分析测试 高效液相色谱法检测小麦粉中的偶氮甲酰胺方法的研究 弓耀忠巩强 张烨 李静杨宝 阁霞 （山西省食品质量监督检验中心太原０３００１ ２） 摘要小麦粉中偶氮甲酰胺（ａｚｏｄｉｃａｒｄｏｎａｍｉｄｅ，ＡＤＡ）用丙酮提取，提取液氮吹浓 缩后用５％二甲基亚砜的水溶液定容，并用正己烷脱脂。样品供高效液相色谱仪测定， 外标法定量。方法线性范围是Ｏ－ｌＯＯｍｇ／Ｌ（ｄ＝ｏ．９９７９），定量下限为４ｍｇ／ｋｇ。在小麦粉 基质粉中分别添加１０．０ｍｇ／ｋｇ、５０．０ｍｇ／ｋｇ两个水平的偶氮甲酰胺标准品，方法的回收率 为８４％～９０％，相对标准偏差小于５％。 关键词 小麦粉偶氮甲酰胺 高效液相色谱（ＨＰＬＣ） 偶氮甲酰胺（Ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｎａｍｉｄｅ）简称ＡＤＡ， 分子式为Ｃ Ｈ４Ｏ Ｎ４，分子量为１１６，是一种黄至橘 红色结晶性粉末，无臭。熔点约１８０℃（分解），相 公司）；漩涡振荡器（ＷＨ一２型，江苏城西晓阳电 子仪器厂）；吹氮浓缩仪（ＭＴＮ一２８００型，天津奥 特赛思仪器有限公司）。 水为去离子水；二甲基亚砜为色谱纯；丙酮、 对密度Ｉ．６５，在高温下分解为氮、二氧化碳和氨。 几乎不溶于水和大多数有机溶剂，易溶于二甲基亚 砜和Ｎ，Ｎ．二甲基甲酰胺 Ｊ。主要用于小麦粉处理 剂及焙烤食品快速发酵剂，偶氮甲酰胺具有在低用 量下实现安全快速氧化的效能，从而改善面团的物 理操作性质和高筋力面团所需的组织结构，偶氮甲 酰胺本身与面粉不起作用，或者说作用较小，但当 它于面粉加水搅拌成面团时，很快释放出活性氧， 正己烷为分析纯；滤膜（０．４５￣ｔｍ）；偶氮甲酰胺标 准品（纯度大于９９．０％）。 １．２标准溶液配制 准确称量适量标准物质，用二甲基亚砜溶解并 定容，配制成１０００ｍｇ／Ｌ标准溶液，一５℃保存，２周 内使用。根据需要用５％二甲基亚砜水溶液配制标 准工作溶液。 １．３样品处理方法 将小麦蛋白质内氨基酸之硫氢根氧化成为二硫键， 使蛋白质链相互连结而构成面团网状结构，从而改 善面团之物理操作性质及面制品组织结构口】。 近年来，有研究表明偶氮甲酰胺在面粉中可能 产生氨基脲（ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ，ＳＥＭ） 。ＳＥＭ通常 作为呋喃西林（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｚｏｎｅ）的代谢物在兽药残 留中检出。硝基呋喃类药物具有致突变和致癌作用； 同时ＧＢ２７６０—２００７（（食品添加剂使用卫生标准 规 称取小麦粉１ｇ（精确到０．０１ｇ）于５０ｍＬ塑 料离心管中，加人ｌＯｍＬ丙酮，室温下超声提取 １５ｍｉｎ，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。取上清液５ｍＬ在 ４０￣Ｃ氮吹近干，用５％二甲基亚砜的水溶液定容至 ｌｍＬ，再加人ｌｍＬ正己烷，漩涡振荡。静置分层， 取下层水溶液过０．４５ ＩＴＩ滤膜，立即进行液相分析。 １．４液相色谱条件 色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＤＢ—ＣＮ，２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ（ｉ． 定ＡＤＡ的最高允许用量为４５ｍｇ／ｋｇ，但目前还未 见有关于面粉中ＡＤＡ快速检测方法的报道，也无 ｄ），５ ｕ １１＂１；柱温：２５℃；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；等度洗 脱；流动相：５％二甲基亚砜水溶液；检测波长： ２４５ｎｍ；进样量：１Ｏ Ｌ。 １．５测定 相关的检测标准。因此，面粉中偶氮甲酰胺的快速 检测方法的开发显得尤为重要。高效液相色谱分析 方法前处理简单，灵敏度高，在小麦粉的检测中有 很广泛的应用。 取不同浓度的标样１０ Ｌ进液相色谱，测定 不同浓度的峰面积，然后以横坐标为浓度，纵坐标 为峰面积绘制标准曲线。同时进试样溶液，根据试 样的峰面积与标准曲线比较定量。 １实验部分 １。１仪器与试剂 日本岛津ＬＣ一２０ＡＤ型高效液相色谱仪，配 自动进样器和二极管阵列检测器；超声清洗器 ２结果与讨论 ２．１液相色谱柱的选择 偶氮甲酰胺在Ｃ。。色谱柱上几乎无保留，尝试 ６５ （ＫＱ５２００ ＤＥ型，昆山市超声仪器有限公司）；离 心机（ＥＬＩＴＩＳＴ ２ １Ｋ－Ｒ型，长沙鑫奥仪器仪表有限 现代仪嚣（ｗｗｗ．ｍｏｄｅｒｎｉｎｓｔｒｓ．ｏｒｇ．ｃｎ） 在流动相加入庚烷磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠等离 子对试剂，都无法推迟其出峰时间。因此本实验采 用对极性物质有一定保留的氰基柱作为分析柱，，其 保留时间为３．５～４．５ｍｉｎ，满足分析需要。 聪旧彗 Ｏ ７ ０ Ｏ Ｏ 题均有改善（见图３～５）。 ０ ６ Ｏ Ｏ ０ ０ ０ ５ Ｏ ０ Ｏ ０ ４ ０ ０ Ｏ ０ ３ Ｏ ０ Ｏ Ｏ ０ ｌ ２ Ｏ ０ ０ ０ ０ ０ Ｏ ２．２流动相的选择 本实验以不同比例的二甲基亚砜水溶液作流动 相等度洗脱，结果发现，当二甲基亚砜水溶液浓度 为５％时，既能与标准溶液中的二甲基亚砜相分离， 又不受面粉中的干扰杂质影响，分离效果较为满意。 我们分别使用０．５％、１０％、３０％、５０％二甲基亚 砜水溶液作为流动相，发现０．５％二甲基亚砜水溶 液作为流动相时，标液中偶氮甲酰胺与二甲基亚砜 的峰相近，不易分开；高浓度的二甲基亚砜水溶液 作为流动相时，标准曲线线性关系差（见图１，２）。 图１ 用０．５％二甲基亚砜水溶液作为流动相时 ８０ｍｇ／Ｌ偶氮甲酰胺标液图谱 耀崖（，ｍｇ／Ｌ） 图２用１ Ｏ％二甲基亚砜水溶液作为流动相时， 偶氮甲酰胺的标准曲线图 ２．３样品萃取试剂的选择 偶氮甲酰胺易溶于二甲基亚砜和Ｎ，Ｎ一二甲基 甲酰胺，微溶于水、醇和丙酮等有机溶剂，但二 甲基亚砜和Ｎ，Ｎ二甲基甲酰胺不易挥发除去干扰， 不适合作为提取溶剂，经比较，以丙酮作为提取溶 剂，可提取出面粉中低限量的偶氮甲酰胺，干扰杂 质少。分别使用５％、１０％、３０％、５０％、纯二甲 基亚砜和５％、１０％、３０％、５０％、纯Ｎ，Ｎ二甲基 甲酰胺进行提取，在４０℃氮吹浓缩，发现一方面 不易挥发去除，另一方面回收率在４０％～５０％之 问，均不能达到理想效果。而使用丙酮则两方面问 时问（－ｉｎ） 图３添加１ ＯＯｍｇ／ｋｇ偶氮甲酰胺时，用纯二甲 基亚砜提取，回收率为４９．６７％ 时问（－ｉｎ） 图４添加１ ＯＯｍｇ／ｋｇ时偶氮甲酰胺，用纯Ｎ，Ｎ二甲 基甲酰胺提取，回收率为４３．５２％ 图５添加ｌ ＯＯｍｇ／ｋｇ时偶氮甲酰胺，用丙酮 提取，回收率为８９．２６％ ２．４线性关系考察 用选择好的方法分别测定不同浓度的偶氮甲酰 胺（见图６）。由标准曲线可看出，在０￣１００ ｍｇ／Ｌ 选定的浓度范围内含量与其峰面积的线性相关系数 浓度（ｍｇ／Ｌ） 图６偶氮甲酰胺标准曲线图 分析测试 大于９９％，回归方程为ｙ＝１３７４７ｘ，ｘ为偶氮甲酰 胺浓度，ｍｇ／Ｌ；Ｙ为峰面积，定量下限为４．０ｍｇ／ｋｇ （Ｓ／Ｎ＞ｌＯ）。 ２．５精密度试验和回收率试验 选择小麦粉为基质，添加１ ０．０ｍｇ／Ｌ、５０．０ ｍｇ／Ｌ 两个水平的偶氮甲酰胺标准品，每个平行测定 １０次，外标法定量。结果表明，平均回收率为 ８４％～９０％，方法相对标准偏差小于５％，满足测定 需求（见表１，２和图７）。 表１ 偶氮甲酰胺检出限计算结果（ｎ：１Ｏ） 时阔如ｉｌ） １０．．２３４；１０．７４０；９．２５６ ｉ ｌ０．３７７； 图７标物偶氮甲酰胺的ＨＰＬＣ谱图 ｘ（ｍｇ／Ｌ） １０．．５６７；１０．３７６；１０—２５８；９．７６６； ３小结 ９．０１２；９．．９４２； Ｘ（ｍｇ／Ｌ） １０．０５３ 本次实验主要是用液相色谱法对５种实际样品 Ｓ（ｍｇ／Ｌ） ０．５６１ 的分析试验，选择氰基柱，用５％二甲基亚砜水溶 最低检测限（ｍｇ／ｋｇ）４（以３ｓ计算） 液为流动相，以丙酮作为提取溶剂。研究结果表明， 表２试样测定的精密度与回收率实验结果（ｎ：１０） 该方法可准确测定小麦粉中的偶氮甲酰胺且有很好 的线性关系，相关系数大于９９％，最低检出限为 ４ｍｇ／ｋｇ，加标回收率在８４．０％－９０．０％，从而确认 用液相色谱法可满足面粉中偶氮甲酰胺的测定。 参考文献 ｌ凌关庭，唐述潮，陶民强．食品添加剂手册［Ｍ］３版，北京： 化学工业出版社，２００４ ２王远成，任凌云，周晓邑等．偶氮甲酰胺对面粉粉质及面 包质量的影响［Ｊ，粮油与饲料工业，２０００，（Ｊ］４）：７－９ ３ ＡＤＡＭ Ｂ，ＢＥＮＪＩＡＭＩＮ Ｐ Ｙ Ｌ，ＤＡＶＩＤ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｎａｍｉｄｅ．ｔｒｅａｔｅｄ ｆｌｏｕｒ：Ａ ｍｏｄｅｌ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｊ Ａｇａｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００４，５２：５７３０－５７３４ ２．６样品分析 ４陈波，靳保辉，林燕奎等．面粉中偶氮甲酰胺含量的 从实验室监督检验样品中分别选取不同级别的 高效液相色谱法测定［Ｊ，分析测试学报，２００８，（Ｊ】９）： １ ００２￣１００４ 小麦粉４５份，均未检出偶氮甲酰胺。 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｎａｍｉｄｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｌｆｏｕｒ ｂｙ ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ＧｏｎｇＹａｏｚｈｏｎｇ ＧｏｎｇＱｉａｎｇ ＺｈａｎｇＹｅ Ｌｉ Ｊｉｎｇ ＹａｎｇＢａｏ ＹａｎＸｉａ （Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｔａｉｙｕａｎ ０３００ １ ２） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｎａｍｉｄｅ（ＡＤＡ）ｉｎ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｅｔｏｎｅ．Ｔｈｅ ｔｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｃｏｎ— ｃｅｎ￣ａｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｎｉ￣ｏｇｅｎ ａｎｄ ｄｉｌｕｔｅｄ ｔｏ ｌｍＬ ｗｉｔｈ ５％ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ ｒｅｍｏｖｅｄ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｂｙ ｈｅｘａｎｅ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｗｉｈｔ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０－ｌ ＯＯｍｇ／Ｌ（ｒ２＝０．９９７９）ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ４．０ｍｇ／ｋｇ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆＡＤＡ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｌｆｏｕｒ ｓｐｉｋｅｄ ａｔ ｔｗｏ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ １ ０．０～５０．０ｍｇ／ｋｇ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ８４％￣９２％，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅａｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ５％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｗｈｅａｔ ｌｆｏｕｒ ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｎａｍｉｄｅ（ＡＤＡ）Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ） ６７