，其序列相似性达到９９．３３ ，因此Ｓｏｌｅｘａ 测序后获得的两个ｃｏｎｔｉｇｓ为大室别藻苔虫线粒体基 步骤２～４，３５次循环 ５ ６ 再延伸 ７２ １２ 保存 因组部分序列。 Ｓｃｏｒｅ＝ ５３６ ｂｉｔｓ《２９０）， Ｅｘｐｅｃｔ ｉｅ－１５５ Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ：２９５／２９７｛９９奄＇，Ｇａｐｓ＝２／２９７ ｃＩ％》 Ｓｔｒａｎｄ＝Ｐｌｕｓ／Ｐｌｕｓ Ｑｕｅｒｙ １１９２９ １１９８８ ５８ Ｓｂ］ｃｔ １ ｕｅｒｙ １１９８９ Ｑ王２Ｏ畦８ ｓｂｊｃ七 Ｓ９ ｕｅｒｙ １２０４９ Ｑ１１８ 王２１Ｏ８ Ｓｂｊｃｔ 王王９ ｕｅｒｙ １２１０９ Ｑ７ｇ Ｓｂ３ｃｔ 王－１７８ ａａａｇｃ乞ｔｃｃｔａａａ０ 趣最矗鑫孽乞乞々乞ｌ已乞Ｃ趣七譬鑫ｔａａａａａａｇ １２１６８ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｉ ｌ ｌ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｉ ２３８ 置２２２Ｓ ２９５ ｕｅｒｙ １２１６９ 矗ａａ嚣七。嚣七乞乞氇ａ撬藏ｇ趣ａｔｔａａａａａａ矗穗 Ｑｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｓｂ３ｃｔ ２３９ 图１ ＢＩ ＡＳＴ两两比对的结果 ３．２组合ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ扩增结果 由于在使用引物组合Ｍｇｒ—ｃｇｌ—Ｆ１２４１５／Ｍｇｒ ｃｇ２一Ｒ２５８进行ＰＣＲ扩增时出现了非特异性条带 （见图２），因此使用引物组合Ｍｇｒ—ｃｇｌ—Ｆ１２４１５／ 根据已获得的线粒体基因组部分序列设计特异 引物，引物名称和序列如表１所示。将这些引物随 机组合进行ＰＣＲ扩增，其中只有２种组合可以得到 目的条带（见图２，３）。 Ｍｇｒ—ｃｇ２一Ｒ１０１进行巢式ＰＣＲ，扩增得到特异性条 带（见图４）。 １４０ 海洋学报３４卷 （表６），这与已完成的４个苔藓动物线粒体基因组 存在差异 一。。。 共有３ ３５７个氨基酸。蛋白质编码基因总体的Ａ＋ Ｔ含量为６８．９ ，如果仅统计密码子的第三位，则 其Ａ＋丁含量上升至７７．６ 。 大室别藻苔虫线粒体基因组的蛋白质编码基因 表６大室别藻苔虫线粒体基因组的基因分布特征 ２期 申欣等：应用新一代测序技术测定大室别藻苔虫线粒体基因组全序列 １４１ ３．５核糖体ＲＮＡ与转运ＲＮＡ ３．６基因排列 大室别藻苔虫线粒体基因组的两个ｒＲＮＡ基 因都编码在ａ链上，ｌｒＲ 位于ｔＲＮＡ 与 ～ ＮＡ 之间，ｓｒＲＮＡ位于 ＮＡ 与ｔＲＮＡ 之问， ２个核糖体之间只间隔了１个ｔＲＮＡ基因（ｔＲ— 目前已经完成的苔藓动物线粒体基因组共有４ 条，即多室草苔虫（接收号：ＮＣ一０１０１９７；裸唇纲、唇 口目）、颈链血苔虫（接收号：ＮＣ～０１１８２０；裸唇纲、唇 口目）、栉口目苔虫Ｆ．ｈｉｓｐｉｄａ（接收号：ＮＣ一 ＮＡ ）。大室别藻苔虫ｌｒＲＮＡ基因的长度为 １ ２７３ ｂｐ，其ｓｒＲＮＡ基因的长度为８７１ ｂｐ。大室别 藻苔虫的线粒体基因组共编码２Ｏ个ｔＲＮＡ基因，总 ００８１９２；裸唇纲、栉口目）和扇形管孔苔虫（接收号： ＥＵ５６３９２７；狭唇纲、管孔目），而且基因排列顺序显 著不同，说明在苔藓动物线粒体基因组的内部经历 长度为１ ２７９ ｂｐ；与后生动物线粒体基因组的标准 了大规模的基因重排过程（图６）［６ ］。 组成相比，缺少 ＮＡ 和 ＮＡｒｙ 基因。 大室别藻苔虫 多室草苔虫 颈链血苔虫 栉口目苔虫 扇形管孔苔虫 图６苔藓动物线粒体基因组的基因排列 下划线标注的基因在８链上编码 ４结论 现象；对１３个蛋白质编码基因都使用了完全终止 密码子ＴＡＡ；与后生动物线粒体基因组的标准组 本论文基于Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｏｌ— 成相比，缺少ｔＲＮＡ胁和 ＮＡＤ 基因；具有独特的 ｅｘａ）新一代测序平台并结合巢式ＰＣＲ扩增方法， 基因排列顺序。 获得了大室别藻苔虫的线粒体基因组全序列。大 本文测定的大室别藻苔虫线粒体基因组及与目 室别藻苔虫线粒体基因组是目前国际上获得的第 前已完成的４个苔藓动物的线粒体基因组相比，大 一条软壁亚目的线粒体基因组全序列。通过对其 室别藻苔虫具有独特的基因排列顺序；５个苔藓动 基本结构特征的分析，发现了与其他苔藓动物线 物线粒体基因组的基因排列顺序显著不同，说明在 粒体基因组相比，大室别藻苔虫线粒体基因组具 苔藓动物线粒体基因组的内部经历了大规模的基因 有一些显著的特点：大室别藻苔虫线粒体基因组 重排过程。苔藓动物线粒体基因组基因排列的比 的长度为１５ ８６１ ｂｐ，与其他苔藓动物相比较大；控 较，今后可能会成为探讨该类群系统演化关系的重 制区也较大，长度为１ ０５７ ｂｐ；没有出现基因重叠 要信息来源。 参考文献： ［１］王曦，ｔ￣Ｊｌ，我，王立坤，等．新一代高通量测序数据的处理与分析［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２０１０，３７（８）：８３４－－８４６ １４２ 海洋学报３４卷 ［２２ ＨＥＬＦＥＮＢＥＩＮ Ｋ Ｇ，ＦＯＵＲＣＡＤＥ Ｈ Ｍ，ＶＡＮＪＡＮＩ Ｒ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｐａｒａｓｐａｄｅｌｌａ ｇｏｔｏｉ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｃｈａｅｔｏｇｎａｔｈｓ ａｒｅ ａ ｓｉｓｔｅｒ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ｐｒｏｔｏｓｔｏｍｅｓ［Ｊ］，Ｐｒｏｅ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００４，１０１（２９）：１０６３９－－１０６４３． ［３］ＤＥＬＬＡＰＯＲＴＡ Ｓ Ｌ，ＸＵ Ａ，ＳＡＧＡＳＳＥＲ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｐｌａｘ ａｄｈａｅｒｅｎｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｐｌａｃｏｚｏａ ａｓｔｈｅ ｂａｓａｌ ｌｏｗｅｒ ｍｅｔａｚｏａｎ ｐｈｙｌｕｍ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ ＵＳＡ，２００６，１０３（２３）：８７５１—８７５６． ［４］ ＳＨＥＮ Ｘ，ＭＡ ＸＹ，ＲＥＮ ＪＦ，ｅｔ ａ１． Ａ ＣｌＯＳｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｉｐｕｎｃｕｌａ ａｎｄ Ａｎｎｅｌｉｄａ ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏ— ｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｈａｓｃｏｌｏｓｏｍａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００９（１０）：１３６—１４６． ［５］ 申欣，吴志刚．单环刺蜢线粒体基因组全序列的获得——长ＰＣＲ结合鸟枪法测序ｒ－Ｊ］．海洋科学，２０１０，３４（１２）：２６—２９． ｒ６］ＷＡＥＳＣＨＥＮＢＡＣＨ Ａ Ｍ，ＴＥＬＦＯＲＤ Ｊ，ＰＯＲＴＥＲ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｆｌｕｓｔｒｅｌｌｉｄｒａ ｈｉｓｐｉｄａ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｙ ｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｙｏｚｏａ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｔａｚｏａ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ，２００６，４０（１）：１９５ ２０７． ［７］ＪＡＮＧ ＫＨ，ＨＷＡＮＧ Ｕ Ｗ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｂｕｇｕｌａ ｎｅｒｉｔｉｎａ（Ｂｒｙｏｚｏａ，Ｇｙｍｎｏｌａｅｍａｔａ，Ｃｈｅｉｌｏｓｔｏｍａｔａ）：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｙｏｚｏａ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｌｏｐｈｏｐｈｏｒａｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｌｏｐｈｏｔｒ。ｃｈｏｚ０ａ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００９，１０：１６７． ｒ８］ＳＵＮ ＭＡ，ＷＵ ＺＧ，ＳＨＥＮ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｗａｔｅｒｓｉｐｏｒａ ｓｕｂｔｏｒｑｕａｔａ（Ｂｒｙｏｚｏａ，Ｇｙｍｎｏｌａｅｍａｔａ，Ｃｈｅｉｌｏｓ— ｔｏｍｉｄａ）ｗｉｔｈ ｐｏｙｌｏｇｅｎｔｉｃ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｙｏｚｏａ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００９，４３９（１－２）：１７ ２４． ［９］ＳＵＮ ＭＡ，ＳＨＥＮ Ｘ，ＬＩＵ ＨＬ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｔｕｂｕｌｉｐｏｒａ ｆｌａｂｅｌｌａｒｉｓ（Ｂｒｙｏｚｏａ：Ｓｔｅｎｏｌａｅｍａｔａ）：ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐ ｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｌａｓｓ Ｓｔｅｎｏｌａｅｍａｔａ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｇｅｎｅ ｏｒｄｅｒ［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍａｒｇｅｎ．２０１１．０３．００６． ［１ｏ］ＳＩＭＰＳＯＮ Ｊ Ｔ，ＷＯＮＧ Ｋ，ＪＡＣＫＭＡＮ Ｓ Ｄ，ｅｔ ａ１．ＡＢＹＳＳ：ａ ｐａｒａｌｌｅｌ ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００９，１９ （６）：１１１７—１１２３． ｒ１１］ＷＹＭＡＮ Ｓ Ｋ，ＪＡＮＳＥＮ Ｒ Ｋ，ＢＯＯＲＥ Ｊ Ｌ．Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｅｌｌａｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ＤＯＧＭＡ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，２０ （１７）：３２５２—３２５５． ［１２］ＬＯＷＥ Ｔ Ｍ，ＥＤＤＹ Ｓ Ｒ．ｔＲＮＡｓｃａｎ－－ＳＥ：ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５（５）：９５５—９６４． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｉｐｏｒａ ｇｒａｎｄｉｃｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＳＨＥＮ Ｘｉｎ ．ＴＩＡＮ Ｍｅｉ ，ＺＨＵ Ｃｈａｎｇｂａｏ ，ＬＩＵ Ｈｕｉｌｉａｎ。，ＺＨＡＯ Ｆａｎｇｑｉｎｇ。 （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ。Ｈｕａｉｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏＪ ＬｉＪ’ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏＪ Ｏｃｅａｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏＪ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０７１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｕａｌｌｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｈｏｔｇｕｎ ｏｒ ｐｒｉｍｅｒｓ— ｗａｌｋｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｆａｓｔｌｙ ｉｎ ｒｅ— ｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ４ ５ ４，Ｓｏｌｅｘａ ａｎｄ ＳＯＬＩＤ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｅｍｂｒａｎｉｐｏｒａ ｇｒａｎｄｉｃｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏ— ｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｓｏｌｅｘａ）ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｍ．ｇｒａｎｄｉｃｅｌｌａ ｉｓ １ ５，８ ６ １ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｍａｌａｃｏｓｔｅｇｉｎａ（Ｂｒｙｏｚｏａ），ａｎｄ ｉｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌａｒｇｅｒ ｗｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｔＤＮＡｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｂｒｙｏｚｏａｎｓ．Ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ １ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ，ｔｗｏ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡｓ ａｎｄ ２ ０ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｂｒｙｏｚｏａｎｓ，ｇｅｎｅ ａｒｒａｎｇｅ— ｍｅｎｔｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｂｒｙｏｚｏａｎｓ ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｒｙｏｚｏａｎｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎ— ｄｒｉａｌ ｇｅｎｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｃａｎ ｂｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈ— ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｅｍｂｒａｎｉｐｏｒａ ｇｒａｎｄｉｃｅｌｌａ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ；ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ； ｇｅｎｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ