・５８４： 第２８卷第６期 实 验 与 检 验 医 学 Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．６ ２０１０年ｌ２月 ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＡＮＤ ＬＡＢ０ＲＡＴ０ＲＹ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｄｅｃ．２ＯｌＯ ・实验研究・ 慢性乙型肝炎患者外周血Ｔ，Ｂ淋巴细胞变化与其ＨＢＶ—ＤＮＡ 的水平相关性探讨 郑源海，周艳贞，林元峰，周艺华 （福建医科大学附属漳州市医院检验科，福建漳州３６３０００） 摘要：目的观察慢性乙肝病毒（ＨＢＶ）感染者免疫功能的变化．探讨病毒复制程度与免疫功能的关系。方法应用流式细胞仪 检测９１例慢性乙肝病毒感染者，３１例正常对照外周血Ｔ淋巴细胞亚群及Ｂ淋巴细胞百分率；用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱ— ＰＣＲ】检测ＨＢＶ感染者ＨＢＶ—ＤＮＡ病毒拷贝数，根据ＨＢＶ感染者血清中ＨＢＶ—ＤＮＡ病毒拷贝数，将它们分为ＤＮＡ阴性组ｆ＜ １０３ＩＵ／ｍ１）、低拷贝组（１０３—１０５ＩＵ／ｍ０、高拷贝组（＞１０ｑＵ／ｍ１）。结果低拷贝组、高拷贝组的ＣＤ３＋、ＣＤ３￣ＣＤ４＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＊比值比对照 组明显减低；ＤＮＡ阴性组、低拷贝组、高拷贝组的ＣＤ１９＋比对照组明显增高；低拷贝组、高拷贝组的ＣＤ３＋ＣＤ４＋、ＣＤ４￣／ＣＤ８＋比值比 ＤＮＡ阴性组明显减低。而ＣＤ３ ＣＤ８ 、ＣＤ３ 、ＣＤ１９ 在低、高拷贝组及ＤＮＡ阴性组之间没有明显差异存在 ０．０５）。结论ＨＢＶ 感染可导致感染者免疫功能的改变，随着ＨＢＶ—ＤＮＡ复制增加．慢性ＨＢＶ感染者淋巴细胞免疫功能紊乱加重。 关键词：慢性乙肝病毒感染者；Ｔ淋巴细胞亚群；Ｂ淋巴细胞；ＨＢＶ—ＤＮＡ 中图分类号Ｒ５１２．６ 文献标识码Ａ 文章编号１６７４一ｌ １２９（２０１０）０６—０５８４—０２ ｄｏｉ：１０．３９６９１｜．ｉ￣ｍ１６７４—１ １２９．２０１０．０６．０２１ 乙型肝炎病毒ｆＨＢＶ１是一种非细胞毒性病毒， 定量ＰＣＲ试剂盒为厦门安普利生物工程有限公司 其所致的肝细胞损坏是由机体针对ＨＢＶ特异性抗 生产．ＰＣＲ扩增仪为Ａｍｐｌｌｙ公司的ＧｅｎｅＬｉｇｈ０８００ 原的免疫反应所引起．ＨＢＶ感染所致的不同临床结 荧光定量核酸扩增仪。 果与机体不同的免疫状态密切相关［１ １机体免疫功 ｌ３标本收集抽取静脉血６ｍ１分三管。一管用 能及病毒逃逸免疫的能力决定了ＨＢＶ感染发生．发 ＥＤＴＡ—Ｋ 抗凝，用于流式细胞术检测；另两管为分 展和转归阁 本文采用直接免疫荧光法通过流式细 离胶管．分离血清后用于ＨＢＶ及ＨＢＶ—ＤＮＡ病毒 胞仪检测ＨＢＶ感染者外周血Ｔ淋巴细胞亚群 检测 （ＣＤ３ 、ＣＤ３￣ＣＤ４＋．ＣＤ３＋ＣＤ８￣）、Ｂ淋巴细胞ｆＣＤＩ９＋）及 １．４检测方法采用ＩＭＭＵＮＯ—ＴＲＯ ｅｌｌｓ标准 采用ＦＱ—ＰＣＲ检测血清中ＨＢＶ—ＤＮＡ载量水平，来 品进行校正。各取ｌＯ０１ｘｌ抗凝血于流式专用试管中， 评价ＨＢＶ感染后血清ＨＢＶ—ＤＮＡ水平与机体免疫 分另０力Ⅱ人２０１ｘｌ ＣＤ１９一ＰＥ、ＣＤ４一ＦＩＴＣ／ＣＤ８一ＰＥ／ 功能变化的关系 ＣＤ３一ＰＣ５荧光标记抗体．室温闭光反应２０ｍｉｎ。加入 １材料与方法 ５００１ｘｌ红细胞裂解液．溶解红细胞１５ｍｉｎ，加入 １．１研究对象９１例慢性乙肝病毒（ＨＢＶ）感染者． ５００￣１鞘液混匀，１０００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，再 男６４例，女２７例，年龄１７ ７５岁．平均年龄３６．９ 加入５００ｐ．１鞘液．混匀后上机检测并记录荧光抗体 岁．符合２０００第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会 染色阳性ＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋及ＣＤ１９￣百分 议修订的病毒性肝炎诊断标准 正常对照组３１例． 率。ＨＢＶ—ＤＮＡ定量分析采用荧光定量ＰＣＲ法，严 其中男２１例．女１０例，年龄２２～７０岁 平均年龄 格按照试剂说明书步骤进行．ＨＢＶ—ＤＮＡ检测单位 ３５．７岁．均为我院体检中心体检合格的健康人 ＩＵ／ｍｌ表示。 ‘１．２仪器和试剂ＩＭＭＵＮＯ—ＴＲＯＬ Ｃｅｌｌｓ标准品、 １．５统计学分析采用ｔ检验．应用ＳＰＳＳ１３．０数 ＣＤ１９一ＰＥ、ＣＤ４一ＦＩＴＣ／ＣＤ８一ＰＥ／ＣＤ３一ＰＣ５荧光标记 据统计软件分析实验结果，Ｐ＜Ｏ．０５为明显差异．Ｐ＜ 抗体及红细胞裂解液ｆＯｐｔｉ Ｌｙｓｅ＠Ｃ１购自法国Ｉｍ— ０．０１为显著差异 ｍｕｎｏｔｅｃｈ公司．流式细胞仪为Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ公 ２结果见表ｌ 司生产的ＥｐｉＣＳ—ＸＬ型流式细胞仪．ＨＢＶ核酸荧光 ３讨论 ＣＤ３分子构成ＴＣＲ／ＣＤ３复合体为Ｔ细胞的特 作者简介：郑源海，男，１９７４年出生，主管检验师，主要从事细 异性表面分子 根据Ｔ细胞表面表达ＣＤ４ Ｄ８＋分 胞形态学及流式细胞术检验。 ・５８５・ 第２８卷第６期 实 验 与 检 验 医 学 Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．６ ２０１０年１２月 ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＡＮＤ Ｉ ＡＢ０ＲＡＴ０ＲＹ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｄｅｃ．２０１０ 注：与正常对照组对比 为Ｐ＜Ｏ．０５， 为Ｐ＜０．Ｏｌ；与ＤＮＡ 降组对比 为Ｐ＜０．０５． 为Ｐ＜Ｏ．Ｏ１。 子，又分为Ｔ辅助／诱导细胞亚群（ＣＤ３＊ＣＤ４＋）￣Ｔ抑 的主要体液免疫细胞．其细胞表面标志已被人们所 制细胞亚群（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）。ＴＨ细胞可产生多种淋巴因 认识．ＣＤ１９＋细胞代表Ｂ淋巴细胞水平。乙型肝炎病 子。在体液免疫和细胞免疫的调节中起关键作用．在 毒并不直接引起肝细胞的损伤．而是由于感染乙型 病毒的免疫应答中发挥中心作用：同时．对病毒清除 肝炎病毒后引起人体细胞免疫和体液免疫应答造成 起重要作用［３１ ＣＤ８ＣＦ细胞激活和抑制严格依赖 的 本研究发现．慢性乙肝病毒（ＨＢＶ）感染者的各组 Ｃ０４￣ＦＨ细胞，正常情况下．两者保持一定的比例． ＣＤ１９＋明显高于正常对照组ｆＰ＜０．０５）。说明体液免疫 维持机体的细胞免疫功能 ＴＣＲ／ＣＤ３复合体是ＣＤ３＋ 在慢性肝炎的病程中起到关键作用．Ｂ淋巴细胞产 Ｔ细胞与Ｔ细胞抗原受体的独特结构ｆＴＩ１结合形成 生的抗体能对血液中的乙型肝炎病毒进行反应加以 的。传递信息。所以Ｔ淋巴细胞状态直接反映细胞 杀灭 免疫状况。本文结果表明ＤＮＡ低拷贝组、高拷贝组 综上所述．通过对ＨＢＶ感染者外周血Ｔ淋巴 的ＣＤ３ 细胞百分率及ＣＤ３＋ＣＤ４￣Ｆ与对照组、ＤＮＡ 细胞亚群及Ｂ淋巴细胞检测，可及时提示ＨＢＶ感 阴性组比较明显减低，表明感染者特异性Ｔ细胞作 染者免疫功能的变化并加强临床监测。 用有所加强．而Ｔ辅助／诱导细胞亚群（ＣＤ３ ＣＤ４ １细 参考文献 胞生成减少，使特异性抗体产生不足．不能清除游离 ｆｌ】ｖａｎ Ｈｅｃｋｅ Ｅ，Ｐａｒａｄｅｓ Ｊ，Ｍｏｌｉｔｏｒ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ 的乙肝病毒。可造成病毒在体内持续存在 ＣＤ４＊／ ｅｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ＣＤ８ 比值可监测人体细胞免疫功能．反映机体免疫 ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｒｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，１９９４，２０（４）：５１４－５２３． ［２］Ｍｉｎｉ ＭＫ，Ｂｏｎｉ Ｃ，Ｌｅｅ ＣＫ，ｅｔ ａ１．１ｒｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ 状态的重要指标．比值失衡可能造成免疫紊乱和～ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｕｒｉｎｇ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ 系列免疫病理改变。本实验结果表明．与正常对照 ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ１．Ｊ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０００，１９１（８）：１２６９一 组、ＤＮＡ阴性组比较，低拷贝组、高拷贝组ＣＤ４＋／ ｌ２８０． ＣＤ８＋比值显著差异ｆＰ＜０．０１ １．与相关报道一致 。动 『３李鸿宾．江晓萍．黄浏培．等．测定慢性乙型肝炎患者外周血Ｔ淋巴 态观察该比值的变化趋势可以反映ＨＢＶ—ＤＮＡ体 细胞亚群的临床意义ｌ Ｊ１．安徽医药，２００６，１０（８）：５８８—５８９． 『４１丁兆明．乙肝相关疾病ＨＢＶ—ＤＮＡ含量与细胞免疫功能相关性研 内复制情况 究『Ｊ］．医学检验与临床，２００８，１９（３）：２８—２９． 人体体液免疫是机体免疫应答的重要组成成分 ｆ５１刘明肮龋 陆颖，等．慢性乙型肝炎病毒感染者外周血Ｔ细胞 之一．在人体特异免疫功能中起着重要的作用．是致 亚群化与其衄清ＨＢ—ＤＮＡ的水平分析『Ｊ１ｌ中国实验诊断学，２００８， 敏Ｂ淋巴细胞受抗原刺激后．即转化为浆细胞并产 １ ２（２）：２３２－２３５． 生能与相应抗原结合的抗体［６１ Ｂ淋巴细胞作为人体 ［６］杨绍基．传染病学【Ｍ］．第７版，北京：人民出版社，１９９９：５． （上接第６２０页）抽查的结果来看，总体合格率为８９．５８％，反 护消费者知情权．呼吁国家有关主管部门应加大国家标准宣 映了六个城市流通领域食品使用添加剂的状况良好．但是个 传贯彻力度．加强监督和检查．更好地维护广大消费者的权 别生产厂家还在使用食品添加剂．今后我们应该加强监督管 益．推动我国食品行业的健康发展。 理。 参考文献 我国对于食品添加剂的使用范围．使用限量及如何标注 『１１周彤，戈早川．多波长线性回归导数分光光度法同时测定饮料中 等都在相关标准中作出了规定．但从 业得到的反馈情况 糖精钠和苯甲酸［Ｊ］＿分析试验室，１９９９，１８（３）：８７－８８． 看．企业对食品添加剂的适用范围使用限量理解比较透彻． ［２］倪东．冷冻饮品中糖精钠测定之我９Ｅ［Ｊ］．林区教学，２００６，２２（３）： 而且对标签标注问题．认为只要不超过限量值．标注与否并 ９０—９１． 不重要．还有些企业对标签标准理解不透彻，认为是只要不 【３］邹昱．四阶导数分光光度法测定果冻中的糖精钠［ＪＪ．中国热带医 是企业作为配料主要添加的添加剂．可不标注．因此．中消协 学．２００７．７（８）：１４３１—１４３２． 呼吁企业按标准逐步规范产品的标签标注．诚信生产经营维 【４］ＧＢ２７６０—２００７．食品添加剂标准［Ｓ］．２００７：７１． ｆ５］ＧＢ／Ｔ５００９．２８．食品卫生检验方法［Ｓ］．理化部分㈠．２００３：２２５－２２６．