中阳组纵工程斜宄‘jI临脒康复彩74学掰7彬esearc2010’20100101小版No1疋死君JournalofClinicalRehabifitativeTissueEngineeringRhJanuaryV0114术1分化胞胞干向软细骨生间充细质转化长因子p诱导骨髓拿Ⅲ悒曲分tt，+ln门：Diftraerennstiatioofbonemarrowcmesenchymalstemcellsintochondrocytesinducedbyfonrminggnrowthfatonrbeta1LiLiyaHuagJinzhongsDuJiagAbDepartmentOtorhinolaryZhujiaSountractnsonfBACKGROUND：TraformgologyengineeringSuitableesconceinggrowthfactontrationcanstimnsr31)isbeta1(TGF1aifrstselectedgrowthfactorinstudyularcofarticulanrcartsilagetissueulateproliferationdivisionanddiferentiationofarticholsdrocytemgHospitalMedicaIityOBJECTIVEc：TotablishathemersUnivGhondrocytes：BincontaineferentiationofbonempecialinducingsystemfordifnvivodTGF131culture／andtoobservethechangesinafowcemesenchymatecells(BMSCs)intoanllformcuangzhouMETHODSnMSCstedswereseparatedanrmdpurifiineedfrOmrabbittibialtubercleusingattahmedphentcultureannotypemethodSurfacetigecnofith510282PGrovinceuangdoChinagthethirdgeneraBMSCspeciawasdetes31TGF1containedlinducingystemdbyusingflowcytometrySubsequentlydin21dayculturewhichwascomparethethirdgweneratedBMSCsewereceinduodewithhumanseLiLiya0fnDepartmentfoIlowinginductionOtorhinZhujiaSounolaryngologygHoitythemrspitalMsdicaIsdusingimmunohistochemicaImCollagentype儿wasqualitativelydeterminedusingattachmenlculturemethod1heRESULTSANDCONCLUSION：RabbitBMSCswereseparatedandpurifiebutnegativeforsurfaceantigenCD34andCD45CellformthirdgeneratedBMSCswerepositiveforsurfaceantigenCD44irregular21daysafterinductionImmunohistochemicalstainingfortypellcollagendemonstratedpositivecellsResultssuggetilagptalcarethodllsfnosewasstedUniveGthatusnderculturesystemconta3BMSCsiningTGF1maydirectionallydifferentiateintochondrocytesandtherewerenotuangzhou510282GuangdongProvinceChinaignificantdiferenceswithnormalchondrocytesLiLYfaHuanliliyan0417@126comctorbetawCorrespondence￡oww／／fhttp：gJZDuJDiferentiationofbone1ZhongguoZuzhiGongchengYaenzglckfcom】crtercnhttp：／／marrownmesencchymgKaalstemcellsintochondrocytesinducedbytransforminggrowthjiuyuLinhuanngfu14(1)：38412010；HuangJinzhongDepartmentofOtorhinolaryngology摘要背景：转化生长因子B1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子适当浓度能刺激关节软骨细胞增殖目的建立含有转化生长因子B1的特殊诱导体系培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力ZhujiangHospitalSouthelrMedical分裂和分化UniveGuanrsitygzhou观察诱导后的细胞510282PhoGuangdoang形态及表型变化inceChin方法于兔胫骨结节内侧抽取骨髓胞仪检测鉴定其表面抗原养21d采用贴擘培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞取第3代骨髓间充质千细胞行流式细uangJinzhong2005corn@Su126以含有转化生长因子B1的特殊软骨诱导体系的培养条件1：对第3代骨髓间充质干细胞诱导培诱导后与人鼻中隔软骨细胞进行比较采用免疫组织化学法对II型胶原进行定性检测tpporraedbythecienceNatuIS结果与结论贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞CD45所得第3代骨髓间充质干细胞表i百j抗原CD44阳性CD34FouGndationofrov阴性经诱导培养21d后细胞形态变为不规则II型胶原免疫组织化学染色显示可见阳性细胞提示含有转化生长uanNogdongP990418ince因子81的特蝶软骨诱导体系的培养条件下doi：103969／jis骨髓间充质于细胞可以转化为软骨细胞且与正常软骨细胞无明最差异31；软骨细胞间充质干细胞：诱导：分化关键词：转化生长因子1Received：20090823Accepted：20090927sn16738225201001009争丽艳黄金中¨翟研究与临床康复杜江转化生长因子p1诱导骨髓间觅质干细胞向软骨细胞分化【J】-中国组织：201014(1)：3841ww／／[htp：wcrterorgcnhttp：／／zglckfcom】31作为诱导剂观察步研究用转化生长因i1：0引言骨髓『uJ充质十细胞(boBMSCs促进其分化为软骨细胞的能力条件旨在为软骨组织缺损修复提供更多种r软骨细nemarrow胞来源途径mesenchymalstemcellsBMSCs)具有自我更1新和多向分化潜能的特征目前已成为修复软材料和方法骨缺损主型的种子细胞来源所以赴当前绀织设计：观察性实验修复领域的研究热点培养方法简单果好而且BMSCs在体外分离扩增速度比较快修复缺损效时间及地点：：200811在实验J200709／但诱导成软骨细胞需要定条件其中南方医科大学儿科实验if1心完成：诱导囚予0软骨环境是影响BMSCs成软骨能力的两大手要冈素材料：4周龄雄性新旧薹大白兔2量(2025)kgEl体质31是诱导转化牛长冈y1由南方医利大学动物th心提供BMSCs)J戈为软骨细胞的霞婴因了之实验进实验过程中对动物的处臀符合中华人民兆和国ROBox1200Shenyang110004cnzglckfcorn李丽艳等转化生长困予e1诱导骨髓同克蹑干细匏向软骨缀瞻分化@角型及多角型软骨细胞逐渐形成2死零一c…。母关于善待实验动物科学技术部2006年颁布的《三的指导性意见》标准【主要试剂及仪器：”南方医科大学珠江医院耳鼻喉科诱导细胞及软骨细胞免疫组织化学染色分析：BMSCs广东省广州市510282花诱导分化21d后和第2025％胰代软骨细胞均采用常规办法免疫细胞化学染色试剂及仪器来源贴壁细胞去李liliya丽艳n0417@126培养基10m蛋白酶消化in2000r／min离心通讯作者：黄金中南方医科大学珠江医院耳鼻喉精产吼寺精产寿、in将细胞怂液滴到载玻片m烘干后经DMEM胰岛索Gibico40g／L多聚甲醛固定15用PBS洗3次10％抗坏血酸胎牛血清转铁蛋白Sigma羊血清室温封闭20洗3次min吸出血清37加入兔抗hII型胶原酶地寒米松HyclonePe人II型胶原单兜隆抗体℃孵育2后PBS510282huangJinzhong2005@126com转化生长因子B1胰蛋白酶丙酮酸钠protechoi儿J入羊抗兔二抗(1：500)4℃过夜显Gibc色后在娃微镜F观察检测R3942中图分类号：A文献标识码：16738225文章编号：(2010)010003804威佳林主要观察指标：大体观察II型胶原定性兔抗人II型胶原多克隆抗体羊抗兔IgGs武汉博士德晶美生物Olympus收稿日期：20090823修回日期20090927f20090223031，WLABC试剂盒Q1显镜及数码成像系统BX51DP502结果的原代培养结果特殊软骨诱导体系：转化生长因予B110pglL21BMSCs骨髓分离的细胞胰岛素625mLg／丙酮酸钠1mmomol／L维牛接种24h后便有少量的细胞贴壁经1周后逐渐形成扁平单层细胞素C375mg／L地塞米松10l／L转铁蛋呈漩涡状或栅栏样成簇生长8625mLg／随着细胞密度的增加胞体变得细长形态类似实验过程：BMSCs成纤维细胞原代细胞牛长较慢长满瓶底需24周(见图1)的分离培养：在无菌条件下进行所有在胎牛向．清存在的条件下传代细操作髓4用骨髓穿刺针于兔胫骨结节内侧抽取骨L胞在三四天片存可增殖1倍(见图2)m2000r／min离心10min去脂肪颗粒m及上清再将骨髓液缓慢注入4L淋巴细胞分层液(相对密度为1077)的试管中度离心密度梯。2000r／min离心20洗2次min日j的抽取中『cm10／单核细胞层Hanks以5×a浓度接种于细胞瓶中加入DMEM培养基于37℃体积分数为5％C02及饱和湿度下静置培养原且占壁并融合成单层时代细胞l025％胰蛋白酶消化传代培养Threedaysfollow软骨细胞采集及培养：无菌条件F取鼻中隔bonemarrowm(BMSCs)(xl00eingprimarycultusenchymalstemreofcells偏曲手术患者的鼻中隔软骨PBS(含青霉素20到1BMSCs)原代培养传代后3d(x100)L万U／小L)漂洗3次剪成1mm大链霉素200g／软骨碎片置于10mL离心管中加入2倍体L)37℃恒温振荡器内消积的II型胶原酶(3g／化6hPBSm终止消化并漂洗3次2000r，min℃离心10in弃上清2培养条件为37体积分数为5％C0细胞贴壁后每隔两i天更换培养基35培养细胞相差显微镜下观察原代细胞贴壁并融合成单层时025％胰蛋白酶消化min传代培养'BMSCsI~]诱导分化：取生长状态良好的第3代兔BMSCs制成细胞悬液调整细胞密度为。1X10一加入含有转化生长因子B1的特殊软骨诱导体系每两三天换液1次CN211539／R可见圆形：ZLK|sSN16738225CODENHAH39疋7易2Ⅳ呲cR瑚。rg攀稍艳等转化生长函7§1诱导嚣髓间充暖干细跑向软骨缅瞻分化培养的细胞可以稳定生长传代而且体外培养10代优点细胞而且具有分离简单塑形广泛以及对机体损伤以后细胞的增殖速度虽无明娃减慢变宽但细胞形态开始小的特点是自体或异体修复软骨组织缺损理想的种子变长22呈去分化状态其在软骨的缺损修复研究r{]耿得了很好的治疗效辛成为重要的工具在细胞治疗一BMSCs的诱导分化及染色结果诱导前细胞呈典d以后果皿】型的成纤维样问充质细胞形态诱导7胞体逐转化生长因fB是族多肽类生长闪了作为种步回缩胞立体感增强(见图3)21d后完全转化为软骨细大分子复合体存在于骨组织pJ软骨基质以及缸小板等组织：免疫组织化学染色结果显示胞浆可见清晰的密集胚胎形成期可诱导原始的问充质f细胞分化形成软骨棕褐色颗粒II型胶原抗体阳性(见图4)其中转化乍长因子B1足关节软骨组织工程研究的首选牛长因了分裂和分化【4-圳适当浓度能刺激犬节软骨细胞增殖在实验中采用含有转化生K因子B1的特殊软骨诱导体系导时间l!快F单纯采用转化且诱导设果明!『生长因子B1诱导2周就可以诱导成功垃著地缩短了诱II型胶原主要存在于软骨rfl闪此被作为问充质干细胞分化为软骨的主要特异性蛋白在实验中采用经转化牛长因予G1诱导的BMSCs软骨细胞与培养的鼻中隔软骨细胞进行对比观察证实了转化生长因子B1能诱导BMSCs形成软骨细胞染色无明显差异BMSCs在免疫组织化学染色后BMSCs诱导的细胞被不同程度地染成棕黄色且与鼻中隔软骨因此实验采用转化生长因子B1对向软骨细胞进行的成功诱导结果表明：BMSCs合成软骨特异性大]子B1能在体外具有分化为软骨细胞的能力；转化生长『诱导BMSCs增殖和向软骨细胞分化提供大量的种子细胞II型胶原甚至蛋白多糖；可以为软骨组织工程修复缺损目前国内外对促使转化生长因予B1更好地发挥作用进行了大量的研究Okano等嘲利用求lJ激转化生长因fBl发挥更大作用静电磁场的原理I下步可以利用改善转化生长因子B1作用时问及环境等因素利用生长因子间的协同作用促进软骨生成使其VJ在耳鼻咽喉部位的软骨缺损发挥更大作坩当前有关软骨修复方法的研究很多其根本思路就是将有软骨形成能力的细胞导入到缺损中从而起到修组织形态进器官复的作用23些研究者认为采，m儿扒Zlll：1程技术进行软骨修复可避免修复细胞流失并易于按器官鼻中隔软骨细胞培养结果及染色原代软骨细胞行塑形以及提供力学支撑果因此可有更好的临床修复效多为圆形核大胞浆少透明细胞大小基本致种子细胞是体内外构建软骨组织rr程组织J有细胞贴壁接种12hl~[48h细胞几乎全部贴壁细胞最为重要的材料细胞极其有限组织工程化耳廓甚至喉气管软骨很贴壁延展后体积增大渐向外伸出突起形形态呈透明圆盘状部分细胞逐形态趋向大程度上依赖于种子细胞的选择由于白体来源的软骨形态变为多角形少部分细胞呈长梭同时成熟软骨细胞代谢和增殖能力都胞浆中有圆形颗粒随细胞数目增加很低尽管在体外单层培养条件下成熟的软骨细胞可致并逐渐融合形成单层接种1周左右增殖细胞即长以增殖但增殖速度很慢并且很快住去分化后进入满单层免疫组织化学染色结果显示软骨细胞II型胶种老化状态所以直接源于自体软骨组织的种子细胞原抗体均讨论阳性呈棕黄色成纤维细胞等则未被染色在现有的条件下难以满足构建工程化软骨组织的需要从而限制了软骨组织工程的发展因此在体外培养中3具有较强的增殖传代能力并保持良好的生物学活性的软骨细胞成为研究热点BMSCs转化生长㈥~pl诱导BMSCs用作种子细胞不但具有增殖能力强多向成软骨细胞解决了软骨细胞的来源问题修复提供了更好的细胞来源途径POBo为软骨的缺损分化(可以分化为骨软骨肌肉脂肪等多种组织)的：711f~1降低移植物的但1x120&Shenyang110004cnzglckfcom李丽艳等_车々化生长因予B1诱导骨髓间充最干细胞商软骨细匏分化AnRz608611WWWCRTERcrg免疫排斥反应有待进上实现明晰BMSCs向软骨分化的调节机制仍LiSJXieWZhongguoJiaoxingWaikeZazhi2005；13(8)：步研究目前软骨缺损成功修复在实验动物身李松军安荣泽谢伟TGFB1~]bFGFs体外诱导成人骨髓间充质}细胞表达软骨细胞表型的实验研究【中国矫形外科杂志2005J】希望不久的将来能运用到临床为广大患者带13(8)608611来福音4来自本文课题的更多信息参考文献TheMinistryofScieOfChinaGuidance20060930基金癸驾冼广东省自然科学基金资助项目(990418)ncesuaneggdTechnologyofthePeopleSRepublicstionofcaringlaboratoryanimals影耆z声窕无其他利益冲突坦劳剪梁韪毋筛艄不定：虽然实验通过细胞生物学技中华人民共和国科学技术部关于善待实验动物的指导性意见术进行骨髓问充质干细胞分离纯化胞是否具有软骨本身的功能需要进据昝俗席借筌的纷蕊实行体外扩增诱导从而3】【[4】[5】[6】20060930fporcinearticularZhouGLiuWCuiLeta1RepairoosteochondraIdefectsinnonweiqhtbearingareaswithautologousbonemarrowstromaJcellsTissueEng2006；12(111：32093221RoelenBADijkeRControllingmesenchymalstemcellferentiationbyTGFBetafamilymembersJOrthopSci2004；dif9(2)：220228KafienahWMistrySDickinsonSCeta1ThreedimensionaIcartilagetissueengineeringusingadultstemcellsfrOmArthritisRheum2007；56(1)：177187osteoarthritispatientsPenickKJSolchagaLAWelterJEHighthroughputaggregate获得大量表型稳定增殖活跃的软骨细胞但诱导后的软骨细步证实转化生长因子B1诱导骨髓间充质干细胞成软骨细胞解决了软骨细胞的来源问题为软骨的缺损修复提供了更好的细胞来源途径但如何降低移植物的免疫排斥反应明晰骨髓间充质干细胞向软骨分化的调节制仍有待进步研究目前软骨缺损成功修复在实验动物身上cuysterntoassessthechOndrogemesenchymaIstemcellsBiotechniquesltureOkanofieldonBioelecicpotentialof6876912005：39(5)：HTomitaNIkadaYEfectsof120mTstaticmagneticTGFbetalinhibitedendotheliaItubularformationinvitrotromagnetics2007：28(6)：497499sn实现希望不久的将来能运用到临床为广大患者带来福音J式／矽式堡量盟!堕型：墨丝量鱼盟21：!曼皇旦堡，’，0●’’垫!鱼生麴塑丘翌堡垒丝翟型丝窭复丝至壁型!盘薹型笪盈发现带来不必要的麻烦scI期刊投稿要点之二三：本刊发展部7尽可能参照投稿说明认真修改工稿件格式这点是衡量位科研作者您需要向SCI期刊投稿吗?您了解SCI期刊投稿流程吗?您知道向SCI期刊投稿要注意哪些要点吗要版权问题次的稿多投足以摧毁的严谨程度建议大家认真阅读投稿须知forsu个人多年的学术信誉和在学术国内的Introductionbmission逐条地改学术地位德尺度因此自己要严格把握好这个道正以防延误同行评审时间8修回后的投稿信定要核对初稿今天我们通过总结多年研究SCI期刊投稿的13人?如何正确选择必需推荐的审稿中需改正的地方：标题9摘要等些体会供大家参考与讨论口般编辑不会选择投稿人推荐的审但自己还是事先尽量选择同行中的要提前了解此刊是否需要审稿费正确选择对的SCI期刊(见稿人和版面费?有些杂志在出版时是不需要版面CRTER上期国际投稿服务)原则上是小专家但这也与你的投稿目的有关若费的但很可能不提供作者发表后的只提供DOl供作者确认稿件已先向高影响因子的杂志投稿低lF然后不断降十分自信文章的创新性或希望能希望从纸版杂志但是每改投种杂志都需要针对意见中学习提高时挑选大专家4你可以从参考丈献中发表如作者提出需要印刷时就要另交杂所投杂志进行相应的格式修改很长的修稿时间投递这也需要志费用或加收彩图费还有些杂志需要因此再投时也不能盲目如何礼貌地向编辑咨询稿件状收版面费彩图费根据个人需要另加作应该要结合专业知识2008或2007态?与人相处时是存在感情因素的尤者在确认发表前应对发表费彩图费和印刷费逐101年度影响因子表和他人经验来综合选择要投递的期刊其是稿件处于可接受或可拒绝的范围内时确认清楚然后再查询该期刊近年来良好的沟通能力就起很大作用5般外丈SCI杂志的审稿周期是大家的文章发表走向包括内容文章类型等2如何提高投稿的成功率?文章本3个月方面耐心等待可以通过e若2个月不能进行稿两投因为同学身的创新性是第择位因素对口期刊选左右没有消息mail咨询下科内许多杂志的编委是相同的篇文章两次发到同中旦同文章格式完美语句通顺用词准备稿件状态个编委或审稿人手等郝很重要6最后祝大家都能在SCI这条道路上越走越宽广1免被编辑将影响极坏直接导致退稿尤其那版权协议和利益冲突表格要谨慎些投递手稿时就需要转移协议的切记主填写签名时尽量不要代签以|sSN16738225CN211539／RCODEN：ZLKHAH41