黄绿木霉固定化生产纤维素酶及酶学特性的研究

第２６卷第２期　林　产　化　学　与　工　业　Ｖ０１．２６　Ｎｏ．２　２００６年６月　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｊｕｎｅ　２００６　黄绿木霉固定化生产纤维素酶及酶学特性的研究　孙冬梅　，杨谦　，宋金柱　，陈忠祥　（１．哈尔滨工业大学生命科学与工程系。黑龙江哈尔滨１５０００１；　２，黑龙江八一农垦大学生命学院，黑龙江大庆１６３３１９）　摘　要：　利用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化细胞黄绿木霉，结果表明：海藻酸钠质量浓度　５０　ｇ／Ｌ，培养基初始ｐＨ值４．０～４，５，以滤纸浆为培养基碳源培养的小球的稳定性好。发酵产酶培　ＳＵＮ　Ｄｏｎｇ—ｍｅｉ　养时以滤纸浆为碳源，海藻酸钠质量农度为５０　ｇ／Ｌ，ＣａＣＩ　质量浓度控制在２０　Ｌ，培养基初始ｐＨ　值选择为４．５，产酶效果好、酶活力高、保持时间长。添加表面活性剂Ｔｗｉｎ一８０后，产酶能力可进一步提高。通过　（ＮＨ　）２ｓ０　分级沉淀、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一１００分子筛层析和ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ一５０离子交换层析等步骤，分离纯化出黄绿木霉　纤维素酶系中达到电泳纯的３种内切葡聚糖酶（ＥＧ　Ｉ、ＥＧⅡ、ＥＧⅢ）和２种ＪＢ一葡萄糖苷酶（ＢＧ　Ｉ、ＢＧⅡ）。通过ＳＤＳ—　ＰＡＧＥ和ＩＥＦ电泳测得５个酶组分的相对分子质量（　）分别为６２　３００、７１　９００、５２　６００、８５　３００和７８　３００，等电点分别为　５．４、４．８、５．０、５．６和５．８。　关键词：　纤维素酶；黄绿木霉；固定化；等电点　中图分类号：ＴＱ３５１．０１１；Ｑ８１４．２　文献标识码：Ａ　文章编号：０２５３—２４１７（２００６）０２—００７９—０４　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｃ　ｅｌｌｕｌａｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃ　ｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＣｈａｒａｃｔｅＩ．ｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ＳＵＮ　Ｄｏｎｇ　ｍｅｉ　，ＹＡＮＧ　Ｑｉａｎ　，ＳＯＮＧ　Ｊｉｎ．ｚｈｕ　，ＣＨＥＮ　Ｚｈｏｎｇ．ｘｉａｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５０００１，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉｎａｇ　Ａｕｇｕｓｔ　Ｆｉｒｓｔ　Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ　１６３３１９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｅｍｂｅｄｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ　ｗｉｔｈ　ｃａｌｃｉｕｍ　ａｌｇｉｎａｔｅ．Ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｌｇｉｎａｔｅ　５０　ｇ／Ｌ，ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　４．０－４．５　ａｎｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　ｐｕｌｐ　ａｓ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｗｈｅｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｗａｓ　２０　ｇ／Ｌ．ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｗａｓ　４．５，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｗａｓ　５０　ｇ／Ｌ　ｕｓｉｎｇ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　ｐｕｌｐ　ａｓ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｅｔａｎｔ　ＴｗｉｎＩ８０　ｃｏｕｌｄ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｒｅｅ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ＪＢ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｕｎｇｉ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｔｏ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｏｆ　（ＮＨ４）２　ＳＯ４　ｒｆａｃｔｉｏｎａｌ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－１００　ｇｅｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ－５０　ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａ—　ｐｈｙ．Ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ａｓ　ＥＧ　Ｉ，ＥＧⅡ，ＥＧⅢ，ＢＧ　Ｉ　ａｎｄ　ＢＧⅡ，ｗｉｔｈ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔｓ（Ｍｒ）ｏｆ６２　３００，７１　９００，　５２　６００．８５　３００　ａｎｄ　７８　３００　ｂｙ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，ａｎｄ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔｓ　ｏｆ　５．４，４．８，５．０，５．６　ａｎｄ　５．８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｉｓｏｅｌｅｅｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔ　林产资源的生物利用是运用现代生物技术对可再生的林产资源进行加工利用。随着全球性能源危　机、粮食危机和环境危机的到来，人们对林产资源的利用更加重视，尤其是可再生的植物纤维资源的深　度加工利用，已引起国内外的普遍关注。目前，林产资源生物利用领域的研究，主要包括可再生的植物　纤维资源生产清洁能源和蛋白饲料、纤维素酶和半纤维素酶的应用、功能性糖醇和低聚糖的开发、香料　化合物生物合成、萜类化合物的生物转化等。纤维素是世界上最大的可再生Ｉ生有机质资源，据估计每年　全球通过生物合成可再生性纤维素达ｌ　０００亿吨以上，但被利用的极少。如果能将纤维素转化成葡萄　收稿日期：２００４一ｌ２一Ｏ７　作者简介：孙冬梅（１９７０）。女，黑龙江北安人，副教授，博士生，从事微生物研究　通讯作者：杨谦，教授，博士生导师，从事生物学研究。　维普资讯 http://www.cqvip.com

８０　林产化学与工业　第２６卷　糖、乙醇及其它化工产品或生产单细胞蛋白，既可以缓解当今世界面临的粮食和能源危机，又可以减少　纤维素废料引起的环境污染¨　。近年来，纤维素资源的开发利用受到广泛重视，纤维素酶的需求量越　来越大。固定化酶和固定化细胞是国外六七十年代发展起来的一项新的生物技术，固定化细胞可反复　使用，发酵过程易于控制，后提炼工艺简化及降低成本和实现连续发酵。因此，固定化技术已广泛应用　于工业、医学、化学分析、环境保护、能源开发等各个方面。在发酵领域中，固定化技术已应用于乙醇、氨　基酸、有机酸、酶制剂和抗生素等产品的生产＿４　Ｊ。海藻酸钙凝胶是一种常用的制备固定化酶载体，本　研究探讨了利用其固定黄绿木霉进行纤维素酶的生产并对获得的纤维素酶组分进行分析。　１材料与方法　１．１实验菌株　黄绿木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ），实验室分离得到。　１．２　固定化细胞的制备　用Ｍａｎｄｅｌ　Ｓ营养液加０．００５　ｇ／Ｌ木糖、０．０１５　ｇ／Ｌ葡萄糖、０．００３　ｇ／Ｌ蛋白胨、０＋２　ｇ／Ｌ滤纸浆、ｐＨ值　４．５加热配制成５０　Ｌ的海藻酸钠溶液。将黄绿木霉孢子悬液按一定比例加入上述海藻酸钠溶液中，使混　合孢子悬液最终孢子含量为１０　～１０　￣＇／ｍＬ。用２０　ｍＬ针头缓慢均匀注射混合孢子悬液到质量浓度　２０　Ｌ的ＣａＣ１：中，形成凝胶颗粒小球。硬化１６　ｈ以上，用无菌水洗涤２～３次，即制得固定化小球。　１．３产酶培养　在２５０　ｍＬ三角瓶中装４５　ｍＬ产酶培养基，放入９０～１００个固定化小球进行摇床培养，前３６　ｈ摇床　转速为１２０　ｒ／ｒａｉｎ，３６　ｈ后进入产酶期转速保持为１００　ｒ／ｍｉｎ，温度保持在２８—３Ｏ℃。　１．４　固定化小球稳定性的研究　１…４　１　海藻酸钠质量浓度的影响　分别配制质量浓度３０、４０和５０　Ｌ的海藻酸钠作为黄绿木霉孢子　的包埋载体，制成固定化小球进行产酶摇床培养，比较其稳定性。　１．４．２培养基碳源的影响选用稻草、结晶纤维素、滤纸浆３种纤维质原料作碳源，利用产酶培养基摇　床培养固定化的黄绿木霉孢子，比较其稳定性。　１．４．３培养基ｐＨ值的影响选初始ｐＨ值３．８、４．５和５．４的培养基进行摇床培养，比较其稳定性。　１．５羧甲基纤维素（ＣＭＣ）酶酶活的测定　ＣＭＣ酶酶活定义：以ＣＭＣ－Ｎａ为底物，在反应条件下（５０℃水浴加热３０　ａｒｉｎ），以水解反应中每　３０　ａｒｉｎ产生１　ｍｇ葡萄糖的酶液的量为一个单位（Ｕ）。ＣＭＣ酶酶活力测定方法如下：在产酶培养的三角　瓶中过滤出１　ｍＬ溶液，与４　ｍＬ蒸馏水混合均匀，作为粗酶液待测，取上述粗酶液１　ｍＬ和加入底物１％　的ＣＭＣ－Ｎａ溶液１　ｍＬ。５０　ｏＣ恒温水浴３０　ａｒｉｎ后，加入２　ｍＬ　ＤＮＳ终止反应。煮沸５　ａｒｉｎ显色后，流水快　速冷却至室温，用紫外分光光度计在５４０　ｎｍ下比色，测其０．Ｄ．值。　１．６酶组分　１．６．１　酶的分离纯化将固定化后得到的粗酶液经（ＮＨ　）：ｓ０　沉淀、葡聚糖凝胶Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一１００分　子筛层析上　和葡聚糖凝胶ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ一５０离子交换层析　］，得到纯化后的酶蛋白。粗酶液分　离纯化得到ＥＧ　Ｉ、ＥＧⅡ、ＥＧｍ、ＢＧ　Ｉ和ＢＧⅡ。　１．６．２酶的组成ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和ＩＥＦ电泳分析具体操作步骤参照Ｂｉｏ—Ｒａｄ蛋白质组双向电泳实　验操作手册，所用试剂均购自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳选用分离胶质量分数为１２％，浓缩胶质　量分数为６％　２结果与讨论　２．１　固定化小球稳定性　２－１．１　海藻酸钠质量浓度与培养基碳源对小球稳定性的影响通过对小球结构变化的考察发现：随着　海藻酸钠质量浓度的升高小球稳定性增强，５０　ｇ／Ｌ的小球摇床培养８　ｄ仍然完整并可保持１２　ｄ以上。　维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　孙冬梅，等：黄绿木霉固定化生产纤维素酶及酶学特性的研究　８１　但海藻酸钠质量浓度过高，会使小球硬度过强，不利于菌丝生长，因而以５０　Ｌ为宜。稻草、结晶纤维　素和滤纸浆３种纤维质原料作碳源，摇床培养１２　ｄ，３种原料显示出明显的差异：稻草对小球破坏严重，　结晶纤维素次之，滤纸浆组小球则保持完好。　２．１．２培养基初始ｐＨ值对小球稳定性的影响ｐＨ值对小球稳定性有明显影响，ｐＨ值低的培养基小　球稳定性较好，根据黄绿木霉生长对ｐＨ值的要求，培养基初始ｐＨ值控制在４．０—４．５较为适宜。　２．２　固定化对产酶的影响　２．２．１　小球硬化液ＣａＣ１　质量浓度对产酶的影响将海藻酸钠处理的孢悬液滴入ＣａＣ１　溶液中，可形　成海藻酸钙凝胶小球颗粒，达到硬化的目的。分别选质量浓度１５、２０和２５　Ｌ的ＣａＣ１　溶液处理海藻　酸钠孢悬液，然后进行产酶摇床培养，测定其产酶规律。检验的结果说明，３种不同质量浓度ＣａＣ１　处理　过的固定化小球产酶活力差异极其显著，ＣａＣ１　质量浓度越高，小球稳定性越好，但过度硬化会造成凝　胶颗粒内物质传递的困难，不利于产酶。因而选择适宜的ＣａＣ１：质量浓度，既可保证固定化小球达到一　定的强度又有利于产酶。尤其是前８　ｄ使用２０　Ｌ　ＣａＣ１　处理过的固定化小球产ＣＭＣ酶酶活比其他两　个都要高。８　ｄ以后都有不同程度的下降。但是２０　Ｌ　ＣａＣ１　处理过的小球仍然保持较好（见表１）。　２．２．２培养液初始ｐＨ值对产酶的影响　分别在初始ｐＨ值为３．８、４．５和５．４的摇瓶培养液中进行产　酶培养。结果发现，ｐＨ值３．８的培养基产ＣＭＣ—Ｎａ酶效果不是很好，第６天以后开始下降；ｐＨ值４．５　的培养基产ＣＭＣ—Ｎａ酶效果最好，在第８天左右达到高峰。但是下降得比较快，到１０　ｄ以后３种ｐＨ值　的培养基产ＣＭＣ酶速度下降基本一致。综合考虑，培养液初始ｐＨ值以４．５为宜（见表１）　２．２．３表面活性剂对产酶的影响表面活性剂能提高细胞的通透性，有利于纤维素酶排出。Ｔｗｉｎ一８０　是常用的一种表面活性剂，有资料曾经报道Ｔｗｉｎ一８０能显著提高其他木霉纤维素酶活力。用加体积分　数０．１％Ｔｗｉｎ－８０和不加Ｔｗｉｎ－８０的培养液进行产酶培养，测定黄绿木霉产酶规律。结果证实，在固定　化培养液中加入Ｔｗｉｎ一８０可使ＣＭＣ酶酶活提高１７％左右，且保持的时间比较长（见表１）。　表１　固定化条件对产酶活性的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｌｅｅｔ　ｏｆ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　２、２、４　固定化细胞与游离细胞产酶的比较２．３纤维素酶系的分离纯化　固定化细胞产ＣＭＣ酶酶活明显高于游离细胞产ＣＭＣ酶　酶活，酶活产率提高了１７７．６％之多（见图１）。　２　３．１　酶的分离纯化在分子筛层析过程中出现了５个蛋白峰，其中峰Ⅱ检测到Ｊ８一葡萄糖苷酶活，峰　Ⅳ和峰Ｖ检测到了内切酶活，将内切酶活力部分和Ｊ８一葡萄糖苷酶分别收集合并浓缩，各自经过离子交　换层析后，共得到了５个纤维素酶组分，即ＥＧ　Ｉ、ＥＧＩＩ和ＥＧｍ以及ＢＧ　Ｉ、ＢＧＩＩ。　２．３．２酶的相对分子质量（Ｍ　）和等电点的测定纤维素酶各组分的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱对以上分离　纯化的内切酶各组分样品进行电泳分别表明，在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ胶上形成单一蛋白条带，说明各组分已达　电泳纯。经与标准蛋白的比较和计算，各组分的Ｍ　和等电点见表２。　维普资讯 http://www.cqvip.com

８２　林产化学与工业　第２６卷　１．２　表２纤维素酶系各组分的　和等电点　０．８　Ｔａｂｌｅ　２　Ｍｒ　ａｎｄ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　避　游０．４　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　Ｕ　Ｕ　０　６　８　１０　１２　培养时间／ｄ　一０一固定化细胞ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ；　ｏ　游离细胞ｎｏｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　图１　固定化细胞与游离细胞产酶的比较　Ｆ　１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｅＵｓ　３结论　３．１通过改变海藻酸钠溶液的质量浓度，培养基碳源和培养基初始ｐＨ值这３个条件发现，固定化小　球确实能够满足进行发酵培养的要求，并探索出了适宜的产酶培养条件：以滤纸浆作为培养基碳源，海　藻酸钠质量浓度５Ｏ　Ｌ、ＣａＣ１　质量浓度２Ｏ　ｇ／Ｌ、培养基初始ｐＨ值４．０～４．５。　３．２通过与没有进行固定化的游离细胞产酶进行对比，研究了固定化细胞是否有效提高了产酶活力。　探讨了小球硬化液ＣａＣ１　质量浓度、培养基初始ｐＨ值、表面活性剂Ｔｗｉｎ一８Ｏ对产酶的影响。结果显示，　固定化细胞产酶能力强于游离细胞，如果在固定化的同时添加Ｔｗｉｎ一８Ｏ等表面活性物质，更有利于提高　纤维素的产酶活力。　３．３通过分离纯化得到该菌株纤维素酶的不同组分获得了该酶的相对分子质量（　）与等电点，这将　为后续研究提供理论基础。　参考文献　［１］刘家建，陆怡．纤维素酶的研究及虚用综述［Ｊ］．林产化工通讯。１９９５，２９（１）：６－１０．　［２］王建平．纤维素酶的研究进展及趋向［Ｊ］．舟山师专学报：自然科学版，１９９５（３）：４２—４７．　［３］宋波，邓晓皋．纤维索酶的研究进展［Ｊ］．上海环境科学，２００３，２２（７）：４９１—４９４．　［４］杨斌＋半纤维素酶的细胞固定化研究［Ｊ］．纤维素科学与技术，１９９５，３（１）：４２—４５．　［５］张应玖．果胶酶的固定化研究［Ｊ］．生物技术，１９９６，６（２）：２６—２９．　［６］ＧＨＯＳＥ　Ｔ　Ｋ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｅｌｌｕｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐｌ　Ｃｈｅｍ，１９８７，５９（２）：２５７－２６８　［７］张龙翔．生化实验方法和技术［Ｍ］．２版．北京：高等教育出版社，１９９７：２－３．