中国预防兽医学报
ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine
Vol.32，No.11Nov.2010
doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2010.11.01
通过暂时免疫抑制研究跨膜蛋白C末端缺失
对EIAV疫苗株EIAVFDDV12体内复制的影响
姜成刚1,2，马
建2，林跃智2，赵立平2，吕晓玲2，华育平3，刘
娣1*，周建华2*
(1.黑龙江省农业科学院畜牧研究中心博士后工作站，黑龙江哈尔滨150086；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室，黑龙江哈尔滨150001；3.东北林业大学博士后流动站，黑龙江哈尔滨150086)
摘要：马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗，但其作用机理尚不明了。我们的前期研
究发现EIAV疫苗株EIAVFDDV12编码跨膜蛋白gp45的基因在马体内发生高频率G2230A点突变形成终止子，使该蛋白C末端出现154个氨基酸的截短。为了探讨该截短蛋白对EIAV疫苗株生物学特性的作用，本研究以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆基础上，构建了gp45截短型感染性克隆，脂质体转染细胞，增殖传代，获得病毒株EIAVFDDVTM-36，接种到马体内。在接种后167d内未观察到临床症状，连续注射10d地塞米松以暂时抑制免疫系统，并用迟发性超敏反应和淋巴细胞增殖实验评价免疫抑制效果。结果显示，截短型跨膜蛋白疫苗株EIAVFDDVTM-36接种组免疫抑制前后病毒载量和中和抗体效价差异不显著，而完整型跨膜蛋白疫苗株感染性克隆EIAVFDDVTM-45接种组4匹马中3匹免疫抑制后病毒载量显著上升，同时组内中和抗体效价明显提高。以上结果表明，马体特异性免疫压力对EIAVFDDVTM-36复制无影响，而对亲本株EIAVFDDVTM-45复制有抑制，显示跨膜蛋白截短型EIAV作为疫苗更为安全。但免疫抑制造成的gp45跨膜蛋白未截短型疫苗株感染性克隆体内病毒载量升高，可以促使机体产生更高的中和抗体效价，提示该疫苗的安全性和有效性在一定程度内呈负相关(相互制约)。因此，安全性和有效性的平衡是慢病毒减毒疫苗研发需注意的重要因素。
关键词：马传染性贫血病毒；跨膜蛋白；截短突变；体内复制；免疫抑制中图分类号：S852.65
文献标识码：A
文章编号：1008-0589(2010)11-0829-05
Transientimmunesuppressionofinapparentcarrierponies
inoculatedwithattenuatedequineinfectiousanemia
virusinfectiousclone
JIANGCheng-gang1,2,MAJian2,LINYue-zhi2,ZHAOLi-ping2,LVXiao-ling2,HUAYu-ping3,
LIUDi1*,ZHOUJian-hua2*
(1.PostdoctoralWorkstation,LivestockResearchCenter,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China;2.StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,
Harbin150001,China;3.PostdoctoralWorkstation,NortheastForestryUniversity,Harbin150086,China)
Abstract:Equineinfectiousanemiavirus(EIAV)vaccineisthefirstlentiviralvaccinewithasuccessfulapplication,butitsmechanismoninducingprotectiveimmunityremainsunclear.Ourpreviousstudiesfoundthatthegeneencodingtransmembraneprotein(gp45)ofEIAVvaccinestrainEIAVFDDV12hadahigh-frequentG2230Amutationtocreateastopcoding,resultingina*Correspondingauthor
收稿日期：2010-02-19
基金项目：十一五重大传染病专项(2008ZX1001-1010)；国家自然科学基金(30771994、30901349)；黑龙江省博士后基
金项目(LBH-Z08017)
作者简介：姜成刚(1977-)，男，黑龙江哈尔滨人，助理研究员，主要从事慢病毒疫苗及其免疫机理研究.*通信作者：E-mail：jianhua_uc@126.com；liudi1963@163.com
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truncationof154aminoacidresiduesattheC-terminus.Toexplorethebiologicalmeaningofthegp45truncation,amolecularcloneEIAVFDDVTM-36withtruncatedgp45wasconstructedusingEIAVFDDVTM-45asthebackbone.EightponieswererandomlygroupedandinoculatedwitheitherEIAVFDDVTM-36orEIAVFDDVTM-45andtransientimmunesuppressionwasinducedbydailyinjectionofdexamethasonefor10days.TheresultsshowedthattreatmentofdexamethasonedidnotappeartoaltertheplasmaviralloadsandserumneutralizingantibodyactivitiesinEIAVFDDVTM-36-inoculatedponies,howeveritsignificantlyincreasedplasmaviralloadsinthreeoffourEIAVFDDVTM-45-inoculatedponiesafterthetransientimmunesuppressionwereobserved.Furthermore,thetreatmentofdexamethasonesignificantlyenhancedtheserumneutralizingactivityoftheEIAVFDDVTM-45groupofponies(p<0.05).ItappearedthatspecificimmunepressurehadnoeffectonEIAVFDDVTM-36replicationinvivo,ratherlimitedtheproductionEIAVFDDVTM-45,implicatinganelevatedsafetyofEIAVFDDVTM-36asanEIAVvaccine.Ontheotherhand,theincreasedplasmaviralloadsandahigherneutralizationantibodyactivityinEIAVFDDVTM-45-inoculatedponiesindicatedthattheprotectionefficacyandthesafetyofEIAVattenuatedvaccinesmaybenegativelycorrelated.Therefore,itwasimportanttocarefullybalancethesetwocriteriaoflentiviralvaccines.
Keywords:equineinfectiousanemiavirus;gp45transmembraneprotein;truncatedmutation;invivoreplication;immunesuppression
马传染性贫血病(Equineinfectiousanemia，EIA)是由慢病毒属的EIA病毒(EIAV)引起的马属动物的传染性疾病，其主要临床症状表现为高热、血小板降低，贫血、消瘦等[1]。EIA主要通过吸血昆虫叮咬由血液传播，宿主一旦被感染将终生带毒，具有潜在传染性，给养马业带来严重的损失。我国于二十世纪七十年代研制成功世界首例慢病毒疫苗，即EIAV驴白细胞弱毒疫苗[2]。该疫苗的成功研制，为其他慢病毒疫苗研究，尤其是人类艾滋病疫苗研究提供了很好的动物模型。
慢病毒抗原的高度变异是病毒逃避机体建立特异性免疫的主要原因。其抗原变异主要发生在病毒囊膜蛋白(Env)激发宿主免疫反应的关键靶位[3]。EIAV的env基因经转录后拼接产生了约4200nt的mRNA，其翻译后的糖蛋白前体再经蛋白酶裂解为表面蛋白(SU，gp90)和跨膜蛋白(TM，gp45)。主要的抗原变异位点在gp90的糖基化位点，gp45虽相对保守，但仍是决定病毒结合细胞受体以及产生中和抗体的重要结构蛋白[4-5]。EIAVFDDV12是驴白细胞弱毒疫苗的皮肤细胞适应株，具有更好的免疫保护性和更低的病毒毒力[6]。本实验室前期研究发现EIAVFDDV12的gp45氨基酸序列W261位点在马体内发生高频率翻译终止突变，使该蛋白跨膜区之后的胞浆内片段C末端出现154个氨基酸残基的缺失。本研究以前期构建的EIAVFDDV完整型gp45感染性克隆质粒EIAVFDDVTM-45为骨架，构建跨膜蛋白截短型感染性重组质粒，转染细胞，获得了感染性克隆毒株EIAVFDDVTM-36。将其接种马，比较跨膜蛋白截短对
EIAV毒力，即体内复制水平和致病性的影响。
1
1.1
材料和方法
病毒株及实验动物
EIAVFDDVTM-45为本实验室
保存EIAV疫苗驴胎皮细胞适应株，EIAVFDDVTM-36为在EIAVFDDVTM-45感染性克隆质粒基础上改造的跨膜蛋白截短型疫苗株[7]。实验动物为蒙古马购自内蒙通辽，EIA琼脂凝胶免疫扩散试验均阴性[8]。1.2
实验设计
实验共分3组，包括EIAVFDDVTM-36
接种组，EIAVFDDVTM-45接种组分别皮下接种104pfu/mL，以及PBS接种对照组，每组4匹马。将疫苗接种马匹按0.11mg/kg的剂量连续14d注射免疫抑制剂地塞米松。免疫抑制10d后，监测马匹迟发型超敏反应(DTH)[9]和淋巴细胞增殖水平[10]，评价免疫抑制效果。同时，每天监测体温2次，血小板每2d监测一次(深圳迈瑞公司VET-2800型血球计数仪)。1.3
病毒载量测定
用含肝素抗凝剂采血管对马匹
颈静脉采血，2000r/min离心10min，吸取上层血浆，用QiagenRneasy试剂盒提取病毒RNA。按照文献[11]的方法建立Real-timeRT-PCR标准品。用StratageneMx3000P荧光定量PCR仪进行定量分析，反应程序为：42℃5min；95℃10s；95℃5s、60℃25s，40个循环。1.4
中和抗体测定
按文献[12]方法进行，取健康
马抗凝血200mL，置三角瓶内自然沉降1h后，吸取上层白细胞层，1000r/min离心10min，用PBS洗两遍，用含50%牛血清的1640培养液稀释至
第11期姜成刚，等.通过暂时免疫抑制研究跨膜蛋白C末端缺失对EIAV疫苗株EIAVFDDV12体内复制的影响831
2×107细胞/mL，接到细胞培养瓶中。37℃培养24h，用PBS洗掉未贴壁细胞，用冷生理盐水洗脱贴壁细胞(主要为巨噬细胞)，按2×105细胞/100μL/孔接种到96孔细胞培养板中培养24h，PBS洗掉未贴壁细胞，加细胞维持液每孔160μL继续培养。将分离的待检马血清56℃灭活30min，取20μL血清与20μL1×103TCID50的标定病毒EIAVDLV34孵育1h，加到已接种马巨噬细胞的96孔细胞培养板中，同时设阳性对照组继续培养。5d后吸取100μL培养上清，用ReverseTranscriptaseAssayColorimetricKit(Roche)检测反转录酶(RT)活性。当待检血清重复孔的RT均值低于EIAV阴性健康马血清复孔RT均值的50%时，可判断该血清具有中和活性。
2
2.1
结果
试验过
免疫抑制过程中马匹EIA体征监测
程中监测了12匹马的体温和血小板的动态变化。EIAVFDDVTM-36接种马(2#、20#、24#、26#)在免疫抑制过程中体温未见异常，血小板指标基本稳定(图1A)。4匹EIAVFDDVTM-45接种马中，15#马在注射地塞米松后第7d和第15d出现体温升高过程，28#马也在给药后第6d和第12d呈现体温升高至发病阈值(39℃)，其他2匹马31#和34#体温正常。同期进行的血小板检测显示，4匹马血小板数值均在正常范围(>100platelets/μL)之内(图1B)，提示15#和28#马为非典型或轻微EIA发病。接种PBS的4匹对照马体温和血小板均在正常范围内(图1C)。2.2
免疫效果评价
将地塞米松注射10d后的马
匹用DTH和淋巴细胞增值实验检测马匹免疫抑制效果，结果表明这2种方法检测的免疫应答在使用免疫抑制剂后明显下降，通过统计学分析，结果显示免疫抑制前后组内差异显著(p<0.01)，证明免疫抑制效果良好(图2)。2.3
病毒载量变化
将免疫抑制前后血浆病毒载量
之间变动，未达到EIA典型发病阈值(>106copies/mL)，与之前体温未升高的监测结果相一致。2.4
中和抗体水平
将标定病毒与待检血清作用
后，接种至马巨噬细胞，5d后检测病毒RT活性。结果判定以EIAV阴性健康马血清复孔RT均值50%为基准进行比较，低于50%值的样品判定有中和活性，高于50%值没有中和活性，而中和抗体滴
用real-timeRT-PCR方法进行测定，结果显示，EIAVFDDVTM-36接种马免疫抑制前后病毒载量差异不显著，而EIAVFDDVTM-45接种马15#、28#和34#免疫抑制后病毒载量显著增高(p<0.05)，31#马免疫抑制前后病毒载量差异不显著(图3)。34#马虽然病毒载量显著升高，但在103copies/mL～105copies/mL范围
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度与RT活性(OD450nm)成正比。结果显示免疫抑制前EIAVFDDVTM-36接种组马匹(2#、20#、24#及26#)和EIAVFDDVTM-45接种组(15#、28#、31#、34#)血清均不具有中和抗体活性(图4A)，而免疫抑制后EIAVFDDVTM-45接种组15#马血清具有良好的中和活性，28#、31#和34#马血清中和活性均有升高的趋势(即RT活性降低，见图4B)，统计分析结果显示组间差异显著(p<0.05)。
3讨论
减毒疫苗通常是最有效的疫苗形式，对一些重要传染病的预防和控制起到了主要作用，例如天花疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗的接种，诱导了良好免疫保护效果[13]。然而，出于安全性考虑，艾滋病等慢病毒的减毒疫苗的开发和试验一直处于非主流状态，受到质疑。由于艾滋病疫苗研究缺乏能诱导保护性免疫的合适动物模型，EIAV减毒疫苗的成功应用，对于艾滋病疫苗研发提供了借鉴。本研究结果对马体免疫压力与减毒疫苗安全性，以及疫苗株感染性克隆复制特性与体液免疫(中和抗体)水平相关性提供了重要实验依据。
免疫抑制后，EIAV跨膜蛋白完整型疫苗株EIAVFDDVTM-45接种组中4匹马中的2匹发生体温和病毒载量升高现象，跨膜蛋白截短型疫苗株EIAVFDDVTM-36接种的4匹马无一出现以上EIA相关症状，显示马体特异性免疫对EIAVFDDVTM-36有更好的控制能力，即跨膜蛋白C末端截短突变进一步降低了EIAV疫苗株的毒力，但其机理尚不明了。该结果还表明，机体的免疫压力与减毒疫苗的安全性呈密切正相关。
本研究发现，跨膜蛋白完整型疫苗株EIAVFDDVTM-45
与截短型疫苗株EIAVFDDVTM-36相比，更具有诱导中和抗体的能力。虽然尚不能完全排除gp45跨膜蛋白C末端截短造成中和抗原决定簇减少，进而降低了诱导中和抗体能力的可能性，EIAV中和抗体主要是针对由gp90囊膜表面蛋白。EIAVFDDVTM-36和EIAVFDDVTM-45的gp90抗原表位区相同，EIAVFDDVTM-45诱导较高中和抗体可能是由于免疫抑制后病毒载量升高，当免疫抑制恢复后，较高的病毒载量刺激免疫系统产生较高的血清中和抗体。该结果与Craigo等报道的研究结果相同[14]，暂时免疫抑制可以促使机体产生更好的免疫保护效果。
EIAV疫苗株EIAVFDDV12接种于马体内出现高频率跨膜蛋白截短现象，是病毒适应体外皮肤细胞培养环境的结果，由病毒本身特性所决定。当跨膜蛋白截短型疫苗株EIAVFDDVTM-36接种到马体内，其血浆病毒载量一直保持1×104copies/mL～1×105copies/mL之间，进行10d的暂时免疫抑制，病毒载量也未见明显升高，显示了良好的安全性。Craigo等的研究将EIAV的S2基因突变株EIAVD9接种马体后无临床症状，并可诱导对6个月后同源强毒株EIAVPV
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攻击的免疫保护，都没有明显EIA发病症状[15]。然而进行地塞米松暂时免疫抑制后，50%马匹出现EIA典型症状。因此，暂时免疫抑制方法可以更有效评价疫苗免疫保护效果及安全性。
综上所述，以上研究结果表明，EIAV跨膜蛋白C末端区与病毒复制水平和毒力呈正相关。此外，暂时免疫抑制可提高EIAV病毒载量和中和抗体水平的结果提示，慢病毒减毒疫苗安全性和有效性在一定程度内存在负相关，即过度提高安全性可能会以降低免疫应答水平为代价，两者之间的平衡对有效慢病毒减毒疫苗非常重要。
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(本文编辑：赵晓岩)
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